質(zhì)粒DNA的提取及檢測實驗報告0001

1、題目：質(zhì)粒DNA的提取及檢測實驗目的：1. 學習堿裂解法提取質(zhì)粒的原理和方法；2. 學習DNA瓊脂糖凝膠電泳的原理和方法。二. 實驗原理1. 質(zhì)粒(Plasmid):一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從l-200kb不等，為雙鏈、閉環(huán)的DA分子，并以 超螺旋狀態(tài)存在于宿主細胞中。主要發(fā)現(xiàn)于細菌、放線菌和真菌細胞中，常常編碼一些對宿 主有利的酶的基因，這些基因的表型包括抗生素抗性，產(chǎn)生抗生素、限制酶、修飾酶等。2. 載體(Vector):要把一個有用的外源基因通過基因工程手段，轉(zhuǎn)化到細胞中去進行繁殖和表達，需要運 載工具，攜帶外源基因進入受體細胞的這種工具就叫載體。LI前除了大腸桿菌中的質(zhì)粒、X

2、噬菌體、M13噬菌體、噬菌粒外，還有酵母人工染色體載體以及動、植物病毒載體等。3. 分離質(zhì)粒DNA：(1) 培養(yǎng)細菌使質(zhì)粒擴增；(2) 收集和堿裂解細菌；(3) 分離和純化質(zhì)粒DA。4. 堿裂解法(1) 溶液 I： 50mmol/L 葡萄糖，10mmol/EDTA-Na, 25mmol/LTris-HCl作用：分散細胞，螯合金屬離子使酶失活，防止DA的降解(2) 溶液II ： L NaOH, 2% SDS,臨用前1： 1配制作用：細胞在aOH和SDS溶液中裂解時，蛋白質(zhì)與染色體DA發(fā)生變性(3) 溶液III : 5mol/L醋酸鉀60ml,冰酷酸，雙蒸水作用：酸性條件上質(zhì)粒DYA復性，留在上清

3、液。大腸桿菌DYA和蛋白質(zhì)-SDS復合物等發(fā)生沉 淀。5. 電泳帶電荷的物質(zhì)，在電場中的趨向運動稱為電泳。DNA的瓊脂糖凝膠電泳可以分離長度為 200bp至近50kb的DNA分子。DA的遷移率(U)的對數(shù)與凝膠濃度(T)之間存在反平行線 性關系。因此，要有效地分離不同大小的DA片段，選用適當?shù)沫傊悄z濃度是非常重要 的。6. 提取質(zhì)粒在質(zhì)粒提取的過程中，由于操作原因，提取的質(zhì)?？赡苡腥N：線性DA、開環(huán)DNA、 閉環(huán)超螺旋DA。當提取的質(zhì)粒DNA電泳時，同一質(zhì)粒DYA泳動速度：閉環(huán)超螺旋線狀 開環(huán)。但有時也有也會出現(xiàn)相反情況，因為與瓊脂糖濃度、電流強度、離子強度及核酸染料 含量有關。三. 實

4、驗材料及設備1. 實驗材料：(1) 含質(zhì)粒PUC18大腸桿菌，塑料離心管，EP管架，微量取液器和 取液器吸頭，常用玻璃器皿(如三角瓶、量筒、試劑瓶等)；(2) 提取的pUC18,瓊脂糖，錐形瓶，一次性手套，膠鏟，封口膜, 剪刀，取液器吸頭。實驗設備：2. 實驗儀器：(1) 恒溫搖床，高壓滅菌鍋，超凈工作臺，10、100、1000 nL取液 器各一支，臺式高速離心機，制冰機，漩渦器；(2) 電泳儀，電泳槽，樣品槽模板(梳子)，有機玻璃內(nèi)槽，水平儀， 取液器，微波爐，凝膠成像系統(tǒng)。3. 實驗試劑：(1)質(zhì)粒的提取培養(yǎng)液：胰蛋白月東(Tryptone) 10g,酵母提取物(Yeast extract

5、)5g, NaC15g,瓊脂(固體培養(yǎng)基)15g,用IN N&0H調(diào);b溶液I ,溶液II,溶液III；c.氨節(jié)青霉素(50mg/mL)；d抽提液(飽和酚:氯仿：異戊醇=25:24:1)作用：氯仿可使蛋白質(zhì)變性，有助于液相與有機相的分離。平衡酚密度大，可是DNA在上清中。異戊醇防止抽提液起泡。e無水乙醇 作用：除去DNA水化層，使DNA沉淀。%乙醇作用：純化質(zhì)粒DNA。緩沖液或ddH20作用：溶解DNA（2） DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測a. Gold view （DNA 染料）XTAE緩沖液c上樣緩沖液（6X）四. 實驗方法及步驟1. 質(zhì)粒DNA的提取a）將帶有質(zhì)粒PUC18的大腸桿菌接種在液體

6、培養(yǎng)基中（加氨節(jié)青霉 素50ng/mL）, 370C培養(yǎng)過夜；b）取培養(yǎng)菌液置Eppendorf小管中,10000rpmX2min,棄上清液；c）加入100 UL溶液I,漩渦器上充分混勻，在室溫下放置10 min；d）加入200 uL新配制的溶液II,輕輕翻轉(zhuǎn)23次，使之混勻，冰 上放置5 min；e）加入150 uL冰冷的溶液III,蓋緊后，溫和顛倒3-5次使混勻， 產(chǎn)生白色絮狀物，冰上放置15 min；f）lOOOOrpmX 5 min,取上清液于另一干凈的離心管中；g）向上清液中加入等體積（約400 UL）酚：氯仿/異戊醇（25： 24:1, v/v）,振蕩混勻，lOOOOtpni X

