采用重組人源 CYP酶研究艾瑞昔布的體外羥基化代謝-

1、采用重組人源CYP 酶研究艾瑞昔布的體外羥基化代謝李強(qiáng)3,黃海華13,董宇2,鐘大放2(沈陽(yáng)藥科大學(xué)1.微生物學(xué)教研室,2.藥物代謝與藥物動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)室,遼寧沈陽(yáng)110016;3.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春130023摘要:目的探討新型抗炎鎮(zhèn)痛藥艾瑞昔布在人體內(nèi)的羥基化代謝酶。方法用體外重組的人源細(xì)胞色素P450(CYP 進(jìn)行孵育代謝實(shí)驗(yàn),液相色譜2多級(jí)質(zhì)譜法分析代謝產(chǎn)物和殘留的母體藥物,利用整體歸一化法對(duì)4種CYP 酶的代謝作用大小進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果艾瑞昔布羥基化代謝可由CYP2C9,CYP2D6和CYP3A4催化,其各自作用大小分別為6215%,2111%和1614%。結(jié)論CYP2C9為艾瑞

2、昔布羥基化的主要代謝酶。關(guān)鍵詞:細(xì)胞色素P450;羥基化代謝;艾瑞昔布;液相色譜2多級(jí)質(zhì)譜法;整體歸一化中圖分類號(hào):R969.1;R969.2;Q559.9;R971.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):0513-4870(200505-0410-04 收稿日期:2004206218.基金項(xiàng)目:國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃課題(2003AA2Z347C .3通訊作者Tel:86-24-23843711-3795,Fax:86-24-23902539,E 2mail:zhongdfchina .comI nvesti gati on on the hydroxyl ati on met aboli

3、s m of i m recoxi b in vitro by usi n g reco mbi n ant hu man CYPsL IQ iang 3,HUANG Hai 2hua13,DONG Yu 2,ZHONG Da 2fang2(1.D epart m ent of Phar m aceutical M icrobiology, 2.L aboratory of D rug M etabolis m and Phar m acokinetics,Shenyang Phar m aceutical U niversity,Shenyang 110016,China; 3.Colleg

4、e of L ife Science,J ilin U niversity,Changchun 130023,China Abstract:A i m T o identify the drug 2metabolizing enzy mes involved in the hydr oxylati on of the ne w anti 2infla mmat ory and anodyne i m recoxib .M ethods I m recoxib was incubated with heter ol ogous exp ressi on hu cyt ochr o me P450

5、(r CYPs in vitro ,and metabolites and re mained parent drug were detected with liquid chr omat ography 2multistage mass s pectr ometry .The contributi on of 4CYPs in the hydr oxylati on metabolis m of i m recoxib was evaluated by t otal nor malized rate (T NR method .Results I m recoxib is metaboliz

6、ed by CYP2C9,CYP2D6and CYP3A4,with the rate of 6215%,2111%and 1614%,res pectively .Conclusi on CYP2C9is the maj or enzy me involved in i m recoxib hydr oxylati on metabolis m.Key words:cyt ochr ome P450;hydr oxylati on metabolis m;i m recoxib;liquid chr omat ography 2multistage mass s pectr ometry;t

7、 otal nor malized rate艾瑞昔布(i m recoxib,圖1為我國(guó)正在研制開(kāi)發(fā)中的新藥,環(huán)氧化酶22(COX 22特異性抑制劑,對(duì)因炎性介質(zhì)引起的環(huán)氧化酶22的生成有較強(qiáng)抑制作用,進(jìn)而發(fā)揮止痛及抗炎作用1。研究表明,該藥在人體內(nèi)絕大部分以代謝物形式消除,主要代謝途徑是經(jīng)肝臟代謝為42羥基代謝產(chǎn)物M1,尿液中幾乎只能檢測(cè)到進(jìn)一步氧化的42羧基代謝產(chǎn)物M2。I m recoxib:R =CH 3;M1:R =CH 2OH;M2:R =COOHFigure 1Structures of i m recoxib and its mainmetabolites (M1and M2目

