細(xì)菌分類與鑒定(lyw)

1、第七章第七章微生物的分類和鑒定微生物的分類和鑒定 地球上的物種估計(jì)大約有地球上的物種估計(jì)大約有150萬(wàn)，萬(wàn)，其中微生物超過(guò)其中微生物超過(guò)10萬(wàn)種，而且其數(shù)目還萬(wàn)種，而且其數(shù)目還在不斷增加在不斷增加。生物分類的二種基本原則：生物分類的二種基本原則：a）根據(jù)表型）根據(jù)表型(phenetic)特征的相似程度分群歸類，這種特征的相似程度分群歸類，這種 表型分類重在應(yīng)用，不涉及生物進(jìn)化或不以反映生表型分類重在應(yīng)用，不涉及生物進(jìn)化或不以反映生 物親緣關(guān)系為目標(biāo)。物親緣關(guān)系為目標(biāo)。b）按照生物系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)性水平來(lái)分群歸類，其目標(biāo)）按照生物系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)性水平來(lái)分群歸類，其目標(biāo) 是探尋各種生物之間的進(jìn)化關(guān)系，建

2、立反映生物系是探尋各種生物之間的進(jìn)化關(guān)系，建立反映生物系 統(tǒng)發(fā)育的分類系統(tǒng)。統(tǒng)發(fā)育的分類系統(tǒng)。從進(jìn)化論誕生以來(lái)，已經(jīng)成生物學(xué)家普遍接受的分類原則從進(jìn)化論誕生以來(lái)，已經(jīng)成生物學(xué)家普遍接受的分類原則生物系統(tǒng)學(xué)生物系統(tǒng)學(xué)(systematics)(systematics)一、分類單元及其等級(jí)一、分類單元及其等級(jí)界界 （Kingdom） (Regnum)門門 （Phylum） (Phylum)綱綱（Class） (Classis)目目（Order） (Ordo)科科（Family） (Familia)屬屬（Genus） (Genus)種種（Species） (Species)常用的細(xì)菌分類學(xué)術(shù)語(yǔ)常用的

3、細(xì)菌分類學(xué)術(shù)語(yǔ)：1）培養(yǎng)物）培養(yǎng)物(culture)：一定時(shí)間一定空間內(nèi)微生物的細(xì)一定時(shí)間一定空間內(nèi)微生物的細(xì)胞群或生長(zhǎng)物。如微生物的斜面培養(yǎng)物、搖瓶培養(yǎng)物胞群或生長(zhǎng)物。如微生物的斜面培養(yǎng)物、搖瓶培養(yǎng)物等。等。2）菌株）菌株(strain)：從自然界中分離得到的任何一種微從自然界中分離得到的任何一種微生物的純培養(yǎng)物都可以稱為微生物的一個(gè)菌株；對(duì)不生物的純培養(yǎng)物都可以稱為微生物的一個(gè)菌株；對(duì)不同來(lái)源的同一種細(xì)菌稱為該菌的不同菌株。同一種細(xì)同來(lái)源的同一種細(xì)菌稱為該菌的不同菌株。同一種細(xì)菌可有許多菌株，其菌可有許多菌株，其主要性狀應(yīng)該完全相同，次要性主要性狀應(yīng)該完全相同，次要性狀可稍有差異狀可稍有差

4、異，通常用地名或動(dòng)物名的縮寫加編號(hào)作，通常用地名或動(dòng)物名的縮寫加編號(hào)作菌株名。菌株名。3）型）型(form或或type)：常指亞種以下的細(xì)分。當(dāng)同種或同常指亞種以下的細(xì)分。當(dāng)同種或同亞種不同菌株之間的性狀差異，不足以分為新的亞種時(shí)，可以亞種不同菌株之間的性狀差異，不足以分為新的亞種時(shí)，可以細(xì)分為不同的型。（如不同血清型、噬菌型等）細(xì)分為不同的型。（如不同血清型、噬菌型等）微生物的種：微生物的種：具有高度特征相似性的菌株群，這個(gè)菌株群與其具有高度特征相似性的菌株群，這個(gè)菌株群與其 他類群的菌株有很明顯的區(qū)別。他類群的菌株有很明顯的區(qū)別。菌株與型的區(qū)別：菌株與型的區(qū)別：菌株之間不存在鑒別性特征的差

