雙向凝膠電泳

1、雙向凝膠電泳（2-DE）雙向凝膠電泳的原理是第一向基于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同用等電聚焦分離，第二向則按分子量的不同用SDS-PAGE分離，把復(fù)雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分開(kāi)。近年來(lái)經(jīng)過(guò)多方面改進(jìn)已成為研究蛋白質(zhì)組的最有使用價(jià)值的核心方法。分離蛋白質(zhì)組所有蛋白的兩個(gè)關(guān)鍵參數(shù)是其分辨率和可重復(fù)性。在目前情況下，雙向凝膠電泳的一塊膠板（16cm×20cm）可分出34千個(gè)，甚至1萬(wàn)個(gè)可檢測(cè)的蛋白斑點(diǎn)，這與10萬(wàn)個(gè)基因可表達(dá)的蛋白數(shù)目相比還是太少了。80年代開(kāi)始采用固定化pH梯度膠，克服了載體兩性電解質(zhì)陰極漂移等許多缺點(diǎn)而得以建立非常穩(wěn)定的可以隨意精確設(shè)定的pH梯度。由于可以建立很窄的pH

2、范圍（如0.05U/cm)，對(duì)特別感興趣的區(qū)域可在較窄的pH范圍內(nèi)做第二輪分析，從而大大提高了分辨率。此種膠條已有商品生產(chǎn)，因此基本上解決了雙向凝膠電泳重復(fù)性的問(wèn)題。這是雙向凝膠電泳技術(shù)上的一個(gè)非常重要的突破。第二向SDS-PAGE有垂直板電泳和水平超薄膠電泳兩種做法，可分離10100kD分子量的蛋白質(zhì)。其中靈敏度較高的銀染色法可檢測(cè)到4ng蛋白，最靈敏的還是用同位素標(biāo)記，20ppm的標(biāo)記蛋白就可通過(guò)其熒光或磷光的強(qiáng)度而測(cè)定。用圖像掃描儀、萊賽密度儀、電荷組合裝置可把用上述方法得到的蛋白圖譜數(shù)字化，再經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)處理，去除縱向和橫向的曳尾以及背景底色，就可以給出所有蛋白斑點(diǎn)的準(zhǔn)確位置和強(qiáng)度，得到

3、布滿蛋白斑點(diǎn)的圖像，即所謂“參考膠圖譜”。蛋白質(zhì)組研究的主要困難是對(duì)用雙向凝膠電泳分離出來(lái)的蛋白，進(jìn)行定性和定量的分析。最常用的方法是先把膠上的蛋白印跡到PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上后再進(jìn)行分析，確定它們是已知還是未知蛋白?，F(xiàn)在的分級(jí)分析法是先做快速的氨基酸組成分析，也可先做45個(gè)循環(huán)的N末端微量測(cè)序，再做氨基酸組成分析；結(jié)合在電泳膠板上估計(jì)的等點(diǎn)電和分子量，查對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中已知蛋白的數(shù)據(jù)，即可作出判斷。有文獻(xiàn)報(bào)道，N末端4個(gè)殘基序列的數(shù)據(jù)就可以給出很多的信息而得到相當(dāng)準(zhǔn)確的結(jié)果。如再結(jié)合C末端序列，判斷結(jié)果的準(zhǔn)確性會(huì)更高。對(duì)分離得到的蛋白質(zhì)作進(jìn)一步的確切鑒定