8、前國(guó)外已經(jīng)上市的同類藥物有羅非昔布(r ofecoxib、伐地昔布(valdecoxib和依他昔布(et oricoxib等,其結(jié)構(gòu)有一定相似性,主要由CYP2C9及CYP3A4代謝2-4。為探討艾瑞昔布在人體內(nèi)的主要代謝酶,本文利用重組人源CYP酶對(duì)該藥進(jìn)行體外代謝研究,通過(guò)液相色譜2多級(jí)質(zhì)譜(LC2MS n方法檢測(cè)其代謝產(chǎn)物,利用整體歸一化(t otal nor malized rate,T NR法對(duì)參與代謝CYP亞型的作用進(jìn)行評(píng)估,并對(duì)其主要代謝酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步探討。材料與方法藥物代謝重組酶人源重組r CYP2C9, r CYP2C19,r CYP2D6及r CYP3A4購(gòu)自CHT

9、公司(Salt Lake,美國(guó),于-86低溫冰箱內(nèi)保存。藥品和試劑甲苯磺丁脲(t olbutam ide原料藥,由廣州溫泉藥廠提供;氫溴酸右美沙芬(dextr omethor phan原料藥和S2美芬妥英(S2 mephenyt oin原料藥,均由沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥劑教研室提供;鹽酸咪達(dá)唑侖(m idaz ola m注射劑,羅氏有限公司。艾瑞昔布原料藥,純度為9916%;內(nèi)標(biāo)物BAP910原料藥,純度為9915%,均由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司提供。其余重組酶孵育體系試劑為市售分析純,用于LC2MS n分析的試劑為色譜純。美國(guó)Finnigan公司LCQ型液相色譜2質(zhì)譜聯(lián)用儀,配有電噴霧離子化源(ES

10、I離子阱質(zhì)量分析器和日本Shi m adzu LC210AD高效液相輸液泵及Xcalibur111數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);-86低溫冰箱(日本三洋。重組酶孵育體系重組酶孵育體系介質(zhì)為磷酸鹽緩沖液,濃度為100mmolL-1,pH714,含有重組酶50nmolL-1,因艾瑞昔布不溶于水,孵育時(shí)加入甲醇溶液,終濃度為5molL-1,有機(jī)相為最終體系的011%(v/v,以加入1mmolL-1NADPH起始反應(yīng),最終體積為200L。在37水浴中孵育,反應(yīng)至一定時(shí)間以等體積的冰冷甲醇終止反應(yīng)。每次孵育均為雙樣本。重組CY P酶活力檢測(cè)r CYP2C9酶活力檢測(cè)用CYP2C9探針?biāo)幬锛妆交嵌‰鍨榈孜?底物濃度為10

11、0molL-1,其余條件同重組酶孵育體系,LC2MS n法以負(fù)離子方式檢測(cè)產(chǎn)物42羥基甲苯磺丁脲生成速率,作為r CYP2C9酶活指標(biāo)。r CYP2C19酶活力檢測(cè)用CYP2C19探針?biāo)幬颯2美芬妥英為底物,底物濃度為100molL-1,LC2 MS n法以正離子方式檢測(cè)42羥基代謝物生成速率。r CYP2D6酶活力檢測(cè)用CYP2D6探針?biāo)幬镉颐郎撤覟榈孜?底物濃度為5molL-1,LC2MS n法以正離子方式檢測(cè)產(chǎn)物O2去甲基代謝物生成速率。r CYP3A4酶活力檢測(cè)用CYP3A4探針?biāo)幬镞溥_(dá)唑侖為底物,底物濃度為5molL-1,LC2MS n法以正離子方式檢測(cè)產(chǎn)物12羥基咪達(dá)唑侖生成速率。

12、重組酶對(duì)艾瑞昔布代謝能力的測(cè)定艾瑞昔布在孵育體系中的終濃度為5molL-1,分別與r CYP2C9,r CYP2C19,r CYP2D6和r CYP3A4在37水浴中孵育,各種酶終濃度均為50nmolL-1,用LC2MS n法測(cè)定艾瑞昔布42羥基代謝產(chǎn)物M1生成速率。LC2M S n法檢測(cè)M1質(zhì)譜條件:電噴霧離子化源,正離子方式檢測(cè)。離子源噴射電壓:415k V;毛細(xì)管溫度:200;毛細(xì)管電壓:13V;鞘氣流速: 1105Lm in-1;輔助氣流速:0115Lm in-1;用一級(jí)全掃描方式、二級(jí)全掃描方式和選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式。色譜條件:色譜柱為D ia monsil C18柱(200mm416m