5、異，命名不同的菌株無(wú)需分菌株之間不存在鑒別性特征的差異，命名不同的菌株無(wú)需分類學(xué)依據(jù)，不同型的細(xì)菌之間存在鑒別性特征的差異，命名類學(xué)依據(jù)，不同型的細(xì)菌之間存在鑒別性特征的差異，命名或鑒定不同的型必需有分類學(xué)依據(jù)?；蜩b定不同的型必需有分類學(xué)依據(jù)。4）種（）種（species）： 物種，生物分類中基本的分類單元物種，生物分類中基本的分類單元二、二、細(xì)菌的命名細(xì)菌的命名 細(xì)菌的命名依據(jù)細(xì)菌的命名依據(jù)“國(guó)際細(xì)菌命名法規(guī)國(guó)際細(xì)菌命名法規(guī)” 的規(guī)定，的規(guī)定，學(xué)名用學(xué)名用拉丁文拉丁文，遵循，遵循“雙名法雙名法”。所謂。所謂“雙名法雙名法”就是每一種細(xì)菌的拉丁文名稱由屬名和種名兩部就是每一種細(xì)菌的拉丁文名稱由

6、屬名和種名兩部分構(gòu)成，分構(gòu)成，屬名第一個(gè)字母必須大寫，其余均應(yīng)小屬名第一個(gè)字母必須大寫，其余均應(yīng)小寫（即使種名以人名或地名命名）寫（即使種名以人名或地名命名）。整個(gè)屬名及。整個(gè)屬名及種名在出版物中應(yīng)排成斜體。種名在出版物中應(yīng)排成斜體。 如：如：Escherichia coli 屬名屬名+種名種名 Salmonella pullorum (S. pullorum) 屬名重復(fù)出現(xiàn)，可縮寫屬名重復(fù)出現(xiàn)，可縮寫 如：如：E.coli （大腸桿菌）；（大腸桿菌）； S. pullorum（雞白痢沙門氏菌）（雞白痢沙門氏菌） 只確定屬名，未確定種名的某一株細(xì)菌只確定屬名，未確定種名的某一株細(xì)菌 Salmo

7、nella sp. 只確定屬名，未確定種名的若干菌株只確定屬名，未確定種名的若干菌株Salmonella spp. 亞種用亞種用subsp.（正體）表示（正體）表示 Pasteurella multocida subsp. septica 幾種不同的書(shū)寫情況：幾種不同的書(shū)寫情況：由于細(xì)菌分類單元的劃分缺乏一個(gè)易于操作的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，由于細(xì)菌分類單元的劃分缺乏一個(gè)易于操作的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，為了減少因采用不同標(biāo)準(zhǔn)界定分類單元所造成的混亂，為了減少因采用不同標(biāo)準(zhǔn)界定分類單元所造成的混亂，細(xì)菌系統(tǒng)分類也像其他生物分類一樣采用細(xì)菌系統(tǒng)分類也像其他生物分類一樣采用“模式概念模式概念”種和亞種指定模式菌株（種和亞種指

8、定模式菌株（type strain）；）；亞屬和屬指定模式種（亞屬和屬指定模式種（type species）；）；屬以上至目級(jí)分類單元指定模式屬（屬以上至目級(jí)分類單元指定模式屬（type genus）；）；模式菌株應(yīng)送交菌種保藏機(jī)構(gòu)保藏，以便備查考和索取。模式菌株應(yīng)送交菌種保藏機(jī)構(gòu)保藏，以便備查考和索取。美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）德國(guó)微生物及細(xì)胞保藏中心（德國(guó)微生物及細(xì)胞保藏中心（DSM）細(xì)菌分類命名權(quán)威雜志細(xì)菌分類命名權(quán)威雜志:國(guó)際系統(tǒng)與進(jìn)化微生物學(xué)雜國(guó)際系統(tǒng)與進(jìn)化微生物學(xué)雜志（志（International Journal of Systematic and

9、 Evolutionary Microbiology,IJSEM）任何分離鑒定的新細(xì)菌的有關(guān)論文應(yīng)在該雜志發(fā)表任何分離鑒定的新細(xì)菌的有關(guān)論文應(yīng)在該雜志發(fā)表二、二、 原核微生物分類系統(tǒng)原核微生物分類系統(tǒng)（一）（一）伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊(cè)伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊(cè)(Bergeys Manual of Determinative Bacteriology)美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)的細(xì)菌學(xué)教授伯杰美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)的細(xì)菌學(xué)教授伯杰(D.Bergey)(1860-1937)伯杰氏手冊(cè)伯杰氏手冊(cè): 是目前進(jìn)行細(xì)菌分類、鑒定的最重要參考書(shū)，是目前進(jìn)行細(xì)菌分類、鑒定的最重要參考書(shū)，其特點(diǎn)是描述非常詳細(xì)，包括對(duì)細(xì)菌各個(gè)屬種的

