轉染人BTLA基因細胞株的建立及其生物學功能的初步研究

1、轉染人BTLA基因細胞株的建立及其生物學功能的初步研究              作者：王雪峰, 陳永井, 王勤, 楊科芳, 代群, 王鳳鳴, 張學光【關鍵詞】  B、,T淋巴細胞衰減子;,基因轉染;,T細胞;,增殖Establishment of cell line transfected with human BTLA gene and preliminary study on its biological functionAbstract  AIM:

2、 To establish 293T cells expressing human BTLA gene, a novel attenuator for B and T lymphocyte. METHODS: The gene encoding human BTLA was amplified by RTPCR from PHA activated T cells, and then the target gene fragment was inserted into retrovirus vector pEGZTerm after being digested with EcoR I and

3、 BamH I. The recombinant vector was transfected into 293T cells with LipfectAMINETM 2000, and the cells was further selected with Zeocin. Effect of 293T/BTLA cells on T cells proliferation and activation in vitro was been studied by methods of MTT and cytometry. RESULTS: The stable expression of hum

4、an BTLA on the transfected cell line was identified by flow cytometry analysis. In vitro, 293T/BTLA cells had an inhibitory effect on the proliferation of T cells stimulated by antiCD3 mAb and downregulated the expression of activation marker CD25 on the surface of T cells and decreased the secretio

5、n of IFN and IL10. CONCLUSION: A cell line 293T/BTLA stably expressing the human BTLA protein has been obtained and it can partially inhibit the proliferation and activation of T cells in vitro.KeywordsB and T lymphocyte; gene transfection; T cell; proliferation摘 要  目的: 構建B、 T淋巴細胞衰減子（BTLA）基因轉染的

6、細胞作為免疫原, 并探討該基因轉染細胞在體外的生物學功能。方法: 通過RTPCR法從經PHA活化的人外周血T細胞中克隆出人BTLA編碼區(qū)全長基因, 經EcoR I和BamH I雙酶切后插入逆轉錄病毒載體pEGZTerm中構建成重組載體pEGZTerm/BTLA。用脂質體法以重組逆轉錄病毒載體轉染293T細胞, 并用Zeocin抗生素進行長期篩選; 流式細胞術分析BTLA在基因轉染細胞膜上的表達; 通過MTT法和流式細胞術探討基因轉染細胞在體外對T淋巴細胞增殖與活化的影響。結果: 流式細胞術檢測表明BTLA基因轉染的293T細胞膜上能穩(wěn)定地高表達人BTLA蛋白。BTLA基因轉染的293T細胞和T

7、細胞體外共培養(yǎng)顯示, 與未轉染的293T細胞相比, 該基因轉染的細胞能部分地抑制抗人CD3單克隆抗體（mAb）刺激的T細胞增殖; 流式細胞術和ELISA法分析揭示, 該基因轉染的細胞能夠下調T細胞表面活化標志CD25的表達并降低IFN和IL10 的分泌。結論: 獲得穩(wěn)定高表達人BTLA基因轉染的細胞株。該細胞株在體外對抗人CD3 mAb刺激的T細胞的增殖與活化具有部分地抑制作用。關鍵詞B、 T淋巴細胞衰減子; 基因轉染; T細胞; 增殖B、 T淋巴細胞衰減子（B and T lymphocyte attenuator, BTLA）是2003年新發(fā)現的一個重要的負性共信號分子1, 屬于CD28超

8、家族成員。BTLA表達于外周血成熟的淋巴細胞（包括B細胞、 T、 T、 CD4+CD25+ T細胞）, 脾臟巨噬細胞和髓系樹突狀細胞（DCs）, 以及NK細胞呈微弱表達。研究表明, BTLA對T細胞的活化、 增殖起著重要的負調控作用1-3。BTLA相應配體為TNFR超家族中的皰疹病毒入侵介質（HVEM）, 其表達于包括T細胞在內的多種免疫細胞表面。HVEM的胞外段有4個富含半胱氨酸的結構域（CRD1, CRD2, CRD3和CRD4）, 其中CRD1可與BTLA結合從而介導負性信號。有趣的是, HVEM同時又可作為LIGHT（homologous to lymphotoxins, induci