4、需要有足夠數(shù)量的純蛋白，電泳時(shí)蛋白質(zhì)已經(jīng)過(guò)了高度純化?，F(xiàn)在一塊膠板可允許上到高達(dá)mg數(shù)量級(jí)的樣品，因此每個(gè)分離的蛋白斑點(diǎn)可有g(shù)數(shù)量的蛋白，這樣使本來(lái)是微量的蛋白也可希冀被鑒定。蛋白質(zhì)的翻譯后修飾和加工，是指在肽鏈合成完成后進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)，如磷酸化、羥基化、糖基化、二硫鍵形成，以及最近發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)自剪接等等，可能有一百種以上。翻譯后修飾和加工對(duì)蛋白質(zhì)的正常生理功能是必需的，它們的變化往往和疾病的發(fā)生有關(guān)。用雙向凝膠電泳可以進(jìn)行翻譯后修飾的研究，如用32P標(biāo)記可以研究磷酸化蛋白的變化。雙向凝膠電泳中?？砂l(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)拖曳現(xiàn)象，很可能是一個(gè)蛋白的不同翻譯后修飾產(chǎn)物所造成的。拖曳圖像變化在疾病診斷上可能

5、提供重要的信息。雙向凝膠電泳技術(shù)當(dāng)前面臨的挑戰(zhàn)是：(1)低拷貝蛋白的鑒定。人體的微量蛋白往往還是重要的調(diào)節(jié)蛋白。除增加雙向凝膠電泳靈敏度的方法外，最有希望的還是把介質(zhì)輔助的激光解吸/離子化質(zhì)譜用到PVDF膜上，但當(dāng)前的技術(shù)還不足以檢出拷貝數(shù)低于1000的蛋白質(zhì)。(2)極酸或極堿蛋白的分離。(3)極大（200kD）或極?。?0kD蛋白的分離。(4)難溶蛋白的檢測(cè)，這類(lèi)蛋白中包括一些重要的膜蛋白。(5)得到高質(zhì)量的雙向凝膠電泳需要精湛的技術(shù)，因此迫切需要自動(dòng)二維電泳儀的出現(xiàn)。雙向電泳操作方法1 蛋白質(zhì)樣品制備 秧苗蛋白質(zhì)樣品的提取按Davermal 等（1986）的方法進(jìn)行。100mg 材料剪碎后

6、加入10mgPVP-40(聚乙烯 吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10% 三氯乙酸（丙酮配制，含10mM 即0.07%- 巰基乙醇），混勻，-20沉淀1 小時(shí)，4，15000 r/min離心15 min，棄上清，沉淀復(fù)溶于1.5ml冷丙酮(含10 mM-巰基乙醇)，再于-20沉淀1小時(shí)，同上離心棄上清，（有必要再用80丙酮(含10 mM-巰基乙醇所得沉淀低溫冷凍真空抽干。 按每mg干粉加入20l（可調(diào)） UKS液9.5 M尿素，5mM 碳酸鉀，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫蘇糖醇)，2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotec

7、h Inc，pH3.5-10)，6% Triton X-100，37育30min，期間攪動(dòng)幾次，28度 （溫度低，高濃度的尿素會(huì)讓溶液結(jié)冰）16000 r/min離心15 min，離心力越大時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)越好！上清即可上樣電泳?；蛘?70度保存 2 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定 按Garrels（1983）的程序，稍加改動(dòng)。10l上述用UKS液制得的蛋白質(zhì)樣品中加入40l 水及50l 20%三氯乙酸，冰浴30min后，4，4000 r/min離心15min，棄上清，再加入100l冷丙酮，同上離心5min，棄上清，凍干沉淀，用100l PBS溶液復(fù)溶，并按Bradford（1976）的程序測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。2.3.

8、1 電聚焦（IEF） 2.3.1.1 玻管準(zhǔn)備 干凈玻管(18cm×1.5mm)用Parafilm封口膜封好底部，在16cm處作好標(biāo)記,垂直放在泡沫板上。電聚焦的管子，買(mǎi)原裝的也可以，實(shí)在不行自己也可以做的，1ml 的移液管，內(nèi)徑1.5mm左右的，長(zhǎng)度取18cm，用玻璃刀做，玻璃管的處理，先用2M 的NaOH 泡 至少 1hr，用自來(lái)水沖后;用雙蒸水沖，用雙蒸水泡至少1hr，中間至少換2，3 次水;后用2M的HCL 泡至少1 個(gè)小時(shí)，用雙蒸水沖，（不能用自來(lái)水沖），然后雙蒸水泡至少1 個(gè)小時(shí)，中間換3，4 次水，可多泡一會(huì)。最后泡在無(wú)水乙醇里 面1hr，烘干就可以用了. 2.3.1.

