第03章蛋白質(zhì)的通性、純化與表征

1、第03章蛋白質(zhì)的通性、純化與表征1、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)pH=6蛋白質(zhì)溶液處于等電蛋白質(zhì)溶液處于等電點(diǎn)時(shí)，溶解度最小。點(diǎn)時(shí)，溶解度最小。u穩(wěn)定蛋白質(zhì)膠體溶液的主要因素穩(wěn)定蛋白質(zhì)膠體溶液的主要因素水化層水化層(hydration shell);靜電排斥：靜電排斥：2、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與沉淀、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與沉淀一旦電荷被中和或水化膜被破壞，一旦電荷被中和或水化膜被破壞，在蛋白質(zhì)的疏水作用下，蛋白質(zhì)顆在蛋白質(zhì)的疏水作用下，蛋白質(zhì)顆粒聚集，便從溶液中析出沉淀。粒聚集，便從溶液中析出沉淀。u蛋白質(zhì)沉淀蛋白質(zhì)沉淀(precipitation)(precipitation)的方法的方法重金

2、屬鹽沉淀重金屬鹽沉淀法法：pH大于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，可與大于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，可與重金屬離子結(jié)成不溶性沉淀（重金屬離子結(jié)成不溶性沉淀（Ca 2+、Mg 2、Ba 2+、Pb 2+與羧與羧基結(jié)合；基結(jié)合；Mn 2、Zn 2、Fe 2+、Cu 2+、Co 2+、Ni 2+與羧基、含與羧基、含氮化合物及雜環(huán)化合物結(jié)合；氮化合物及雜環(huán)化合物結(jié)合；Ag+、Hg 2+、Pb 2+能與巰基結(jié)能與巰基結(jié)合）。重金屬沉淀的蛋白質(zhì)常是變性的合）。重金屬沉淀的蛋白質(zhì)常是變性的。有機(jī)溶劑沉淀法：與蛋白質(zhì)份子爭奪水分子，破壞蛋白質(zhì)表面有機(jī)溶劑沉淀法：與蛋白質(zhì)份子爭奪水分子，破壞蛋白質(zhì)表面的水化膜，降低介

3、電常數(shù)。使用較多的有機(jī)溶劑是乙醇、甲醇等。的水化膜，降低介電常數(shù)。使用較多的有機(jī)溶劑是乙醇、甲醇等。在常溫下，有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)往往引起變性。例如酒精消毒滅在常溫下，有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)往往引起變性。例如酒精消毒滅菌就是如此。菌就是如此。鹽析法：向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽鹽析法：向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl，使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀。，使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀。蛋白質(zhì)不變蛋白質(zhì)不變性。性。生物堿試劑和某些酸類沉淀法：生物堿試劑和某些酸類沉淀法：pHpH小于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶正小于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷，易與生物堿試劑和酸類的負(fù)離子生成不溶

4、性沉淀。生物堿電荷，易與生物堿試劑和酸類的負(fù)離子生成不溶性沉淀。生物堿試劑：是指能引起生物堿沉淀的一類試劑，單寧酸、苦味酸、鎢試劑：是指能引起生物堿沉淀的一類試劑，單寧酸、苦味酸、鎢酸。酸酸。酸 類：三氯乙酸、磺基水楊酸。類：三氯乙酸、磺基水楊酸。加熱變性沉淀：將接近于等電點(diǎn)附近的蛋白質(zhì)溶液加熱，加熱變性沉淀：將接近于等電點(diǎn)附近的蛋白質(zhì)溶液加熱，熱穩(wěn)定性差的蛋白質(zhì)將發(fā)生變性熱穩(wěn)定性差的蛋白質(zhì)將發(fā)生變性而凝固而凝固沉淀。沉淀。 3.1 一般程序：前處理、粗分級、細(xì)分級、濃縮與保存一般程序：前處理、粗分級、細(xì)分級、濃縮與保存3.1.2 粗分級粗分級(rough fractionation)去雜質(zhì)蛋

5、白質(zhì)和其它大分子去雜質(zhì)蛋白質(zhì)和其它大分子 一般用選擇性沉淀法：鹽析（例如用一般用選擇性沉淀法：鹽析（例如用(NH4)2SO4分級沉分級沉淀）；等電點(diǎn)選擇性沉淀法；有機(jī)溶劑分級沉淀法；熱淀）；等電點(diǎn)選擇性沉淀法；有機(jī)溶劑分級沉淀法；熱處理選擇性沉淀法；生物堿或三氯乙酸選擇性沉淀法處理選擇性沉淀法；生物堿或三氯乙酸選擇性沉淀法3.1.3 細(xì)分級（細(xì)分級（fine fractionation)純化純化 透析除鹽；凝膠過濾除鹽；透析除鹽；凝膠過濾除鹽； 層析法：凝膠過濾層析、層析法：凝膠過濾層析、離子交換層析、吸附層析、親和層析、疏水層析（反相離子交換層析、吸附層析、親和層析、疏水層析（反相HPLC）