9、ble, competes with HSV glycoprotein D for HVEM, expression by T lymphocyte）的受體（LIGHT與HVEM的CRD2和CRD3結合）介導正性信號。BTLA/HVEM/LIGHT這種復雜的相互作用可能有助于實現T細胞的精確調控和適度活化, 因此, 探討B(tài)TLA的負性調控作用及其機制具有重要的理論意義。由于該新分子尚缺乏相關的研究材料, 如功能性抗人BTLA的單克隆抗體（mAb）, 對人BTLA的生物學效應與作用機制知之甚少。本研究旨在通過克隆人BTLA編碼區(qū)全長基因, 并建立能穩(wěn)定表達人BTLA基因的293T細胞株, 為研制

10、抗人BTLA mAb提供免疫原; 并探討了其對T細胞增殖與活化的影響。1  材料和方法1.1  材料  293T細胞株購自ATCC公司, 由本所保存。克隆載體pMD18T購自TaKaRa公司。逆轉錄病毒載體pEGZTerm由德國Sefling教授惠贈。脂質體LipofectAMINETM 2000和Zeocin購自Invitrogen公司。植物血球凝集素（PHA）購自Sigma公司。Taq DNA聚合酶、 Pyrobest高保真DNA聚合酶、 各種限制性內切酶、 T4 DNA連接酶及逆轉錄試劑盒, 均購自TaKaRa公司。小量質粒抽提試劑盒、 PCR產物純化試劑盒

11、和膠回收試劑盒, 均購自杭州維特潔公司。胎牛血清（FCS）購自美國Hyclone公司。TRIZOL RNA抽提液和RPMI1640培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司。鼠抗人CD3激發(fā)型mAb購自法國Immunotech公司。人HVEMFc融合蛋白購自ALEXIS公司。激發(fā)型抗人CD28 mAb為本所研制。PE鼠抗人CD25 mAb、 FITC抗人CD4 mAb、 FITC抗人CD8 mAb、 PE羊抗鼠IgG及PE羊抗人IgG, 均購自廣州晶美公司。人IFN和IL10檢測試劑盒購自BIOSOURCE公司。1.2  引物設計與合成  根據GenBank中已知BTLA基因的序列, 針

12、對其編碼區(qū)分別設計用于逆轉錄擴增的上游引物BTA: 5ATG AAG ACA TTG CCT GCC ATG CT3, 下游引物BTB: 5TTA ACT CCT CAC ACA TAT GGA TGC3; 以及進一步用于酶切構建重組載體的上游引物BTEcoR I: 5CTG GAA TTC ACC ATG AAG ACA TTG CCT GCC ATG3, 下游引物BTBamH I: 5CTC GGA TCC TTA  ACT CCT CAC ACA TAT GGA TGC3, 下劃線部分分別為EcoR I和BamH I的酶切位點, 引物由上海博亞（英駿）生物技術有限公司合成。1.

13、3  方法1.3.1  人外周血T淋巴細胞的分離與活化  取健康志愿者外周全血（來自蘇州紅十字血站并經檢測合格）, 經Ficoll密度梯度分離獲得單個核細胞, 再用綿羊紅細胞結合實驗純化獲得純度為95%的T淋巴細胞。1.3.2  人BTLA基因的克隆與鑒定  取1×107的T細胞鋪于6孔板中, 加入PHA至終濃度為10 mg/L刺激培養(yǎng)64 h后離心收集T細胞, 以PBS洗3次后, 采用TRIZOL一步法提取總RNA, 按TaKaRa公司的逆轉錄試劑盒中說明書將mRNA逆轉錄成cDNA, 取5 L為模板, 用BTA、 BTB引物進行P

14、CR擴增,  反應條件為94變性30 s, 57退火40 s, 72延伸1 min, 共35個循環(huán)后, 再于72延伸10 min。PCR產物經試劑盒純化后, 在T4 DNA連接酶的作用下與pMD18T載體連接, 并轉化感受態(tài)細菌Top10。用含氨芐青霉素平板篩選陽性菌落, 擴增后抽提質粒, 經PCR和EcoR I、 BamH I雙酶切鑒定后, 送上海博亞（英駿）公司測序驗證。1.3.3  重組逆轉錄病毒載體的構建  以測序正確的pMD18T/BTLA質粒為模板, 以引物BTEcoR I和BTBamH I用Pyrobest高保真酶同上述條件進行PCR擴增, 經純化后

15、用EcoR I和BamH I進行雙酶切, 同時雙酶切pEGZTerm, 回收目的片段進行連接并轉化感受態(tài)細菌Top10, 按上述方法鑒定獲得重組逆轉錄病毒載體pEGZTerm/BTLA。1.3.4  穩(wěn)定表達人BTLA的293T細胞株的構建  參照文獻, 將重組逆轉錄病毒載體pEGZTerm/BTLA用脂質體法轉染預鋪于6孔板中的293T細胞, 48 h后, 以500 mg/L濃度的Zeocin抗生素進行篩選, 將獲得的293T/BTLA陽性克隆亞克隆后擴大培養(yǎng)。同時制備轉空載體pEGZTerm的陰性對照293T/mock細胞。收集293T/BTLA和293T/mock細胞