13、m I D,5m,北京迪馬公司;流動(dòng)相為甲醇2水2甲酸(7525011,v/v/v;柱溫:室溫;流速:015 mLm in-1。酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定根據(jù)文獻(xiàn)5要求,對(duì)艾瑞昔布羥化反應(yīng)的主要代謝酶(代謝程度超過(guò)20% r CYP2C9及r CYP2D6進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)考察,艾瑞昔布在孵育體系中的終濃度范圍為011-40molL-1,測(cè)定M1的生成速率,計(jì)算K m,V max。確證酶濃度與速率成線性酶濃度范圍為5-80nmolL-1,艾瑞昔布濃度為5molL-1進(jìn)行體外孵育,驗(yàn)證酶濃度與反應(yīng)速率是否成線性關(guān)系。結(jié)果1酶活力檢測(cè)對(duì)4種r CYP酶進(jìn)行的酶活力檢測(cè)結(jié)果證實(shí),研究所用的重組酶均具有較強(qiáng)酶活力(表

14、1,滿足本研究的要求。Table1The m on itored acti v iti es of4rCY Psr CYP Pr obe substrate reacti onActivity/pmol p r oductm in-1(pmol P450-1 2C9Tolbuta m ide242hydr oxylati on31912C19(S2Mephenyt oin242hydr oxylati on61782D6Dextr omethor phan2O2demethylati on01543A4M idaz ola m212hydr oxylati on01242主要代謝酶對(duì)艾瑞昔布代

15、謝能力的測(cè)定艾瑞昔布代謝后形成羥化產(chǎn)物M1,檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3。 Figure 2Full scan MS 2s pectra of m /z 386(M1 Figure 3Chr omat ogra m s of i m recoxib (A ,M1(B and BAP910(C,internal standard,I S by selected reacti on monit oring (SR M scan moder CYP2C9和r CYP2D6對(duì)艾瑞昔布羥基化代謝能力的測(cè)定見(jiàn)圖4。艾瑞昔布被r CYP2C9代謝成羥化產(chǎn)物M1的速率為01585pmol m in -1(pmol r

16、 CYP -1,被r CYP2D6代謝成M1的速率為11894pmol m in -1(pmolr CYP -1。艾瑞昔布和r CYP3A4在相同條件下孵育,檢測(cè)計(jì)算M1的形成速率為01136pmol m in -1(pmol r CYP -1(圖略。艾瑞昔布和r CYP2C19在相同條件下孵育60m in,沒(méi)有檢測(cè)到M1形成。3主要代謝酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)由于艾瑞昔布在孵育體系中的溶解上限為40mol L -1,無(wú)法通過(guò)繼續(xù)增大其濃度來(lái)獲得更多的數(shù)據(jù)。所測(cè)得的數(shù)據(jù)利用Eadie 2Hofstee p l ots 法進(jìn)行處理(表2。Table 2Enzy m e k i n eti cs param

17、eters of rCY P2C9and rCY P2D 6r CYP K m /mol L -1V max /pmol m in -1(pmol r CYP -12C9613341682D613164101124驗(yàn)證酶濃度與酶促反應(yīng)速率成線性對(duì)r CYP2C9,r CYP2D6和r CYP3A4進(jìn)行的酶濃度2反應(yīng)速率線性考察,表明這3種酶在5-80n mol L -1,酶濃度與反應(yīng)速率成線性關(guān)系,r CYP2C9酶濃度與反應(yīng)速率見(jiàn)圖5,r CYP2D6和r CYP3A4數(shù)據(jù)未列出。Figure 5Reacti on vel ocities linear with r CYP2C9concen

18、tration A:I ncubati on at 37with 50nmol L -1r CYP2C9and 5mol L -1i m recoxib;B:I ncubati on at 37with 50nmol L -1r CYP2D6and 5mol L -1i m recoxibFigure 4Ti m e course of M1p r oducti on incubated with r CYP2C9and r CYP2D6,separately5TNR法評(píng)估各rCY P酶作用大小在本文所采用的重組酶體系中,發(fā)現(xiàn)r CYP2C9, r CYP2D6和r CYP3A4可代謝艾瑞昔布