10、特征及進(jìn)行其特點(diǎn)是描述非常詳細(xì)，包括對(duì)細(xì)菌各個(gè)屬種的特征及進(jìn)行鑒定所需做的實(shí)驗(yàn)的具體方法。鑒定所需做的實(shí)驗(yàn)的具體方法。1923年以來(lái)已出至第九版年以來(lái)已出至第九版(1994)；第九版伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)設(shè)立第九版伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)設(shè)立35個(gè)群，將古細(xì)菌部個(gè)群，將古細(xì)菌部改編為改編為5個(gè)群，全書(shū)描寫了約個(gè)群，全書(shū)描寫了約500個(gè)屬。個(gè)屬。劃分為四大類：劃分為四大類： 第一類第一類 具細(xì)胞壁的革蘭氏陰性真細(xì)菌具細(xì)胞壁的革蘭氏陰性真細(xì)菌 第二類第二類 具細(xì)胞壁的革蘭氏陽(yáng)性真細(xì)菌具細(xì)胞壁的革蘭氏陽(yáng)性真細(xì)菌 第三類第三類 無(wú)細(xì)胞壁的真細(xì)菌無(wú)細(xì)胞壁的真細(xì)菌 第四類第四類 古細(xì)菌古細(xì)菌 伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)伯杰

11、氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)（二）伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)（二）伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)(Bergeys Manual of Systematic Bacteriology)第一版第一版 1984年問(wèn)世，至年問(wèn)世，至1989年出齊，共年出齊，共4卷。卷。第二版第二版 由由George Garrity主編分為主編分為5卷，將從卷，將從2000年起年起陸續(xù)出版。這一版納入了研究核糖體陸續(xù)出版。這一版納入了研究核糖體RNA測(cè)序所產(chǎn)生測(cè)序所產(chǎn)生的許發(fā)育的許發(fā)育)分類系統(tǒng)。分類系統(tǒng)。四、微生物分類鑒定的依據(jù)四、微生物分類鑒定的依據(jù) 根據(jù)微生物分類學(xué)中使用的技術(shù)和方法，根據(jù)微生物分類學(xué)中使用的技術(shù)和方法，可把它們分成四個(gè)不同的

12、水平：可把它們分成四個(gè)不同的水平： 細(xì)胞形態(tài)和行為水平；細(xì)胞形態(tài)和行為水平； 細(xì)胞組分水平；細(xì)胞組分水平； 蛋白質(zhì)水平；蛋白質(zhì)水平； 基因組水平。基因組水平。 在微生物分類學(xué)發(fā)展的早期，主要的分類在微生物分類學(xué)發(fā)展的早期，主要的分類鑒定指標(biāo)是以在細(xì)胞形態(tài)和習(xí)性為主，可鑒定指標(biāo)是以在細(xì)胞形態(tài)和習(xí)性為主，可稱為經(jīng)典的分類鑒定法稱為經(jīng)典的分類鑒定法五、微生物分類鑒定的方法五、微生物分類鑒定的方法生物分類的傳統(tǒng)指標(biāo)生物分類的傳統(tǒng)指標(biāo)分子生物學(xué)指標(biāo)分子生物學(xué)指標(biāo) 微型、簡(jiǎn)便、快速或自動(dòng)化鑒定技術(shù)微型、簡(jiǎn)便、快速或自動(dòng)化鑒定技術(shù)細(xì)菌的數(shù)值分類細(xì)菌的數(shù)值分類 形態(tài)學(xué)特征形態(tài)學(xué)特征生理學(xué)特征生理學(xué)特征生態(tài)學(xué)特

13、征生態(tài)學(xué)特征 從不同層次，用不同學(xué)科的技術(shù)方法來(lái)研究和比較從不同層次，用不同學(xué)科的技術(shù)方法來(lái)研究和比較不同微生物的細(xì)胞、細(xì)胞組分或代謝產(chǎn)物，從中發(fā)現(xiàn)的不同微生物的細(xì)胞、細(xì)胞組分或代謝產(chǎn)物，從中發(fā)現(xiàn)的反映微生物類群特征的資料。反映微生物類群特征的資料。生物分類的傳統(tǒng)指標(biāo)生物分類的傳統(tǒng)指標(biāo)一、形態(tài)學(xué)特征一、形態(tài)學(xué)特征培養(yǎng)特征、培養(yǎng)特征、運(yùn)動(dòng)性、運(yùn)動(dòng)性、特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)及其染色特性、細(xì)胞形態(tài)及其染色特性、等等等等微生物分類和鑒定的重要依據(jù)：微生物分類和鑒定的重要依據(jù)：a）易于觀察和比較，尤其是真核微生物和具有特殊）易于觀察和比較，尤其是真核微生物和具有特殊 形態(tài)結(jié)構(gòu)的細(xì)菌；形