16、, 用激光共聚焦顯微鏡觀察和流式細胞術檢測綠色熒光蛋白（GFP）報告基因的表達。進一步利用HVEMFc融合蛋白與293T/BTLA結合, 以PE羊抗人IgG為二抗用流式細胞信檢測BTLA蛋白在細胞膜上的表達。1.3.5  淋巴細胞增殖與細胞因子分泌的檢測  參照文獻, 將T細胞以1×105個/孔加入到預先用抗人CD3激發(fā)型mAb（02 mg/L, 0.4 mg/L）以及聯(lián)合或不聯(lián)合抗人CD28激發(fā)型mAb（05 mg/L）包被的96孔板中。同時加入經絲裂霉素（50 mg/L）預處理的293T/BTLA或293T/mock細胞,  2×104個/

17、孔, 每組設3個復孔。于37、 50 mL/L CO2培養(yǎng)3 d后用MTT比色法測定T細胞的增殖。另外, 用04 mg/L抗人CD3激發(fā)型mAb包板, 將T細胞（1×106個/孔）與293T/BTLA或293T/mock細胞（2×105個/孔）加于24孔板中共培養(yǎng)。3 d后, 用流式細胞術測定T細胞表面活化標記CD25的表達, 并采用ELISA試劑盒測定IFN和IL10的分泌。2  結果2.1  人BTLA編碼區(qū)全長基因的克隆、 重組逆轉錄病毒載體的構建及其鑒定  通過RTPCR法, 從經PHA活化的人T淋巴細胞中擴增出大、 小不同的兩個基因片

18、段（圖1A）。測序結果表明, 870 bp的大片段為BTLA編碼區(qū)全長基因, 而726 bp的小片段為缺失第3個外顯子的BTLA基因的一種剪接體（結果未顯示）。構建的重組逆轉錄病毒載體pEGZTerm/BTLA經EcoR I和BamH I雙酶切后, 能夠釋放出870 bp的目的基因片段（圖1B）, DNA測序進一步證明插入載體中的基因片段與BTLA基因的序列完全一致。2.2  穩(wěn)定表達人BTLA基因的293T細胞的制備及鑒定  用Zeocin抗生素加壓獲得的轉染BTLA基因的293T細胞, 用激光共聚焦顯微鏡和流式細胞術檢測pEGZTerm載體中所帶GFP報告基因的表達。結

19、果顯示, GFP高表達于mock細胞和BTLA基因轉染的293T細胞上（圖2、 圖3）。將融合蛋白HVEMFc與轉染的293T細胞共孵育后, 以PE羊抗人IgG為二抗, 用流式細胞術檢測轉染細胞上BTLA的表達。結果表明, 人BTLA基因已成功轉入293T細胞中并能穩(wěn)定高表達（圖4）。圖1  人BTLA基因的克隆及重組逆轉錄病毒載體的酶切鑒定（略）Fig 1  Cloning of human BTLA gene and restriction enzyme digestion analysis of recombinant retrovirus vectorA. M: D

20、L2000 DNA marker; 1: RTPCR product of human BTLA gene(fulllength being 870 bp, splice variant being 726 bp, aspecific band approximately being 250 bp). B. M: DL2000 DNA marker; 1: Loop locked supercoil pEGZTerm/BTLA (9527bp); 2: Digested product of pEGZTerm/BTLA/EcoR I+BamH I(human BTLA gene fulllen

21、gth being 870 bp, linear pEGZTerm being 8757 bp).         圖2  BTLA基因轉染的293T細胞中GFP表達的激光共聚焦顯微鏡觀察（略）Fig 2  Observation of GFP expression in 293T cells transfected with BTLA gene under laser confocal microscope (×400)A: 293T/mock cells;  B: 293

22、T/BTLA cells.圖3  GFP在293T/BTLA細胞中表達的流式細胞術檢測（略）Fig 3  Detection of GFP expression in 293T/BTLA cells by FCMA: 293T/mock cells; B: 293T/BTLA cells. 圖4  BTLA基因轉染的293T細胞中BTLA表達的流式細胞術檢測（略）Fig 4  Detection of BTLA expression in 293T/BTLA cells by FCMA: 293T/mock cells binding to HVEMFc

