兔軟骨細胞的分離

1、 最新資料推薦兔軟骨細胞的分離兔軟骨細胞的分離目的 探討兔軟骨細胞培養(yǎng)方法。方法 采用膠原酶分段消化法從4 周齡新西蘭兔的關(guān)節(jié)軟骨中分離出軟骨細胞并進行原代和傳代培養(yǎng)。每日在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及其生長情況。并用甲苯胺藍異染色進行細胞表型鑒定。結(jié)果 軟骨細胞形成單層的時間原代培養(yǎng)1 周左右 , 傳代培養(yǎng)約 45 天 , 細胞以圓形或上皮樣細胞形態(tài)為主。甲苯胺藍染色證實細胞可合成蛋白多糖, 異染反應(yīng)主要集中在細胞集落樣生長區(qū), 異染程度以原代培養(yǎng)最為顯著。結(jié)論 采用本方法培養(yǎng)兔軟骨細胞是可行的。軟骨細胞是關(guān)節(jié)軟骨破壞過程中的靶細胞, 研究靶細胞的變化是探索關(guān)節(jié)軟骨破壞、病理和治療的重要方法,

2、 本實驗的目的是建立體外軟骨細胞培養(yǎng)體系, 為進一步實驗創(chuàng)造條件。1 材料與方法13 動物 : 4 周齡健康新西蘭兔。14 軟骨細胞的分離和培養(yǎng)141 軟骨細胞的分離步驟: I)一只健康4 周齡新西蘭兔脫頸處死, 備皮 , 用碘酊酒精背部皮膚消毒無菌操作沿背部中線剪開并剝離皮膚, 更換手術(shù)器械及手套, 以防碘酊等有機物污染。(30min) II)游離并用骨剪截取膝關(guān)節(jié), 置入無菌平皿, 帶入超凈工作臺III) 在超凈工作臺作如下操作:1) 先用雙抗的pbs 充分漂洗, 直到?jīng)]有碘伏的顏色(5min), 離斷髕韌帶 , 內(nèi)外側(cè)副韌帶以及前后交叉韌帶 , 切開膝關(guān)節(jié), 刮除關(guān)節(jié)周圍附著的組織如肌肉

3、、脂肪、 骨膜、滑膜 , pbs 液充分漂洗。2) 用尖刀片充分利用軟骨的彈性, 削下每個關(guān)節(jié)表面的軟骨 , 不要誤帶軟骨下骨和骨膜, 一般以不滲血為度。3) 充分漂洗軟骨小塊, 更換洗液3 次 4) 用眼科小剪刀剪碎至1 mm3 大小 , 用小刮匙把軟骨小塊轉(zhuǎn)移至小錐形瓶中。5) 加入02%型膠原酶5 ml, 置磁力攪拌器上37消化45 min, 將游離出的帶有酶溶液的軟骨細胞用懸液吸管吸出,120 目尼龍網(wǎng)篩過濾。6) 所得濾液放入一無菌離心管內(nèi), 1200 r/min 離心 8 min,棄上清 , 加入 5 ml 含有血清的DMEM培養(yǎng)液混勻以終止消化。7) 1200 r/min 離心

4、5 min, 棄去上清液, 只留下細胞球, 并加入少量含有血清的培養(yǎng)液吸打后先封口置放。8) 原消化瓶中再加入02%型膠原酶5 ml, 如前法消化45 min, 消化后的處理同上。9) 然后把 2 次消化所得的軟骨細胞懸液合并在一起, 臺盼藍染色檢查死亡細胞比例, 血球計數(shù)板計數(shù), 并把細胞懸液稀釋成 (23)105 細胞 /ml, 接種于培養(yǎng)瓶中。142 原代培養(yǎng) : I) 將消化所得的細胞懸液以(23)105 細胞 /ml 接種于 25 cm2 培養(yǎng)瓶中 , 共 接種 3 瓶 , 每瓶加 5 ml 的細胞懸液。II) 把培養(yǎng)瓶置于CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(溫度37 , 飽和濕度 , 5%CO2