6、；）； 電泳法；電泳法； 密度梯度離心。密度梯度離心。3.1.4 濃縮與保存濃縮與保存 結(jié)晶方法：使溶液略處于過飽和狀態(tài)。降低溫度、鹽析、結(jié)晶方法：使溶液略處于過飽和狀態(tài)。降低溫度、鹽析、加有機(jī)溶劑、調(diào)節(jié)加有機(jī)溶劑、調(diào)節(jié)pH等。等。 凍干粉保存：在冷凍狀態(tài)下讓樣品中的液體升華。凍干粉保存：在冷凍狀態(tài)下讓樣品中的液體升華。 溶液保存：加入抗凍劑（溶液保存：加入抗凍劑（50%甘油）后甘油）后-20-70保存。保存。3.2 常見蛋白質(zhì)分離純化的方法與原理常見蛋白質(zhì)分離純化的方法與原理 1）透析和超濾）透析和超濾2）凝膠過濾層析）凝膠過濾層析（GFC） V Vt t-V-Vo o 或或V Vi i+V

7、+Vm mV Vt tV Vo ou分離介質(zhì)分離介質(zhì): :凝膠顆粒（交聯(lián)葡聚糖、聚丙烯酰胺、瓊脂糖等），凝膠顆粒（交聯(lián)葡聚糖、聚丙烯酰胺、瓊脂糖等），具有不均勻的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)具有不均勻的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)u分離機(jī)制：分子篩效應(yīng)，即根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同來分離蛋分離機(jī)制：分子篩效應(yīng)，即根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同來分離蛋白質(zhì)，白質(zhì)，大分子大分子物質(zhì)物質(zhì)最先流出柱外，最先流出柱外，小分子物質(zhì)小分子物質(zhì)最后流出柱外。最后流出柱外。 在限定的層析條件下，在限定的層析條件下，VtVt和和VoVo都為恒定值，都為恒定值，VeVe值是隨著值是隨著分離物分子質(zhì)量的變化而變化的。分離物分子質(zhì)量大，分離物分子質(zhì)量的變化而變化的。分離

8、物分子質(zhì)量大，K Kd d值值小；反之，?。环粗?，K Kd d值增大。值增大。(1)當(dāng)當(dāng)Kd = 0時(shí)，分子根本時(shí)，分子根本不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部 (全排全排阻阻)，洗脫體積等于空隙，洗脫體積等于空隙容積，即容積，即Ve = Vo (I)。(2)當(dāng)當(dāng)Kd = 1時(shí)，分子可完全滲入凝膠內(nèi)部時(shí)，洗脫體積應(yīng)為外水時(shí)，分子可完全滲入凝膠內(nèi)部時(shí)，洗脫體積應(yīng)為外水體積與內(nèi)水體積之和，即體積與內(nèi)水體積之和，即Ve=Vo+Vi ()。Kd可以有下列幾種情況可以有下列幾種情況分子量大洗脫體積小，分子量小洗脫體積大分子量大洗脫體積小，分子量小洗脫體積大3）有機(jī)溶劑沉淀法）有機(jī)溶劑沉淀法u 電泳：帶電顆粒

9、在電場中移動的現(xiàn)象。電泳：帶電顆粒在電場中移動的現(xiàn)象。+5.06.07.0穩(wěn)定pH梯度5.06.07.0穩(wěn)定pH梯度通電+v 等電聚焦電泳：在凝膠中建立等電聚焦電泳：在凝膠中建立pHpH梯度，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)移動到梯度，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)移動到其等電點(diǎn)的其等電點(diǎn)的pHpH時(shí)，凈電荷為零，在電場中不再移動而聚集。時(shí)，凈電荷為零，在電場中不再移動而聚集。vIEFIEF分離蛋白質(zhì)靠分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)，可分離分離蛋白質(zhì)靠分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)，可分離pIpI僅差僅差的蛋白質(zhì)，分辨率高。的蛋白質(zhì)，分辨率高。（2）等電聚焦電泳）等電聚焦電泳(isoelectric focusing, IEF) 6）親和層析）親和層析lgM

10、rlgMr a abVbVe e4.1 凝膠過濾法測定蛋白質(zhì)分子量凝膠過濾法測定蛋白質(zhì)分子量依靠分子篩效應(yīng)分離蛋白質(zhì)，適應(yīng)球狀蛋白的測定依靠分子篩效應(yīng)分離蛋白質(zhì)，適應(yīng)球狀蛋白的測定4、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定4.2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定分子量聚丙烯酰胺凝膠電泳測定分子量 4.3 沉降分析法測定相對分子量沉降分析法測定相對分子量沉降速度：與蛋白質(zhì)的大小、密度、形狀以及溶劑沉降速度：與蛋白質(zhì)的大小、密度、形狀以及溶劑的密度和粘度相關(guān)。的密度和粘度相關(guān)。Mr= RTsD(1-v)沉降系數(shù)沉降系數(shù)S用高速用高速離心機(jī)測定離心機(jī)測定Ultracentrifugation5、蛋白質(zhì)的含量測定與純度鑒定、蛋白質(zhì)的含量測定與純度鑒定5.1 5.1 蛋白質(zhì)含量測定蛋白質(zhì)含量測定總蛋白含量分析：總蛋白含量分析：凱氏定氮法、凱氏定氮法、Folin-Folin-酚法（酚法（LowryLowry法）、雙縮脲法、考馬斯亮藍(lán)法）、雙縮脲法、考馬斯亮藍(lán)法、紫外吸收法。法、紫外吸收法。特定蛋白組分的含量分析：特定蛋白組分的含量分析：酶和激素等：酶活性或激素活性表示（比活性）酶和激素等：酶活性或激素活性表示（比活性）其它蛋白：抗原抗