固相萃取差示脈沖伏安法測(cè)定牛黃解毒片的黃芩苷

1、固相萃取差示脈沖伏安法測(cè)定牛黃解毒片的黃芩苷 【摘要】 目的研究黃芩苷在玻碳電極上的伏安行為,建立牛黃解毒片中黃芩苷的含量測(cè)定方法。方法Waters PlusC18(1 mL/50 mg,30 m)固相萃取柱進(jìn)行樣品前處理,采用循環(huán)伏安法與差示脈沖伏安法研究黃芩苷在玻碳電極上的伏安行為。結(jié)果用20%甲醇1.0 mL能完全洗脫黃芩苷;在pH 3.0磷酸鹽緩沖溶液中,黃芩苷的差示脈沖伏安峰電流與其濃度在110-6910-5 mol/L呈良好的線性關(guān)系,檢測(cè)限為110-7mol/L。結(jié)論本法簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì),靈敏度高,用于牛黃解毒片中黃芩苷的含量測(cè)定效果滿意。 【關(guān)鍵詞】 電化學(xué) 色譜法 固相萃取 牛黃解

2、毒丸 黃芩苷 牛黃解毒片為常見(jiàn)清熱解毒中藥制劑,其處方由牛黃、雄黃、石膏、大黃、黃芩、桔梗、冰片和甘草8味中藥組成。方中黃芩瀉火解毒,黃芩苷為其主要有效成分之一。因此,中國(guó)藥典(2005版)采用高效液相色譜法1分析牛黃解毒片中的黃芩苷成分以控制牛黃解毒片的質(zhì)量,該法準(zhǔn)確,但費(fèi)時(shí),所需儀器設(shè)備昂貴。已有文獻(xiàn)報(bào)道采用紫外分光光度法、高效毛細(xì)管電泳法等方法測(cè)定方劑中黃芩苷的含量2 3,但樣品前處理大多涉及到溶劑多次萃取過(guò)程,操作較復(fù)雜且準(zhǔn)確度和精密度不好?？紤]到黃芩苷分子中的酚羥基結(jié)構(gòu)具有電化學(xué)活性,可利用電化學(xué)分析手段對(duì)其進(jìn)行微量和特異性的檢測(cè)。筆者研究黃芩苷在玻碳電極(GCE)上的循環(huán)伏安和差示

3、脈沖伏安行為,建立其差示脈沖伏安測(cè)定法。 1材料和方法 1.1儀器電化學(xué)分析儀(CHI660B，上海辰華儀器公司);精密酸度計(jì)(pHS3B型，上海雷磁儀器廠);醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器(KQ250DE型，昆山市超聲儀器有限公司);Waters PlusC18固相萃取小柱(1 mL/50 mg,30 m),柱材料為十八烷基鍵合硅膠(美國(guó)Waters公司)。 1.2試劑無(wú)水乙醇、甲醇及磷酸(AR,安徽安特生物化學(xué)有限公司);牛黃解毒片(北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠,規(guī)格片心重0.27 g,批號(hào):4122356,6121877,6120617);110-3mol/L黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取黃芩苷

4、對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)5 mg,用70%乙醇溶液溶解并定容于10 mL容量瓶,避光保存;磷酸鹽緩沖液(PBS)由0.05 mol/L NaH2PO4Na2HPO4+0.02 mol/L NaCl配制,并用H3PO4與0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)至所需pH值;所用試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。 1.3方法 1.3.1電極預(yù)處理以飽和甘汞電極為參比電極(以下所述電位均相對(duì)于該電極),鉑絲電極為對(duì)電極,玻碳電極(GCE)為工作電極。玻碳電極依次用金相砂紙和0.05 m氧化鋁粉末和水的混合物拋光至鏡面,然后依次用11乙醇和二蒸水超聲清洗,取出后待用;實(shí)驗(yàn)前,測(cè)定系統(tǒng)用2 mmol

