套細(xì)胞淋巴瘤一例誤診分析

1、套細(xì)胞淋巴瘤一例誤診分析           作者：于慧，徐衛(wèi)，吳雨潔，程月新，仇海榮，張?zhí)K江，盛瑞蘭，李建勇【摘要】  套細(xì)胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma， MCL）是一類(lèi)較少見(jiàn)的非霍奇金淋巴瘤（nonHodgkins lymphoma, NHL），形態(tài)學(xué)方法常難以將其與其他類(lèi)型小細(xì)胞淋巴瘤相鑒別。為了提高對(duì)MCL的認(rèn)識(shí)，報(bào)道1例誤診為濾泡性淋巴瘤（follicular lymphoma, FL）的MCL，總結(jié)該病例臨床資料及實(shí)驗(yàn)室檢查特點(diǎn)。結(jié)果顯示：流式細(xì)胞術(shù)（flow

2、cytometry，F(xiàn)CM）及免疫組織化學(xué)染色檢查符合MCL的特征，細(xì)胞遺傳學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)了包括t(11;14)在內(nèi)的多種染色體異常。結(jié)論： MCL為難以確診的疾病，間期熒光原位雜交、多重?zé)晒庠浑s交、FCM以及免疫組織化學(xué)染色等檢查有助于MCL的診斷。 【關(guān)鍵詞】  套細(xì)胞淋巴瘤   A Case Report of  Misdiagnosed Mantle Cell Lymphoma   Abstract   Mantle cell lymphoma (MCL) is a rare group of nonHodg

3、kins lymphoma (NHL), which is difficult to discriminate from other subtype of small lymphocytic lymphoma in morphologic appearance. In order to enhance the understanding of MCL,  a case of MCL  first diagnosed as follicular lymphoma (FL) was reported. The clinical and laboratory  char

4、acteristics of MCL were analyzed and summarized. The results showed that the findings of flow cytometry (FCM) and immunohistochemical staining technique were compatible with the diagnosis of MCL. Cytogenetic analysis can detect  multiple types of chromosomal abnormalities, including t(11;14). I

5、n conclusion, MCL is a disease which diagnosis  is difficultly  confirmed.  Interphase fluorescence in situ hybridization, multiplex fluorescence in situ hybridization, FCM and immunohistochemical staining technique play  important roles in the diagnosis of MCL.   Key w

6、ords   mantle cell lymphoma; IFISH; MFISH; FCM    套細(xì)胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma， MCL）是1994年于歐美淋巴瘤修訂分類(lèi)（revised European American lymphoma， REAL）中提出的一個(gè)獨(dú)特的病理類(lèi)型1，為較少見(jiàn)的一類(lèi)非霍奇金淋巴瘤（nonHodgkins lymphoma， NHL），占NHL的2-10。在Kiel分類(lèi)中歸為生發(fā)中心細(xì)胞淋巴瘤，在工作分類(lèi)中歸為小細(xì)胞與大細(xì)胞混合性淋巴瘤或彌漫型小裂細(xì)胞淋巴瘤，但不明確的濾泡部分常被誤診為

7、濾泡性淋巴瘤（follicular lymphoma， FL）或反應(yīng)性淋巴濾泡增生。細(xì)胞遺傳學(xué)特點(diǎn)是t(11;14)(q13;q32)，由11號(hào)染色體的Bcl1基因（11q13）易位到14號(hào)染色體免疫球蛋白重鏈（immunoglobulin heavy chain， IgH）基因啟動(dòng)子的下游，從而導(dǎo)致Bcl1基因表達(dá)的上調(diào)。Bcl1基因的易位導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1，CCND1）mRNA過(guò)度表達(dá)，最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖的調(diào)控紊亂。臨床過(guò)程呈進(jìn)展型，侵襲性強(qiáng)，預(yù)后較差，中位生存期為3-5年2。近來(lái)我科收治1例患者，外院誤診為FL，在我院經(jīng)過(guò)熒光原位雜交（fluorescence in