9、2 凝膠制備與電聚焦 灌IEF的配方 為3.09克尿素 1.125 ml 10%NP-40 1.125ml 水 0.735ml 30%屏息現(xiàn)案 (ACR 28.38 BIS 1.62) 0.15 ml Am 3.5-10 0.375ml Am 5-7 8衛(wèi)生 10%AP 1.8衛(wèi)生 TEMED 用注射器吸好膠液，裝上7號(hào)針頭，將7號(hào)針頭插入玻管底部，邊推注射器邊提針頭，直到標(biāo)記處，用微量進(jìn)樣器小心加入少量水，可見(jiàn)明顯的界面出現(xiàn)，讓其聚合1小時(shí)以上，適當(dāng)長(zhǎng)一點(diǎn)的時(shí)間更好。待膠聚合好后，除去Parafilm并吸去頂部的覆蓋液，加樣80g，上面再小心加入50m mol/L NaOH至管口,不要破壞樣

10、品與NaOH 的界面。即可進(jìn)行電泳。電極液為：上槽（負(fù)極）為50m mol/L NaOH 液，下槽（正極）為25m mol/L H3PO4。按200V×15min，300V× 30min，400V×18h，1000V×1h的程序進(jìn)行電聚焦?；蛘咧苯?00V 17hr 1000V 2hr very important thing is跑第一向一定要在保持在37 度左右，第一向溫度特別重要，不然,電聚焦肯定不好. 2.3.1.3 電泳后的凝條處理 電聚焦完畢后，用注射器吸滿水，套上一個(gè)200l的槍頭，當(dāng)然槍頭與注射器間用parafilm封住防漏氣。從頂部向下

11、注水使膠條向下滑出注射器 槍頭 玻璃管必須為一直線。取一膠條，用雙蒸水洗凈兩端，按酸端到堿端的順序切成0.5cm 的小段，各自浸入含1.3ml 抽氣后雙蒸水的Eppendorf管中過(guò)夜，次日用酸度計(jì)分別測(cè)定各段的pH值，以凝膠長(zhǎng)度為橫坐標(biāo)，pH值為縱坐標(biāo)作圖，即為等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線。漫漫擠,管子,200 衛(wèi)生槍頭,注射器,要成一直線,要用一手扶著管子,一手拿住200 衛(wèi)生槍頭,保證水不從槍頭和管子處流出來(lái), 注射器頂在胸前把膠條擠出后,放在12%TCA里面,在4度可以保存很久，在平衡之前,要用dd water泡30min,而且要換至少5 次水,每次用不同的小平皿。 對(duì)要進(jìn)行第二向SDS-PAGE

12、的膠條則必須用平衡液2.3%SDS，62.5m mol/L Tris-HCL（pH6.8），10%甘油，5%巰基乙醇，0.1%溴酚藍(lán)進(jìn)行二次平衡，第一次20min，第二次25min。第2 次的溶液為新的。平衡過(guò)程中每隔幾min輕輕的晃一下小平皿。 2.3.2 第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE） 分離膠濃度為12%，無(wú)濃縮膠。待膠聚合后，將電聚焦后已經(jīng)平衡的膠條平放于濃縮膠頂端（避免膠條拉直），并用1%瓊脂糖（電極緩沖液配制）封膠，特別應(yīng)注意避免膠條與分離膠上沿產(chǎn)生氣炮。61廠板子之灌膠：堅(jiān)決不用凡士林，用透明膠將兩端（板子的2 邊）封住，再用2%瓊脂之SDS-PAGE 電極液