5、/L K3Fe(CN)6水溶液校準(zhǔn),電位測(cè)量誤差為0.004 V,全部實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行。 1.3.2黃芩苷循環(huán)伏安行為采用三電極系統(tǒng),以飽和甘汞電極為參比電極(以下所述電位均相對(duì)于該電極),鉑絲電極為對(duì)電極,以GCE為工作電極,在-0.2-0.8 V電位研究黃芩苷的循環(huán)伏安行為,并考察掃描速度、溶液pH等因素對(duì)黃芩苷電化學(xué)氧化的影響。 1.3.3差示脈沖伏安法測(cè)定黃芩苷用 0.05 mol/L PBS作為媒介溶液,在-0.2-0.8 V電位測(cè)定黃芩苷的差示脈沖伏安曲線,記錄氧化峰電流值,并用空白溶液進(jìn)行背景校正。 1.3.4固相萃取分離純化樣品將牛黃解毒片20片原藥除去外殼黃色包衣后研成粉末。

6、準(zhǔn)確稱取試樣0.6 g于錐形瓶中,加70%乙醇30 mL,超聲處理20 min,放冷,濾過(guò),濾液置100 mL量瓶中,用少量70%乙醇分次洗滌容器和殘?jiān)?洗液濾入同一量瓶中,加70%乙醇至刻度,搖勻,待用。用甲醇1 mL活化SPE柱后,再用二蒸水0.5 mL平衡固定相,速度為每秒1滴。將上述處理好的試樣加到SPE柱上,每次上樣200 L,再用二蒸水200 L作為洗脫溶劑洗脫,用注射器盡量吹出SPE柱中的洗脫溶劑,最后用25%甲醇1 mL將黃芩苷洗脫,收集洗脫液約1.0 mL。 1.3.5固相萃取洗脫條件選擇與萃取回收率以高、中、低3個(gè)濃度(110-5,310-5,510-5 mol/L)的黃芩

7、苷標(biāo)準(zhǔn)溶液為研究對(duì)象,均于固相萃取柱上上樣200 L,分別使用0.5%,10%,25%,40%,60%,80%,100%甲醇水溶液各1 mL進(jìn)行洗脫。記錄黃芩苷色譜帶完全流出所需的時(shí)間和體積,采用高效液相色譜法測(cè)定黃芩苷含量并計(jì)算其回收率8,以萃取回收率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。 2結(jié)果 2.1黃芩苷在玻碳電極上的循環(huán)伏安行為在pH 3.0 PBS溶液中,以2.010-5 mol/L黃芩苷為分析對(duì)象,其在玻碳電極上的氧化峰電位(Epa)為0.420 V,還原峰電位(Epc)為0.395 V,兩峰電位相差25 mV(圖1)。改變?nèi)芤簆H值,記錄黃芩苷在不同pH值中的循環(huán)伏安圖(圖2),計(jì)算各pH溶液中的式量

8、電位E值,將其對(duì)溶液的pH值作圖(圖3),可得一直線,其斜率為-64.7 mV/pH,此外,在pH 3.0 PBS溶液中,隨著掃描速度從20 mV/s增加到140 mV/s,其氧化峰電流(Ip)明顯增大,且Ip與掃描速度(v)呈良好的線性關(guān)系(圖4)。 A:黃芩苷; B:空白溶液.掃描速率:100 mV/s. 圖1循環(huán)伏安曲線 Fig 1Cyclic voltammograms of baicalin with a scan rate of 100 mV/s 2.2電化學(xué)檢測(cè)體系工作條件的選擇影響伏安法測(cè)定靈敏度和分辨率的主要因素一般有伏安法的類型、酸度,掃描電位等因素。以黃芩苷的氧化峰為測(cè)定

9、對(duì)象,優(yōu)化選擇測(cè)定實(shí)驗(yàn)條件。 2.2.1方法應(yīng)用循環(huán)伏安法(CV),線性掃描伏安法(LSV),方波伏安法(SWV)和差示脈沖伏安法(DPV)等對(duì)黃芩苷的PBS(pH 3.0)溶液在玻碳電極(GCE)上的電化學(xué)進(jìn)行比較。在相同的測(cè)定條件 pH a:2.0;b:3.0;c:4.0;d;5.0;e:6.0;f:7.0;g:8.0.掃描速率:100 mV/s. 圖2黃芩苷在不同pH值溶液中的循環(huán)伏安曲線 Fig 2Cyclic voltammograms of baicalin at GCE with pH 圖3pH對(duì)黃芩苷式量電位的影響 Fig 3The effect of E (baicalin)