8、situ hybridization， FISH）以及流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry， FCM）檢測(cè)確診為MCL，現(xiàn)報(bào)告如下。   材料和方法   病例資料   患者，男，58歲，2005年1月體檢B超發(fā)現(xiàn)后腹膜淋巴結(jié)腫大。增強(qiáng)CT、MRI顯示：兩下肺結(jié)節(jié)影，縱隔淋巴結(jié)腫大；腹腔及后腹膜淋巴結(jié)腫大，胰腺周?chē)案怪鲃?dòng)脈旁、肝門(mén)處見(jiàn)多個(gè)大小不等的低回聲，周?chē)逦畲笾睆?.9 cm × 5.3 cm，部分內(nèi)部回聲不均，脾臟腫大，膀胱直腸間類(lèi)圓形軟組織影。外院行腹腔淋巴結(jié)切除活檢術(shù)，術(shù)后病理檢查顯示： FL（I級(jí)）；免

9、疫組織化學(xué)檢查顯示： CD79+、CD20+、CD43+，CD3-、Bcl2+、Bcl6-、CD10-、CCND1+、CD5-。2005年2月以MACOP（米托蒽醌、阿糖胞苷、環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿和潑尼松）方案化療，2005年3月復(fù)查，CT顯示兩下肺結(jié)節(jié)絮狀影有所進(jìn)展，縱隔淋巴結(jié)仍腫大，轉(zhuǎn)至其他醫(yī)院病理切片會(huì)診顯示： FL（I級(jí)），免疫組織化學(xué)檢查顯示：CD79+、CD20+、CD43+、Bcl2+、Bcl6-、CD10-、CCND1+，背景細(xì)胞CD3+、CD5+。2005年3月-2006年1月采用FND（福達(dá)華、米托蒽醌和地塞米松）方案化療，共計(jì)8療程，期間多次復(fù)查CT顯示部分病灶有所吸收，部

10、分增大，并出現(xiàn)左頸根部、左腋下淋巴結(jié)腫大。2005年8月中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志  J Exp Hematol 2007; 15(5)套細(xì)胞淋巴瘤一例誤診分析常規(guī)骨髓檢查未見(jiàn)異常。2006年3月患者出現(xiàn)四肢游走性疼痛，4月復(fù)查CT顯示：左中下頸、左側(cè)鎖骨上及左側(cè)腋窩淋巴結(jié)較前增大、增多，兩肺浸潤(rùn)灶較前有所縮小，脾腫大。骨ECT顯示：兩肱骨中段、兩股骨中段、左側(cè)坐骨腫瘤骨轉(zhuǎn)移?；颊呒膊∵M(jìn)展，于2006年4月26日轉(zhuǎn)至我院。我院病理報(bào)告顯示： FL（I-級(jí)），入院體檢為：輕度貧血貌，皮膚黏膜無(wú)瘀點(diǎn)瘀斑，淺表淋巴結(jié)未捫及，胸骨無(wú)壓痛，心肺無(wú)異常，腹平軟，肝未及，脾肋下2 cm。骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)：有

11、核細(xì)胞增生明顯活躍，原始淋巴細(xì)胞22.8%，幼稚淋巴細(xì)胞10.0%，成熟淋巴細(xì)胞4.0%；原幼細(xì)胞過(guò)氧化物酶（POX）和糖原染色（PAS）染色陰性。外周血白細(xì)胞16×109/L，原始淋巴細(xì)胞11%，幼稚淋巴細(xì)胞11%，成熟淋巴細(xì)胞38%，血紅蛋白 85 g/L，血小板 160×109/L。   常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)（conventional cytogenetics， CC）分析   取骨髓5 ml肝素抗凝，有核細(xì)胞計(jì)數(shù)后按(1-2)×106/ml進(jìn)行直接法和（或）短期培養(yǎng)法制備染色體并采用R顯帶技術(shù)進(jìn)行核型分析。染色體核型按照人

