合成肽RGD和YIGSR的聚合衍生物對PG細胞侵襲重組基底膜能力的影響

1、合成肽RGD和YIGSR的聚合衍生物對PG細胞侵襲重組基底膜能力的影響        【摘要】     目的 探討RGD和YIGSR的聚合衍生物對PG細胞侵襲重組基底膜能力的影響。方法 利用Transwell細胞培養(yǎng)小室。結果 適量PG細胞經(jīng)趨化劑作用10h，侵襲細胞已達便于統(tǒng)計分析的數(shù)量范圍；25100g/ml的合成肽RGD、YIGSR及多數(shù)衍生物與細胞作用48h可對抗PG細胞對重組基底膜的侵襲。結論 高轉(zhuǎn)移性人肺白細胞癌PG細胞系是腫瘤細胞體外侵襲實驗篩選有關抗

2、腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的適用細胞。其中RGD和YIGSR的雜叉聚合肽及YIGSR均叉聚合肽的抗腫瘤侵襲活性較強。     【關鍵詞】  Arg|Gly|Asp(RGD);Tyr|Ile|Gly|Ser|Arg(YIGSR)；聚合肽；癌侵襲        The invasive capability of human lung great cellular xancerous PG cell    on reformed basement membrane

3、 and Inhibition of synthetic peptides    CAO Kai, ZHAO Tie|hua,CHEN Zhi|yu,et al    Chengde Medical College, Chengde 067000,China    Abstract：Objective   To study the invasive capability of human lung great cellular carcinoma PG cell on reformed

4、 basement membrane in vitro and inhibition of anti|tumor synthetic peptide. Methods Use transwell culture cell. Results  When optimun PG cell was affected for 10h by chemotatic reagent, invasive cell could reach the number range of statistics; 25100 ug/ml RGD、YIGSR and most of the derivative co

5、uld inhibit the invasion of PG cell on reformed basement membrane incubating with cell for 48h. Equal/unequal|forkpeptide of YIGSR with RGD had much activities of anti|tumor invasion.Conclusion  High transferable human lung leucocyte PG celluar sery was the usage one of cancerous cell external

6、invasive experimental scalp about anti|cancer tranferable medicine.    Key words:Arg|Gly|Asp(RGD);Tyr|Ile|Gly|Ser|Arg(YIGSR);Polypeptide ;cancerous invasion    腫瘤的侵襲行為是惡性腫瘤的關鍵特征，是貫穿腫瘤轉(zhuǎn)移全過程的重要步驟。腫瘤轉(zhuǎn)移始于惡性侵襲，此后，腫瘤細胞穿入、穿出血管或淋巴管，侵入靶器官內(nèi)都是侵襲行為的具體表現(xiàn)1。高轉(zhuǎn)移腫瘤細胞與基底膜成分的體外侵襲實驗因此成為篩選腫

7、瘤轉(zhuǎn)移藥物的基本模型2。利用人肺巨細胞癌PG細胞系3，我們探討了高轉(zhuǎn)移腫瘤細胞體外侵襲實驗篩選腫瘤轉(zhuǎn)移活性肽的基本實驗條件，并對合成肽RGD和YIGSR的聚合衍生物的抗腫瘤侵襲活性進行了初步分析。    1  材料和方法    1.1  細胞株    人類高轉(zhuǎn)移性肺巨細胞癌PG細胞株和NIH3T3細胞株由北京醫(yī)科大學病理教研室提供，本室在10%FCS|DMEM培養(yǎng)基中置37、5%CO條件下常規(guī)傳代培養(yǎng)。    1.2  主要試劑和受試藥物

8、0;   Transwell細胞培養(yǎng)小室，Costor產(chǎn)品，3422型，直徑6.5mm,menbrane filte(聚乙烯吡咯烷酮膜)孔徑8m,膜上已鋪Matrigel(人工基底膜膠)；合成肽RGD、YIGSR及其衍生物等由中國醫(yī)科院藥物所合成室和承德醫(yī)學院化學教研室合成提供，編號和結構式分別為：    WF10：RGD；XB46；(RGD)|e;WF20;YIGSR|NH；WF12：RGD|K|OMe;YIGSR    WE27：    NO2(YIGSR)2K|OCH2CONH&

9、#160;   1.3  高轉(zhuǎn)移腫瘤細胞對重組基底膜侵襲能力的測定10%FCS|DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)的NIH3T3細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底后，無血清DMEM沖洗2次，加0.1%BSA|DMEM培養(yǎng)48h,收集離心去除細胞的培養(yǎng)上清為腫瘤細胞趨化因子。將受試合成肽分別以25100g/ml加入10%FCS|DMEM培養(yǎng)基中，與PG細胞在37、5%CO2條件下共育48h。消化并洗滌后，以0.1%BSA|DMEM調(diào)細胞濃度為2×ml,加至Transwell細胞培養(yǎng)小室100g/well,或常規(guī)傳代培養(yǎng)的PG細胞同上條件加入Transwell細胞培養(yǎng)小室，同時加入受試合

10、成肽100l/well，將小室浸于24孔細胞培養(yǎng)板的趨化因子(600l/well)中，37、5%CO2條件下溫育2.520h;溫育結束后濾膜用甲醇固定10min,HE染色，水洗后用棉簽擦去未穿過膜的腫瘤細胞，以Enkitt將膜固封于載玻片上，400倍顯微鏡下計數(shù)上下左右中5個不同視野的侵襲細胞數(shù)，取平均值，計算侵襲抑制率。    侵襲抑制率=|（實驗組侵襲細胞數(shù)/對照組侵襲細胞數(shù)）×。    凡抑制率達30%以上，統(tǒng)計學處理P0.05者，認為有抗侵襲作用。    2  結果 