14、態(tài)結(jié)構(gòu)的細(xì)菌；b）許多形態(tài)學(xué)特征依賴于多基因的表達(dá)，具有相對(duì)）許多形態(tài)學(xué)特征依賴于多基因的表達(dá)，具有相對(duì) 的穩(wěn)定性；的穩(wěn)定性；二、生理生化特征二、生理生化特征與微生物的酶和調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的本質(zhì)和活性直接相關(guān)；與微生物的酶和調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的本質(zhì)和活性直接相關(guān)；代謝產(chǎn)物等代謝產(chǎn)物等營(yíng)養(yǎng)類型；營(yíng)養(yǎng)類型；與氧的關(guān)系；與氧的關(guān)系；對(duì)溫度的適應(yīng)性；對(duì)溫度的適應(yīng)性；對(duì)對(duì)pH的適應(yīng)性；的適應(yīng)性；對(duì)滲透壓的適應(yīng)性；對(duì)滲透壓的適應(yīng)性；酶及蛋白質(zhì)都是基因產(chǎn)物；酶及蛋白質(zhì)都是基因產(chǎn)物；對(duì)微生物生理生化特征的比較也是對(duì)微生物基因組的間接比較；對(duì)微生物生理生化特征的比較也是對(duì)微生物基因組的間接比較；測(cè)定生理生化特征比直接分析基因

15、組要容易得多測(cè)定生理生化特征比直接分析基因組要容易得多；1 1、 API API 細(xì)菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)細(xì)菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)2 2、 Enterotube Enterotube 系統(tǒng)系統(tǒng)3 3、 Biolog Biolog 全自動(dòng)或手動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)全自動(dòng)或手動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng) 微型、簡(jiǎn)便、快速或自動(dòng)化鑒定技術(shù)微型、簡(jiǎn)便、快速或自動(dòng)化鑒定技術(shù)1、 API 細(xì)菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)細(xì)菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)菌種菌種基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基（液體）（液體） 菌懸液菌懸液檢測(cè)、編碼、查表、鑒定檢測(cè)、編碼、查表、鑒定適用于適用于APIAPI鑒定細(xì)鑒定細(xì)菌有菌有700700多種多種Analytica Products INC的簡(jiǎn)稱。法國(guó)生物

16、- 梅里埃公司生產(chǎn)的細(xì)菌數(shù)值分類分析鑒定系統(tǒng)。約有1 000 種生化反應(yīng),可鑒定的細(xì)菌大于550 種。目前中國(guó)各級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)在細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)中比較多地應(yīng)用了此項(xiàng)技術(shù) 2、Enterotube 系統(tǒng)系統(tǒng) 不同培養(yǎng)基分裝不同小槽中，同不同培養(yǎng)基分裝不同小槽中，同步接種，培養(yǎng)后檢測(cè)、查表、鑒定。步接種，培養(yǎng)后檢測(cè)、查表、鑒定。3 3、BiologBiolog全自動(dòng)或手動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)全自動(dòng)或手動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng) 在在96孔的細(xì)菌培養(yǎng)板上檢測(cè)微生物對(duì)孔的細(xì)菌培養(yǎng)板上檢測(cè)微生物對(duì)不同發(fā)酵性碳源利用情況進(jìn)行的分類鑒定。不同發(fā)酵性碳源利用情況進(jìn)行的分類鑒定。自動(dòng)化、快速自動(dòng)化、快速 可鑒定細(xì)菌有可鑒定細(xì)菌有11

17、401140多種、酵母菌多種、酵母菌267267種、目種、目前已經(jīng)可用于絲狀真菌。前已經(jīng)可用于絲狀真菌。每個(gè)孔中含有每個(gè)孔中含有不同的底物不同的底物菌懸液或菌懸液或無(wú)菌水無(wú)菌水分子生物學(xué)指標(biāo)分子生物學(xué)指標(biāo) DNA堿基因組成是各種生物一個(gè)穩(wěn)定的特堿基因組成是各種生物一個(gè)穩(wěn)定的特征，即使個(gè)別基因突變，堿基組成也不會(huì)發(fā)生征，即使個(gè)別基因突變，堿基組成也不會(huì)發(fā)生明顯變化。明顯變化。1. DNA的堿基組成的堿基組成(G+Cmol%) 分類學(xué)上，用分類學(xué)上，用G+C占全部堿基的分子占全部堿基的分子百分?jǐn)?shù)百分?jǐn)?shù)(G+Cmol%)來(lái)表示各類生物的來(lái)表示各類生物的DNA堿基因組成特征。堿基因組成特征。 每個(gè)生物