12、類(lèi)細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制（ISCN 2005）描述。   間期FISH檢測(cè)t(11;14)   探針來(lái)源  間期FISH探針購(gòu)自美國(guó)Vysis公司。該探針是分別用熒光素SpectrumGreenTM標(biāo)記的IgH和用SpectrumOrangeTM標(biāo)記的CCND1探針的混合物。   方法  參照文獻(xiàn)步驟2。   結(jié)果分析  應(yīng)用Leica DMRA2型熒光顯微鏡在DAPI/FITC/TexasRed三色濾光鏡激發(fā)下觀察間期細(xì)胞熒光雜交信號(hào)：無(wú)t(11;14)(q13;q32)異常的間期細(xì)

13、胞核內(nèi)出現(xiàn)兩個(gè)紅色信號(hào)和兩個(gè)綠色信號(hào)（2R2G）。有t(11;14)(q13;q32)異常的間期細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)綠色和紅色相互靠近或疊加產(chǎn)生的黃色融合信號(hào)（F）。每個(gè)病例計(jì)數(shù)200個(gè)間期細(xì)胞。   MFISH分析   探針來(lái)源  MFISH探針購(gòu)自美國(guó)Vysis公司。此探針是經(jīng)流式細(xì)胞儀分選、顯微切割后經(jīng)DOPPCR擴(kuò)增的全染色體涂抹探針，應(yīng)用5種熒光素的不同組合經(jīng)缺口平移法標(biāo)記，5種熒光素包括SpectrumGoldTM、SpectrumFRedTM、SpectrumAquaTM、SpectrumRedTM和SpectrumGreenTM。

14、60;  步驟  標(biāo)本處理、圖像采集及分析方法參照文獻(xiàn)步驟3。   FCM免疫表型分析   取肝素抗凝的新鮮（6小時(shí)內(nèi)）抽取的骨髓，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至（0.5-1.0）×106/ml，取100 l經(jīng)直接免疫熒光標(biāo)記法標(biāo)記，避光15分鐘后上溶血?jiǎng)┤芙饧t細(xì)胞。流式細(xì)胞儀（BeckmanCoulter公司產(chǎn)品，Epics XL型，USA，488nm激發(fā)波長(zhǎng)，采用Expo32 ADC分析軟件）檢測(cè)至少10 000個(gè)細(xì)胞，F(xiàn)S/SS雙參數(shù)設(shè)門(mén)，分析淋巴細(xì)胞群不同抗原的表達(dá)情況，膜單克隆抗體包括有CD5、CD19、CD20、CD23（購(gòu)自法國(guó)

15、Immunotech公司）。結(jié)果判斷以抗原表達(dá)20為陽(yáng)性。   結(jié)   果   FCM檢測(cè)結(jié)果   原幼淋巴細(xì)胞占39.9%，其表達(dá)為CD19+ 90%，二次設(shè)門(mén)（CD19+細(xì)胞表達(dá)）CD5+ 89.5%，CD20+ 100%，CD23-。   CC檢查結(jié)果   92,XXYY,7q+×2,9q+×2,t(11;14)×2,13q+×2,15q+×22/46,XY8。   間期FISH檢查結(jié)果 &

16、#160; t(11;14)陽(yáng)性細(xì)胞占24%，其中3R3G3F 16%，4R3G2F 4%，2R2G3F 4%（圖1）。   Figure 1.   t (11; 14) positive cells shown by FISH.            MFISH檢查結(jié)果   綜合上述FCM、CC、IFISH和MFISH結(jié)果，結(jié)合外院淋巴結(jié)免疫組織化學(xué)CCND1+、CD43+、CD10-，診斷此患者為MCL（IV期A組）。于2006年5

17、月初開(kāi)始HyperCVAD A方案（環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿、阿霉素、地塞米松）及B方案（阿糖胞苷和甲氨蝶呤）交替化療，每周期2次腰穿鞘注甲氨蝶呤、阿糖胞苷和地塞米松治療，共計(jì)進(jìn)行4療程化療。5月26日復(fù)查骨髓：原幼淋占0.8%。FCM未見(jiàn)微小病灶殘留（minimal residual disease， MRD）。FISH 結(jié)果：t(11;14)陽(yáng)性細(xì)胞：0/200。2006年8月復(fù)查CT顯示：左腋窩淋巴結(jié)、縱隔淋巴結(jié)、腹膜后淋巴結(jié)均明顯縮小，脾臟亦有所縮小，但仍超過(guò)正常大小，肺部病灶明顯吸收。   討   論   MCL因其獨(dú)特的細(xì)胞來(lái)源