23、; B: 293T/BTLA cells binding to HVEMFc.2.3  293T/BTLA細胞對T細胞的抑制作用  以293T/BTLA細胞或293T/mock細胞（對照）為效應細胞, 以純化的T細胞為靶細胞, 與04 mg/L鼠抗人CD3激發(fā)型mAb或04 mg/L抗CD3 mAb+05 mg/L抗CD28 mAb共培養(yǎng)3 d后, 分別檢測T細胞增殖和T細胞表面CD25的表達以及IFN和IL10的分泌。結果表明, 與對照組相比, 293T/BTLA細胞對經激發(fā)型抗CD28 mAb和抗CD3 mAb活化的T細胞的體外增殖具有一定的抑制效應(P005, 圖5）

24、, 并能一定程度地下調活化的CD4+、 CD8+T細胞上CD25的表達（圖6）, IFN與IL10的分泌也有所降低（圖7）。圖5  293T/BTLA基因轉染細胞對T細胞體外增殖抑制作用（略）Fig 5  Inhibitory effect of 293T/BTLA on proliferation of T cells圖6  293T/BTLA細胞對T細胞CD25表達的影響（略）Fig 6  Influence of 293T/BTLA cells on CD25 expression on T cells圖7  293T/BTLA細胞抑制T

25、細胞分泌細胞因子的ELISA檢測（略）Fig 7  Detection of inhibiting cytokine secretion by 293T/BTLA cells by ELISAA: 0.4 mg/L antiCD3 mAb; B: 0.4 mg/L antiCD3 mAb+0.5 mg/L antiCD28 mAb.3  討論BTLA不僅低表達于靜止T細胞, 而且T細胞活化后呈上調性表達。研究表明, BTLA與其配體HVEM作用可誘導其胞漿段酪氨酸磷酸化, 進一步募集含蛋白酪氨酸磷酸酶SHP1, SHP2的Src同源結構域,從而傳遞抑制信號1, 8。本研究用

26、PHA刺激人外周血T細胞活化后, 以RTPCR克隆了人BTLA全長基因。將其插入帶有GFP報告基因的逆轉錄病毒載體中, 并轉染293T細胞, 用Zeocin抗生素長期篩選后, 通過激光共聚焦顯微鏡觀測GFP的表達, 用流式細胞術檢測細胞膜上BTLA蛋白進行驗證, 結果表明, 成功地建立了可穩(wěn)定高表達人BTLA基因的轉染細胞, 提供了為研制抗人BTLA的mAb免疫原。將BTLA基因轉染的293T細胞與T細胞混合, 加入抗CD28 mAb和激發(fā)型抗人CD3 mAb激活T細胞后, 發(fā)現BTLA基因轉染的293T細胞可抑制T細胞增殖,下調CD25的表達及IFN與IL10的分泌。因此, 該基因轉染細胞對

27、T細胞在體外的增殖與活化具有一定的負性調節(jié)作用。近期研究表明: 共信號受體/配體分子間的信號普遍存在雙向傳遞現象9, 10, 即受體與配體間可相互傳遞信號, 引發(fā)生物學效應。故推測, 293T/BTLA細胞對T細胞的抑制效應一方面會不會存在這樣一種可能: 通過BTLA與HVEM的相互作用, 由HVEM向T細胞內傳遞抑制性信號？也可能是, 活化的T細胞表達的HVEM能上調另一配體LIGHT的表達, 通過HVEM/LIGHT介導的正性信號進一步促進T細胞增殖與細胞因子分泌。雖然研究已表明, 在蛋白水平上BTLA和LIGHT能同時與HVEM結合11, 但由于BTLA基因轉染的293T細胞上的BTLA

28、與T細胞上的HVEM結合后, 可能由于在細胞之間的空間位阻限制了LIGHT與HVEM的結合, 從而降低了HVEM/LIGHT信號途徑對T細胞增殖的促進作用, 尚待于進一步研究。參考文獻:1 Watanabe N, Gavrieli M, Sedy JR, et al. BTLA is a lymphocyte inhibitor receptor with similarities to CTLA4 and PD1J. Nature Immunol, 2003, 4(7): 670-679. Han P, Goularte OD, Rufner K, et al. An inhibitory

29、Ig superfamily protein expressed by lymphocytes and APCs is an early marker of thymocyte positive selectionJ. J Imunol, 2004, 172(10): 5931-5939. Sedy JR, Gavrieli M, Potter KG, et al. B and T lymphocyte attenuator regulates T cell activation through interaction with herpesvirus entry mediatorJ. Nature immunol, 2005, 6(1): 90-