18、種都有特定的每個(gè)生物種都有特定的GC%范圍，因范圍，因此此 可以作為分類鑒定的指標(biāo)。細(xì)菌的可以作為分類鑒定的指標(biāo)。細(xì)菌的GC%范圍為范圍為25-75%，變化范圍最大，因此更適，變化范圍最大，因此更適合于細(xì)菌的分類鑒定。合于細(xì)菌的分類鑒定。 GC%測(cè)定主要用于對(duì)表型特征難區(qū)分的細(xì)菌測(cè)定主要用于對(duì)表型特征難區(qū)分的細(xì)菌 作出鑒定，并可檢驗(yàn)表型特征分類的合理性，作出鑒定，并可檢驗(yàn)表型特征分類的合理性， 從分子水平上判斷物種的親緣關(guān)系。從分子水平上判斷物種的親緣關(guān)系。G+C含量的比較主要用于分類鑒定中的含量的比較主要用于分類鑒定中的否定否定但具有相似但具有相似G+C含量的生物并不一定表明它們含量的生物并

19、不一定表明它們之間具有近的親緣關(guān)系。之間具有近的親緣關(guān)系。 同一個(gè)種內(nèi)的不同菌株同一個(gè)種內(nèi)的不同菌株G+C含量差別應(yīng)在含量差別應(yīng)在45%以下；同屬不同種的差別應(yīng)低于以下；同屬不同種的差別應(yīng)低于1015%； G+C含量已經(jīng)作為建立新的微生物分類單元的一含量已經(jīng)作為建立新的微生物分類單元的一項(xiàng)基本特征，它對(duì)于種、屬甚至科的分類鑒定有重要項(xiàng)基本特征，它對(duì)于種、屬甚至科的分類鑒定有重要意義。意義。 若二個(gè)在形態(tài)及生理生化特性方面及其相似的若二個(gè)在形態(tài)及生理生化特性方面及其相似的菌株，如果其菌株，如果其G+C含量的差別大于含量的差別大于5%，則肯定不是，則肯定不是同一個(gè)種，大于同一個(gè)種，大于15%則肯定

20、不是同一個(gè)屬。則肯定不是同一個(gè)屬。2. 核酸的分子雜交核酸的分子雜交 不同生物不同生物DNA堿基排列順序的異同直接反映生物堿基排列順序的異同直接反映生物之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，堿基排列順序差異越小，它們之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，堿基排列順序差異越小，它們之間的親緣關(guān)系就越近，反之亦然。之間的親緣關(guān)系就越近，反之亦然。t 直接分析比較DNA的堿基排列順序-由于技術(shù)上的困難目前尚難以普遍地進(jìn)行；由于技術(shù)上的困難目前尚難以普遍地進(jìn)行；t 核酸分子雜交(hybridization)間接比較不同微生物DNA堿基排列順序的相似性3. 生物信息學(xué)分析生物信息學(xué)分析 隨著微生物基因信息，特別是全基因組隨著微生物基因信息

21、，特別是全基因組完全測(cè)序的不斷增加，我們可以通過(guò)各種計(jì)完全測(cè)序的不斷增加，我們可以通過(guò)各種計(jì)算機(jī)軟件對(duì)不同物種的遺傳信息進(jìn)行直接比算機(jī)軟件對(duì)不同物種的遺傳信息進(jìn)行直接比較，從而分析不同微生物間的親緣關(guān)系。較，從而分析不同微生物間的親緣關(guān)系。4、16S rRNA和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(1). 16S rRNA的順序和進(jìn)化的順序和進(jìn)化培養(yǎng)微生物培養(yǎng)微生物提取、純化細(xì)菌基因組提取、純化細(xì)菌基因組設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增擴(kuò)增16S rRNA分析比較分析比較微生物之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系微生物之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系(2). 特征序列或序列印記（特征序列或序列印記（signature sequence）通過(guò)對(duì)通過(guò)對(duì)r RNA全序列資料的分析比較（特別是全序列資料的分析比較（特別是采用計(jì)算機(jī)）發(fā)現(xiàn)的在不同種群水平上的特采用計(jì)算機(jī)）發(fā)現(xiàn)的在不同種群水平上的特異特征性寡核苷酸序列，或異特征性寡核苷酸序列，或在某些特定的序在某些特定的序列位點(diǎn)上出現(xiàn)的單堿基印記列位點(diǎn)