7、10 min,將上清液轉(zhuǎn)移至新的離 心管中；h）加入等體積（約370 pL）氯仿/異戊醇（24:1）,混勻,lOOOOrpm X 2min，取上清液于新離心管中；i）向上清液加入2倍體積無水乙醇，混勻，-200C放置lh；j）12000rpm X 5 min,倒去上清液，吸干液體；k）加800 u L70%乙醇，離心12000rpm X 1 min,倒盡上清液，吸 水紙吸干液體，室溫自然干燥30min,直至變得透明無乙醇味；l）加20uL ddH20 ,混勻使DNA溶解完全，取5uL做電泳檢測， 剩余的溶液放置-200C保存?zhèn)溆谩?. DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測a）瓊脂糖凝膠板的制備b）稱取瓊脂

8、糖，置于錐形瓶中，加入30mLlXTAE緩沖液，微波爐加 熱直至瓊脂糖溶解；c）待膠液冷卻到650C （不燙手為宜），加入luL Gold view混勻, 攪拌器上攪拌排除氣泡，緩慢倒入事先準備的制膠有機玻璃槽（插入樣品槽模板梳子）內(nèi)，靜置30min左右，輕輕晃動拔出 梳子；3. 加樣膠板放入電泳槽中（樣品孔位于負極），注入1XTAE緩沖液 淹沒過膠板5mm,用取液器將提取的質(zhì)粒DNA5 u L與1 P L上樣緩 沖液（6X ）混勻，加入膠板的樣品小槽內(nèi)。4. 電泳將電泳槽與電泳儀接通，調(diào)節(jié)電壓為100V左右，直至緩沖液的 藍色指示劑移動到距離膠板邊沿約r2cm處，停止電泳。5. 觀察和拍照將

9、膠板小心取岀，放入凝膠成像系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)位置居中，波長為254nm的紫外燈下，觀察凝膠中DNA存在處顯示出熒光條帶。五. 實驗結果A 帶:15000bpB 帶 lOOOObpPEGFP-N3 pET-28acC 帶 7500bpD 帶 5000bpE 帶 3000bpF 帶 lOOObpG 帶 250bp圖1堿裂解法提取pEGFP-N3與pET-28A-c質(zhì)粒凝膠電泳紫外熒光檢測結果說明：從左到右依次為：pEGFP-N3、pET-28A-c. DLlSOOOMaker所提取的質(zhì)粒DNA可通過瓊脂凝膠電泳進行檢測。一般情況下， 提取的質(zhì)粒為3條帶。在細胞內(nèi)，質(zhì)粒DNA是共價閉合壞狀DNA,常 以超

10、螺旋形式存在；如果兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處缺刻，分 子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，這種松弛型的分子叫做開壞DNA；若兩 條鏈在同一處或相近的部位斷裂，則變成線性DNA分子。在電泳時，同一質(zhì)粒的電泳速度因DNA的構型不同而異，其速度 從大到小的次序為：cccDNA線性ocDNA,共價閉環(huán)DNA的泳動速度 最快，電泳速度最快的條帶顯色最深。但在優(yōu)化條件下，如在冰浴中 或使用試劑盒提取時，可以只出現(xiàn)一條帶或主要出現(xiàn)一條帶，即超螺 旋帶。由圖可知，本次實驗結果出現(xiàn)了明顯的三條帶，表明該樣品中同 時出現(xiàn)共價閉合環(huán)狀DNA、開環(huán)DNA和線性DNA分子。與Marker比 照，分子量基本符合對應的分子量條帶

11、。實驗結果較好。六. 結果討論與結論：1.實驗結論：通過堿裂解方法，我們將細菌的質(zhì)粒變性提出，又通過多個洗 滌、純化步驟，得到了提純的質(zhì)粒，在最后的本次實驗結果出現(xiàn)了明 顯的三條帶，表明該樣品中同時出現(xiàn)共價閉合壞狀DNA、開環(huán)DNA和 線性DNA分子。與Marker比照，分子量基本符合對應的分子量條帶,實驗結果較好。2.討論一：溶液II為什么現(xiàn)配現(xiàn)用而且需放置在常溫下答:溶液中NaOH放置過久會與空氣中C02反應變質(zhì),導致溶液II pH下 降，無法達到很好的裂解效果；溶液中SDS成分在溫度較低環(huán)境 下由于溶解度下降導致析出，溶液失去效果。3.討論二：抽提液（飽和酚：氯仿:異戊醇）的作用。氯仿:異戊醇為什么加兩次作用：使樣品中雜質(zhì)蛋白變性析出，被抽提出樣品；第二次加入異 戊醇目的為洗凈上一步抽提中樣品殘留的飽和酚。4討論三：實驗中無水乙醇與70%乙醇的作用。用無水乙醇沉淀DNA,這是實驗中最常用的沉淀DNA的方法. 乙醇的優(yōu)點是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會起任何化 學反應，對DNA很安全，因此是理想的沉淀劑.DNA溶液是DNA以 水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當加入乙醇時，乙醇會奪DNA周圍的水分子, 使DNA失水而易于聚合；70%乙醇的作用不是沉淀DNA,而是