18、、病理形態(tài)、免疫表型和分子生物學(xué)特征而成為WHO NHL分類(lèi)中獨(dú)立的一種類(lèi)型。MCL起源于濾泡套內(nèi)層中未受抗原刺激的CD5+CD23-周?chē)訠細(xì)胞，擁有B細(xì)胞的免疫標(biāo)記： CD19+、CD20+、CD22+、CD43+、CD79+、sIgM+，并過(guò)度表達(dá)CD5+、FMC7+、Bcl2+，但CD3-、CD10-、CD23-、Bcl6-，CD5+有助于MCL與FL區(qū)別。CCND1+幾乎存在于每例MCL中，而在慢性淋巴細(xì)胞白血病/小淋巴細(xì)胞淋巴瘤（chronic lymphocytic leukemia/small lymphocytic lymphoma，CLL/SLL）及其它NHL很少見(jiàn)5。通過(guò)

19、遺傳學(xué)和免疫學(xué)方法檢測(cè)t(11;14)(q13;q32)和CCND1表達(dá)可作為區(qū)別MCL和其他小B細(xì)胞性淋巴瘤的重要手段6。   在MCL、FL、CLL/SLL和邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤等小B細(xì)胞淋巴瘤中，組織病理學(xué)形態(tài)有時(shí)有重疊，而套細(xì)胞淋巴瘤對(duì)治療反應(yīng)性差，5年生存率僅為11%7，因此必須與其他小B細(xì)胞淋巴瘤作鑒別。有時(shí)MCL的結(jié)節(jié)性病灶極類(lèi)似于FL的腫瘤性濾泡，單從形態(tài)上很難鑒別，因此鑒別兩者需把組織學(xué)、免疫組織化學(xué)和分子遺傳學(xué)綜合考慮。由于免疫組織化學(xué)檢測(cè)易受到多種技術(shù)性與人為因素以及抗體特異性與敏感性不足的影響，因此其結(jié)果始終是HE組織學(xué)改變的輔助與補(bǔ)充，不能脫離組織學(xué)

20、改變?nèi)ピu(píng)價(jià)免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果，我們認(rèn)為免疫組織化學(xué)結(jié)果與組織學(xué)特點(diǎn)相一致才可以肯定。尤其是淋巴瘤的診斷，最基本的是確切、充分的組織學(xué)依據(jù)，免疫組織化學(xué)檢測(cè)只能作為分型與鑒別診斷的輔助手段。此病例雖然免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果CCN1+，但先后兩次CD5結(jié)果不一致，而淋巴結(jié)病理形態(tài)與FL高度符合，鑒于上述原因，三家醫(yī)院病理科診斷為FL。先后以MACOP方案1次及FND方案8次化療，均無(wú)明顯療效，病情進(jìn)展，轉(zhuǎn)至我院后FCM顯示CD5+、CD19+、CD20+、CD23-、CC、間期FISH和MFISH檢測(cè)均有t(11;14)異常，盡管病理學(xué)診斷為FL，但結(jié)合病史特點(diǎn)以及免疫表型特征和分遺傳學(xué)結(jié)果確診為

21、MCL。   t(11;14)易位導(dǎo)致了CCND1的表達(dá)異常。Monteil等8在1996年首次采用間期FISH檢測(cè)MCL中t(11;14)(q13;q32)?，F(xiàn)FISH已經(jīng)作為國(guó)外日常病理輔助診斷MCL的首選方法9。PCR只能檢測(cè)出11q13上主要易位簇（major translocation cluster, MTC）內(nèi)有限區(qū)域上（大約幾百個(gè)bp）的斷裂點(diǎn)，落在距離主要易位簇以外大約100 kb的次要易位簇（minor translocation cluster, mTC）內(nèi)的斷裂點(diǎn)，由于PCR技術(shù)上的局限性而不能完整的擴(kuò)增出如此長(zhǎng)的片段。FISH敏感性高的原因是其所用