5、, 95%空氣)。III) 48 h 后視細胞貼壁情況更換培養(yǎng)液, 以后每兩天更換培養(yǎng)液 1 次。143 傳代培養(yǎng): I) 當(dāng)?shù)怪蔑@微鏡觀察軟骨細胞匯合成片,長滿大部分培養(yǎng)瓶壁后, 傾去培養(yǎng)液, 加入025%胰蛋白酶2 ml,室溫下靜置510 min, II) 在倒置顯微鏡下若觀察到細胞重新變成圓形 , 個別細胞開始浮游, 此時應(yīng)迅速而輕柔地棄去胰蛋白酶溶液而不使瓶底細胞隨胰蛋白酶溶液流失。III) 重新加入新培養(yǎng)液, 吹打細胞使其散開形成軟骨細胞懸液,按前述方法分瓶培養(yǎng)或凍存以備用。144 軟骨細胞的組織化學(xué)染色鑒定: I) 傾去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液后用生理鹽水漂洗, 置入10%中性福爾馬林中固

6、定過夜。II) 70% 乙醇固定20 min 以除去四價銨離子, 以免阻礙染色。用 004%甲苯胺藍染色 20 min, 迅速用無水乙醇漂洗1 次 ,空氣干燥 , 倒置顯微鏡下觀察攝影。2 結(jié) 果 21 倒置顯微鏡觀察: I) 分離培養(yǎng)的原代軟骨細胞呈圓球形, 臺盼藍排斥試驗示活細胞率約90%左右。II) 懸浮 12 h 逐漸開始貼壁, 24 h 后大部分貼壁, 首先細胞伸出短小的生長突, 呈扇形 ; 扇形生長突不斷擴大, 細胞的兩側(cè)或三邊都可伸出生長突。III) 此時細胞在倒置顯微鏡下呈片狀貼附, 形態(tài)呈梭形、或三角形、 或多角形 , 胞漿內(nèi)可見折光的顆粒, 周圍有細長的突起,胞核明顯呈圓形

7、或橢圓形, 核仁清晰 , 原代培養(yǎng)的軟骨細胞7 天即可長滿瓶壁 , 部分區(qū)域呈多層生長。IV) 在集落生長區(qū)和多層生長區(qū)細胞被分泌的基質(zhì)所包埋, 形成肉眼可見的結(jié)節(jié)樣組織。V) 傳代培養(yǎng)的軟骨細胞一般24 h 即可完全貼壁, 細胞伸出偽足 , 充分鋪展。VI) 傳一代的軟骨細胞5 天左右即可形成單層, 細胞仍以圓類、類上皮細胞樣外觀為主。VII) 隨著傳代次數(shù)的增加, 細胞中梭形細胞增多, 分泌和增殖能力下降, 傳代周期延長。22 甲苯胺藍染色形態(tài)學(xué)觀察: I) 原代培養(yǎng)的軟骨細胞培養(yǎng) 7 天后染色見: 單層生長區(qū)和多層生長區(qū)域細胞正染成淺藍色 , 有 23 個核仁 , 核仁呈紫藍色。集落樣生

8、長區(qū)和多層生長區(qū)的中心部分細胞及細胞外基質(zhì)異染成紫紅色 , 細胞核正染成深藍色, 而其邊緣部位異染不及中心區(qū)域。II)細胞經(jīng)多次傳代后主要以單層生長方式為主, 甲苯胺藍5 / 8最新資料推薦染色以正染淺藍色為主。許多細胞呈核負染, 表明軟骨細胞分泌的蛋白多糖等細胞外基質(zhì)與細胞傳代次數(shù)有關(guān)。3. 注意事項i. 軟骨細胞是關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)的唯一細胞成分 , 只要很好地進行機械解離和化學(xué)解離 , 注意原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)的方法, 就能很好地進行軟骨細胞的分離和培養(yǎng)。ii. 機械解離非常重要, 往往決定實驗是否成功, 解離時不要誤帶軟骨以外的組織 , 盡可能把軟骨切碎至小于1mm3 大小。iii. 化學(xué)解離主

