慢病毒相關(guān)技術(shù)介紹ppt課件

1、2/14/2022 寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司限公司Clontech慢病毒相關(guān)技術(shù)介紹2/14/20222背景簡介背景簡介 病毒載體病毒載體基因傳遞基因傳遞 慢病毒載體慢病毒載體容易容易轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染物理方法物理方法非病毒載體非病毒載體Clontech 慢病毒相關(guān)產(chǎn)品可以轉(zhuǎn)染非分裂細(xì)胞胞實(shí)現(xiàn)持久有效表達(dá) 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 腺病毒載體腺病毒載體 2/14/20223內(nèi)容介紹內(nèi)容介紹1 提高慢病毒滴度的策略提高慢病毒滴度的策略2提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的方法提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的方法3 Lenti-X慢病毒包裝系統(tǒng)慢病毒包裝系統(tǒng) 12/14/20224Lenti-X慢病毒包裝系統(tǒng)慢病

2、毒包裝系統(tǒng)2/14/20225背景簡介背景簡介l 病毒包裝流程示意圖病毒包裝流程示意圖2/14/20226第四代包裝系統(tǒng)第四代包裝系統(tǒng)Lenti-X HTXLenti-X HTX 將將Gag-Pro和和RT-IN分離，降低產(chǎn)生具有復(fù)制分離，降低產(chǎn)生具有復(fù)制 能力病毒的幾率，大大提高生物安全性。能力病毒的幾率，大大提高生物安全性。創(chuàng)新點(diǎn)創(chuàng)新點(diǎn)I2/14/20227第四代包裝系統(tǒng)第四代包裝系統(tǒng)Lenti-X HTXLenti-X HTX 引入引入Tet-Off誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，大大提高病毒滴度！大大提高病毒滴度！ 創(chuàng)新點(diǎn)創(chuàng)新點(diǎn)II2/14/20228Lenti-X包裝系統(tǒng)包裝系統(tǒng)通過流式

3、細(xì)胞儀測定：通過流式細(xì)胞儀測定： Lenti-X包裝系統(tǒng)獲得的病毒滴度高包裝系統(tǒng)獲得的病毒滴度高 于于108 IFU/ml； 只需只需10 l 病毒上清即可轉(zhuǎn)導(dǎo)大部病毒上清即可轉(zhuǎn)導(dǎo)大部 分分HeLa細(xì)胞。細(xì)胞。Lenti-XLenti-X2/14/20229Clontech慢病毒系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)慢病毒系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)2/14/202210慢病毒載體的種類慢病毒載體的種類cDNA載體載體pLVX-PuroRNAi載體載體pLVX-shRNA1pLVX-shRNA2ProteoTuner載體載體pLVX-PTunerpLVX-Ptuner Green誘導(dǎo)表達(dá)載體誘導(dǎo)表達(dá)載體pLVX-Tet-On Advanc

4、edpLVX-Tet-Off AdvancedpLVX-Tight-Puro2/14/202211慢病毒載體的種類慢病毒載體的種類pLVX-EF1-IRES-PuropLVX-EF1-IRES-ZsGreen1/mCherrypLVX-EF1-AcGFP1-N1 & C1EF1啟動子載體啟動子載體熒光標(biāo)簽載體熒光標(biāo)簽載體pLVX-DsRed-Monomer-C1 & N1pLVX-AcGFP1-N1 & C1雙表達(dá)載體雙表達(dá)載體pLVX-DsRed-Monomer-C1 & N1pLVX-IRES-ZsGreen12/14/202212慢病毒相關(guān)系統(tǒng)慢病毒相關(guān)系

5、統(tǒng)1、慢病毒包裝系統(tǒng)慢病毒包裝系統(tǒng)l 高效，可獲得的病毒滴度高達(dá)高效，可獲得的病毒滴度高達(dá)5 X 108 IFU / mll 具有兩種假型病毒：泛嗜性（具有兩種假型病毒：泛嗜性（VSV-G）和單嗜性（）和單嗜性（ECO）Lenti-X HTX Packaging System (631247/49)Lenti-X HTX Ecotropic Packaging System (631251)2、慢病毒慢病毒cDNA表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)l 高效基因傳遞系統(tǒng)，可用于幾乎所有哺乳動物細(xì)胞高效基因傳遞系統(tǒng)，可用于幾乎所有哺乳動物細(xì)胞Lenti-X Expression System (632164)Len

6、ti-X Bicistronic Expression System (Neo/Hyg/Puro, 632181/2/3)3、慢病毒慢病毒RNAi表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)l 可以獲得高效率的可以獲得高效率的RNAi，可用于幾乎所有哺乳動物細(xì)胞，可用于幾乎所有哺乳動物細(xì)胞Lenti-X shRNA Expression System (632177)2/14/2022134、慢病毒誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)、慢病毒誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)l 可以在幾乎所有哺乳動物細(xì)胞中精確地誘導(dǎo)基因表達(dá)可以在幾乎所有哺乳動物細(xì)胞中精確地誘導(dǎo)基因表達(dá)Lenti-X Tet-On Advanced Inducible Expression Syst