22、的CCND1探針雜交的目的片段包括了11q13上MTC、CCND1等大約350 kb大小的區(qū)域，明顯提高了易位檢出率10。本研究中，骨髓細(xì)胞采用FISH檢測(cè)到t(11;14)(q13;q32)。   間期FISH只能用特異性的探針檢測(cè)已知的染色體異常，且通常一次雜交只能檢測(cè)一種至數(shù)種染色體異常。MFISH不僅可以確定CC發(fā)現(xiàn)的核型異常，包括染色體易位、大片段缺失、不明來(lái)源的額外物質(zhì)的增加、衍生染色體和標(biāo)記染色體，而且還可以發(fā)現(xiàn)CC分析未發(fā)現(xiàn)的異常，糾正CC分析中的錯(cuò)誤，對(duì)檢測(cè)未知核型異常很有幫助。本例患者CC與MFISH檢查示近四倍體，染色體條數(shù)稍有差別可能和不同的分裂像有

23、關(guān)，CC僅見(jiàn)t(11;14)伴7q+,9q+,13q+,15q+,而MFISH發(fā)現(xiàn)了6、7、9、13、14、22號(hào)衍生染色體，t(7;9)，t(9;15)，t(3;13)，t(11;14)，t(4;22)易位及11號(hào)染色體片段缺失等多種染色體異常，11號(hào)染色體片段缺失可能與易位的14號(hào)片段丟失或其片段很小有關(guān)。   近來(lái)人們利用比較基因組雜交（comparative genomic hybridization，CGH）技術(shù)顯示MCL的基因突變。deLeenw等11用基因芯片技術(shù)分析8例MCL細(xì)胞系（G519、HBL2、NCEB1、Rec1、SP49、UPN1、Z138C和J

24、VM2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)平均每個(gè)細(xì)胞有35種基因改變，其中14種為基因缺失、21種為基因擴(kuò)增，18q21/Bcl2和13q31/GPC5異常擴(kuò)增和9p21缺失多見(jiàn)，重要的是發(fā)現(xiàn)了位于2p11和22q11上的免疫球蛋白輕鏈基因等新的位點(diǎn)的缺失，這些新位點(diǎn)的變化對(duì)研究MCL很有意義。Jarosova等12利用CGH分析30例確診的MCL，80%的患者有不穩(wěn)定的異常染色體變化。常見(jiàn)的缺失有1p、8p、9q、11q、13q和17p，約1/4的病例3號(hào)染色體有附加異常。   Ott等13用FISH及CC方法研究發(fā)現(xiàn)，大約30的MCL可檢測(cè)到染色體四倍體克隆，且在母細(xì)胞樣型MCL出現(xiàn)率明顯增

25、高（80）。由于四倍體染色體異常在其它B細(xì)胞NHL現(xiàn)象少見(jiàn)，可作為MCL遺傳學(xué)特征之一。本研究結(jié)果提示，對(duì)少見(jiàn)復(fù)雜表現(xiàn)的小細(xì)胞淋巴瘤可以先借助組織學(xué)和免疫組織化學(xué)染色來(lái)診斷大部分的病例。不能鑒別時(shí)，采用FCM檢測(cè)、間期FISH、MFISH等方法尤為重要。   Khouri等14報(bào)道45例MCL患者予HyperCVAD方案化療4周期化療后總體有效率93.5，其中完全緩解(CR) 38，部分緩解(PR)55.5。所有隨后進(jìn)行移植的患者均達(dá)CR。25例初治的患者3年總體生存率(OS)和無(wú)事件生存率(EFS)分別為92和72，而曾經(jīng)接受過(guò)治療的患者其OS和EFS則分別為25和17。與經(jīng)典的CHOP類(lèi)似方案相比， HyperCVAD方案的3年EFS及OS亦顯著增高。認(rèn)為HyperCVAD方案后進(jìn)行干細(xì)胞移植是治療初診MCL患者的有