19、,利用T NR 法對(duì)其各自作用大小進(jìn)行評(píng)估,結(jié)果見(jiàn)表3。Table3For ma ti on of M1by recom b i n an t CY P prote i n sr CYPM1f or mati onrate a/pmolm in-1(pmolr CYP-1Mean s pecificCYP content b/pmol(mgp r otein-1Nor malized M1for mati on rate/pmolm in-1(mg p r otein-1Percentageof t otalactivity/%2C901585965611662152D611894101819

20、421113A401136108141691614 a:I ncubati on at37with50n molL-1r CYP and5molL-1i m recoxib;b:M ean s pecific content of CYP in native hu man liver m icr os omes5T NR法為一種利用重組CYP酶評(píng)估各種CYP 亞型對(duì)藥物代謝程度大小的方法5,其公式如下:%T NR=pmol/m in/pmol r CYPnpmol mCYPn/mg(pmol/m in/pmol r CYPnpmol mCYPn/mg100討論藥物消除主要以代謝物或以原形物形式

21、排出體外,若主要以代謝物形式進(jìn)行,則代謝情況會(huì)很大程度上影響藥物的使用安全性及藥理作用。藥物代謝中,肝臟中的CYP450酶系對(duì)藥物的氧化代謝占據(jù)主要位置。而某些CYP亞型(如CYP2D6, CYP2C19在人群中呈多態(tài)分布,有顯著的個(gè)體及種族差異,用藥時(shí)應(yīng)考慮到這些差異。采用個(gè)體化用藥能更好地發(fā)揮藥物的作用,減少不良反應(yīng)。某些CYP酶(如CYP2C9可被相應(yīng)藥物誘導(dǎo)或抑制,不恰當(dāng)?shù)穆?lián)合給藥將導(dǎo)致藥物相互作用,引起藥物藥理活性和安全性的改變,例如當(dāng)臨床治療中藥物達(dá)穩(wěn)態(tài)后聯(lián)合使用CYP450誘導(dǎo)劑或抑制劑,則往往需要調(diào)整藥物的劑量,以求獲得最好的臨床效果6。因此對(duì)藥物的CYP代謝酶的確證對(duì)于預(yù)測(cè)藥

22、物之間的相互作用及個(gè)體化用藥都十分重要。進(jìn)行藥物代謝體外研究主要包括亞細(xì)胞水平和細(xì)胞水平,目前以亞細(xì)胞水平研究為主,通常利用肝微粒體進(jìn)行,但人肝微粒體難以獲得,且受捐獻(xiàn)者生理或病理情況影響。近年來(lái),隨著基因工程重組人源CYP純酶的商品化,利用重組CYP進(jìn)行體外藥物代謝研究已成為藥物代謝研究的一個(gè)重要方面,并逐漸發(fā)展成為一種常規(guī)方法。利用T NR法評(píng)估藥物被CYP各亞型代謝程度,所得結(jié)果同抑制實(shí)驗(yàn)、相關(guān)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有較好的一致性。但由于重組酶與真實(shí)的CYP存在一定差別,主要表現(xiàn)在蛋白環(huán)境,與NADPH2還原酶的比例不盡相同,其實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能與人體生理真實(shí)情況有所差異,但仍不失為一種準(zhǔn)確、快速確定藥

23、物CYP代謝亞型的方法4,5。本文通過(guò)體外人源重組CYP酶法確定了艾瑞昔布羥基化代謝酶為CYP2C9,CYP2D6,CYP3A4。在本文實(shí)驗(yàn)條件下利用T NR法對(duì)其各自作用大小做出評(píng)估,由結(jié)果可以看出艾瑞昔布經(jīng)過(guò)多種CYP 亞型代謝,并以CYP2C9為主。同時(shí)使用CYP2C9底物或可誘導(dǎo)或抑制CYP2C9的藥物(如利福平或磺胺苯吡唑時(shí)可能會(huì)對(duì)艾瑞昔布藥效產(chǎn)生一定影響5;艾瑞昔布在人體內(nèi)代謝迅速,也可能是在肝中被多種CYP亞型廣泛代謝及在腸道中被CYP3A4代謝所致。References1Bai AP,Guo Z R,Hu WH,et al.Design,synthesis andin vitro evaluati on of a new class of novel cycl ooxygenase22inhibit ors:3,42diaryl232pyrr olin222onesJ.ChinChe m L ett,2001,12(9:775-778.2Slaughter D,Takenaga N,Lu P,et al.Metabolis m ofr ofecoxib in vitro using hu man liver subcellular fracti onsJ.D rug M etab D i