7、em (632162)Lenti-X Tet-Off Advanced Inducible Expression System (632163)5、慢病毒報(bào)告系統(tǒng)慢病毒報(bào)告系統(tǒng)l 利用熒光或化學(xué)發(fā)光檢測法研究啟動子活性利用熒光或化學(xué)發(fā)光檢測法研究啟動子活性l 可用于多種類型細(xì)胞可用于多種類型細(xì)胞Lenti-X DD Cyan/Green/Red Reporter System (631748/51/53)Lenti-X Ready-To-Glow Secreted Luciferase Reporter System (631746)慢病毒相關(guān)系統(tǒng)慢病毒相關(guān)系統(tǒng)2/14/202214提高慢病毒

8、滴度的策略提高慢病毒滴度的策略2/14/202215影響慢病毒滴度的因素影響慢病毒滴度的因素轉(zhuǎn)染效率轉(zhuǎn)染效率l 轉(zhuǎn)染試劑的類型轉(zhuǎn)染試劑的類型l 轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染的DNA量量l 轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染的DNA質(zhì)量質(zhì)量p 細(xì)胞種類細(xì)胞種類p 細(xì)胞密度細(xì)胞密度p 細(xì)胞狀態(tài)細(xì)胞狀態(tài)包裝細(xì)胞包裝細(xì)胞 u 測定滴度時細(xì)胞測定滴度時細(xì)胞 的選擇的選擇u 測定方法的選擇測定方法的選擇測定滴度測定滴度2/14/202216Clontech提高慢病毒滴度的策略提高慢病毒滴度的策略策略策略p 使用的病毒載體中包含改善載體性能和使用的病毒載體中包含改善載體性能和 提高病毒滴度的提高病毒滴度的WPRE、RRE和和 cPPT/CTS序列序

9、列提供多種病毒載體提供多種病毒載體p 包裝組分中含有經(jīng)過比例優(yōu)化的包裝組分中含有經(jīng)過比例優(yōu)化的5種非病種非病 毒載體毒載體引入引入Tet-Off誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)p 配以配以Tet 系統(tǒng)專用的胎牛血清（系統(tǒng)專用的胎牛血清（FBS）p 使用高品質(zhì)的使用高品質(zhì)的293T包裝細(xì)胞系包裝細(xì)胞系 Lenti-X 293T Cell Linep 使用創(chuàng)新型的轉(zhuǎn)染試劑使用創(chuàng)新型的轉(zhuǎn)染試劑Xfect 2/14/202217高品質(zhì)包裝細(xì)胞系高品質(zhì)包裝細(xì)胞系Lenti-X 293TTime of transfectionHarvest Time2/14/202218Lenti-X 293T VS 293FT

10、Clontech的的 293T包裝細(xì)胞獲得的病毒滴度是包裝細(xì)胞獲得的病毒滴度是293FT的的2.6倍倍 ！2/14/202219創(chuàng)新型轉(zhuǎn)染試劑創(chuàng)新型轉(zhuǎn)染試劑Xfect (631317/8)哺乳動物細(xì)胞用創(chuàng)新型轉(zhuǎn)染試劑哺乳動物細(xì)胞用創(chuàng)新型轉(zhuǎn)染試劑Xfectl應(yīng)用的細(xì)胞類型廣泛、轉(zhuǎn)染效率高！應(yīng)用的細(xì)胞類型廣泛、轉(zhuǎn)染效率高！l由可生物降解的、低細(xì)胞毒性的納米顆粒制備而成。由可生物降解的、低細(xì)胞毒性的納米顆粒制備而成。l操作流程簡便、兼容血清。操作流程簡便、兼容血清。2/14/202220創(chuàng)新型轉(zhuǎn)染試劑創(chuàng)新型轉(zhuǎn)染試劑Xfect (631317/8)高效高效的的Xfect低毒性低毒性的的Xfect實(shí)驗(yàn)驗(yàn)

11、證：實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：Xfect轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染293T包裝細(xì)胞的效率高達(dá)包裝細(xì)胞的效率高達(dá)97%！2/14/202221提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的方法提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的方法2/14/202222慢病毒濃縮試劑盒慢病毒濃縮試劑盒Lenti-X Concentrator (Cat No.631231&631232) 操作簡便，無需超速離心操作簡便，無需超速離心 可以純化大體積病毒樣品可以純化大體積病毒樣品 病毒滴度提高病毒滴度提高100倍，回收率高達(dá)倍，回收率高達(dá)90%2/14/202223快速滴度測定快速滴度測定Lenti-X qRT-PCR Titration Kit (Cat No.631235) 基于基于HIV

12、-1的的qRT-PCR法的滴度測定試劑盒法的滴度測定試劑盒 1 1天內(nèi)即可完成收獲病毒、測定滴度和感染靶細(xì)胞天內(nèi)即可完成收獲病毒、測定滴度和感染靶細(xì)胞 可以獲得精確的病毒滴度，為獲得穩(wěn)定的感染效果奠定基可以獲得精確的病毒滴度，為獲得穩(wěn)定的感染效果奠定基礎(chǔ)礎(chǔ)2/14/202224快速滴度測定快速滴度測定LentiTM-X GoStixTM (Cat No.631243,631244&631241)陽性結(jié)果：病毒滴度陽性結(jié)果：病毒滴度5 x 105 IFU/ml 30秒內(nèi)即可定性地判斷病毒滴度秒內(nèi)即可定性地判斷病毒滴度 可以確定收獲病毒的最佳時機(jī)可以確定收獲病毒的最佳時機(jī) 操作簡便操作簡便2/14/202225快速高效轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)產(chǎn)品快速高效轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)產(chǎn)品Lenti-X Accelerator(Cat No.631256,63