9、要是用酶法解離, 注意消化時間, 時間太短軟骨細胞不能充分游離, 影響軟骨細胞的收獲量; 時間太長死亡的軟骨細胞數(shù)就會增多, 同樣影響軟骨細胞的收獲量, 不利于培養(yǎng)。iv. 換培養(yǎng)液時間一般來講, 生長良好的細胞約兩天左右應(yīng)更換一次培養(yǎng)液 , 要特別注意培養(yǎng)液的pH 值變化 , pH 值低于64 時軟骨細胞會發(fā)生死亡。v. 常規(guī)的培養(yǎng)方法操作步驟較多, 且需要多種酶消化, 增加了細胞污染的可能性 4-6 。我們的方法是單用型膠原酶分階段進行消化, 每次消化45 min,收集一次細胞, 并盡快加含有血清的培養(yǎng)液來終止消化, 并加血清培養(yǎng)液保護。經(jīng)過二次45 min 消化基本上可完全收獲細胞。vi

10、. vii. viii. ix. x.然后把二次消化的細胞集中在一起計數(shù), 分瓶培養(yǎng)。因為膠原酶接觸時間過長對軟骨細胞有毒性作用, 所以不能一次消化 23 h 或 57 h 才收獲細胞。和大多數(shù)軟骨細胞一樣, 兔軟骨細胞最適pH 值為 74, 所以要經(jīng)常檢查培養(yǎng)液的pH 值 , 如培養(yǎng)液變黃要及時換培養(yǎng)液。培養(yǎng)液放置于冰箱中保存后常偏堿性, 要用鹽酸及時調(diào)整。在軟骨細胞培養(yǎng)的過程中始終要防止污染, 注意無菌操作。軟骨細胞在體外培養(yǎng)過程中有兩種轉(zhuǎn)歸: 一是繼續(xù)維持表型, 具有分泌型膠原纖維和硫酸軟骨素蛋白(CSPG)的能力; 二是發(fā)生反分化 , 細胞不僅形態(tài)發(fā)生改變, 而且所分泌的膠原纖維不再是

11、型而成為型 , CSPG 的合成能力也隨之喪失7 。我們根據(jù)軟骨細胞的表型鑒定, 認為三代以內(nèi)的軟骨細胞活性較高 , 保持軟骨細胞的表型, 是實驗研究的理想細胞。三代以后的軟骨細胞逐漸發(fā)生反分化, 細胞體積增大, 出現(xiàn)許多指狀突起, 胞核增大, 細胞增殖速度明顯減慢, 可作為軟骨細胞退行變的研究模型。所以研究藥物的最佳反應(yīng)和組織工程軟骨最好選用三代以內(nèi)的軟骨細胞。一、臺盼藍染色：如果細胞膜不完整、破裂，臺盼藍染料進入細胞，細胞變藍，即為壞死。如果細胞膜完整，細胞不為臺盼藍染色，則為正常細胞或凋亡細此方法對反映細胞膜的完整性，區(qū)別壞死細胞有一定的幫助。用品：1. 4% 臺盼藍母液：稱取 4g 臺盼藍，加少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100ml，用濾紙過濾， 4 度保存。使用時。用 PBS 稀釋至0.4%。2. 吸管、血細胞計數(shù)板、顯微鏡步驟：1 、制備單細胞懸液。并作適當(dāng)稀釋（10 *6 細胞 /ml ）2 、染色：取 9mL 細胞懸液移入試管中，加1mL0.4%臺盼藍溶液，混勻。3 、觀察注意事項：臺盼藍染細胞時，時間不宜過長。否則，部分活細胞