11、   2.1  不同作用時間PG細胞對重組基底膜的侵襲能力    常規(guī)傳代培養(yǎng)的PG細胞加入Transwell細胞培養(yǎng)小室(2×well)后，在趨化因子作用下，隨作用時間延長，穿過menbrane filte的侵襲細胞數(shù)量增加；其中，侵襲作用時間為10h，侵襲細胞數(shù)已達便于統(tǒng)計分析的數(shù)量范圍(50100個侵襲細胞),見表1。表1  不同作用時間PG細胞對重組基底膜的侵襲能力    2.2  合成肽與PG細胞共育時間對侵襲能力的影響    經(jīng)100

12、g/ml RGD及YIGSR作用48h的適當濃度的PG細胞，加入Transwell細胞培養(yǎng)小室(2×well)后，經(jīng)趨化因子作用10h,侵襲細胞數(shù)分別為29.1±7.9和39.7±9.4，與對照組(侵襲細胞數(shù)為62.8±4.9)比較差異有顯著性(0.05)。100g/ml RGD及YIGSR與常規(guī)傳代培養(yǎng)的PG細胞混合加入Transwell細胞培養(yǎng)小室，侵襲細胞數(shù)與對照組差異無顯著性。實驗結果，見表2。表2 合成肽共育時間對PG細胞侵襲能力的影響    2.3  不同濃度合成肽對PG細胞的侵襲抑制作用 &

13、#160;  與PG細胞共育48h的受試合成肽對PG細胞表現(xiàn)了侵襲抑制作用，并呈一定量效關系；其中，RGD與YIGSR的雜叉肽(WF12)和YIGSR的均叉肽(WE27)作用較顯著，分別在50和25g/ml劑量開始與對照比較差異有顯著性(0.05),100g/ml劑量時與對照比較差異有高度顯著性(0.01)。實驗結果，見表3。    3  討論    侵襲是腫瘤細胞離開原發(fā)生長部位，突破基底膜和細胞外基質(zhì)構成的屏障，侵犯鄰近正常組織的過程。基底膜是機體組織學屏障，腫瘤細胞從原發(fā)部位擴散到遠處器官或組織，首先要降解并

14、穿過基底膜浸潤到周緣組織，并進一步降解血管內(nèi)皮下基底膜進入循環(huán)。在Transwell培養(yǎng)小室的Menbrane filte上，已鋪就從小鼠EHS肉瘤提取的富含層粘連蛋白、型膠原等基底膜成分的人工基底膜膠Matrigel,在培養(yǎng)基中組成了與天然基底膜十分相似的膜結構；具有侵襲能力的高轉(zhuǎn)移腫瘤細胞在趨化劑誘導下穿過濾膜，模擬了腫瘤細胞在機體內(nèi)侵襲基底膜的過程1。    人類高轉(zhuǎn)移腫瘤細胞系人肺巨細胞癌PG細胞，具有裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移率達100%，體外培養(yǎng)條件下細胞運動和分裂活躍，具有增殖快、倍增時間短、分裂指數(shù)高和增殖倍數(shù)大等一系列特點3。我們的有關研究已經(jīng)證實了PG細胞體

15、外粘附實驗在抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物篩選中的意義，本文實驗結果進一步表明，PG細胞對模擬體內(nèi)基底膜和基質(zhì)成分的人工重組基底膜具有較強的侵襲能力，高轉(zhuǎn)移性人肺巨細胞癌PG細胞系是腫瘤細胞體外侵襲實驗篩選有關抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的適用細胞。 表3不同濃度合成肽對PG細胞的侵襲抑制作用    粘附是腫瘤侵襲(和轉(zhuǎn)移)的始動因素。在腫瘤侵襲過程中，腫瘤細胞首先通過膜表面受體粘附于基底膜及細胞外基質(zhì)的成分纖維粘連蛋白(Fibronectin, FN)、層粘連蛋白(Laminin,LN)和型膠原蛋白(Type collagen)上，然后腫瘤細胞以蛋白酶降解基底膜和基質(zhì)，最后定向運動穿越基底膜

16、和基質(zhì)4。目前已經(jīng)明確，以上過程與腫瘤細胞粘附、侵襲相關的主要結構是FN、LN和膠原蛋白等基底膜成分的YIGSR(Tyr|Ile|Gly|Ser|Arg)或RGD(Arg|Gly|Asp)等短肽序列5，6。本文實驗中，YIGSR和RGD肽對PG細胞表現(xiàn)了明顯的侵襲抑制作用，分子量較大、含數(shù)個YIGSR或RGD序列的RGD和YIGSR的雜叉肽和YIGSR的均叉肽增強了以上作用，并呈一定的劑量依賴關系。實驗結果與近年國外類似研究表現(xiàn)了相同趨勢5，6。本文實驗表現(xiàn)的有關合成肽必須與腫瘤細胞作用一定時間后才能發(fā)揮抗腫瘤侵襲作用，提示有關合成肽抗腫瘤轉(zhuǎn)移的體內(nèi)存在時間不能過短，提高合成肽的分子量、延長其

17、體內(nèi)存在時間，是提高抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性肽生物利用度的主要措施之一。     【參考文獻】  1 施波，等.抗癌侵襲、抗癌轉(zhuǎn)移藥物研究現(xiàn)狀A.見：韓銳.抗癌藥物研究與實驗技術M.第1版.北京：北京醫(yī)科大學中國協(xié)和醫(yī)科大學聯(lián)合出版社，1997.163|164，353|355.    2 Albini A, Iwamoto Y, Kleinman HK,et al. A rapid in vitro assay for quantitative the invasive potential of tumo

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