13、封底，待瓊脂凝固后再灌膠，最后用水封膠。 1，灌膠不會(huì)有任何問(wèn)題，不能漏，2，不用濃縮膠，只用分離膠。3，分離膠用水封，要保證凝聚好的PAGE 膠，為一平的線。用透明膠（約4cm寬），封住兩邊，下面還是用2的瓊脂封。灌好電極緩沖液25m mol/LTris，192m mol/L 甘氨酸及0.1%SDS，按25mA/板膠恒流進(jìn)行電泳，待溴酚蘭離底部1cm時(shí)即可停止電泳，一般電泳耗時(shí)約4-5h。銀染：凝膠于40%甲醇，10%醋酸中固定1h以上或者過(guò)夜；用水洗1次,5min;30%乙醇洗2×20min；水洗6×5min； 0.02%硫代硫酸鈉1min；水洗3×20s；0

14、.2%硝酸銀，0.02%甲醛快速的潤(rùn)洗一次,就是過(guò)一下的意思,到這個(gè)溶液進(jìn)去,馬上又倒掉;0.2%硝酸銀，0.02%甲醛20min；水洗3×20s；顯色液(3%碳酸鈉，0.05%甲醛，0.0005%硫代硫酸鈉)快速的潤(rùn)洗一次,就是過(guò)一下的意思,到這個(gè)溶液進(jìn)去,馬上又倒掉;顯色液(3%碳酸鈉，0.05%甲醛，0.0005%硫代硫酸鈉)顯色到你所希望的程度,自己看,背景好,點(diǎn)又多的話就可以了；水洗20秒；0.05%甘氨酸停顯。染色理想溫度：最好是20 度左右。10%TCA, 0.07%2-ME 丙酮 （100ml）: 100%TCA 10ml 2-ME 0.07ml 丙酮 90ml 0.

15、07%2-ME 丙酮 （100ml）: 2-ME 0.07ml 丙酮 100ml 0 Farrel 液(9.5M Urea,2%NP-40,0.4%Am3.510,1.6%57,5% 2-ME) 50ml Urea 28.5g NP-40 1ml Ampholine 57 2.0ml 3.510 0.5ml 2-ME 2.5ml 定容，配好后用1.5ml 管分裝！-70度保存 UKS液 (含9.5M Urea, 5mMK2CO3,1.25%SDS,0.5%DTT,2%Ampholine(3.510),6%Triton X-100) 25ml 50ml Urea 14.25g 28.5g K2C

16、O3 17.25mg 34.5mg SDS 0.3125g 0.625g DTT 0.125g 0.25g 2-ME Ampholine(3.510) 1.25ml 2.5ml Triton X-100 1.5ml 3ml(0.86ml 2 槍?zhuān)?槍) 2-ME 可適當(dāng)加一些！注意定容！配好后用1.5ml管分裝！-70度保存！ 雙向電泳IPG（summer） 一、樣品提?。喝却姿岜恋矸?（1） 在液氮中研磨葉片 （2） 加入樣品體積3倍的提取液在-20的條件下過(guò)夜，然后離心（48000rpm以上1 小時(shí)）棄上清。 （3） 加入等體積的冰浴丙酮（含0.07%的-巰基乙醇），搖勻后離心（48

17、000rpm以上1小時(shí)），然后 真空干燥沉淀，備用。 （4） 上樣前加入裂解液，室溫放置30 分鐘，使蛋白充分溶于裂解液中，然后離心（158000rpm以上 1小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間以沒(méi)有沉淀為標(biāo)準(zhǔn)），可臨時(shí)保存在4待用。 （5） 用Brandford法定量蛋白，然后可分裝放入-80備用。 二、一向電泳（13cm的holder） （1） 取大約70-100ng的蛋白與溶脹液混合總體積達(dá)到250vl （2） 將上述溶液加到holder 的兩個(gè)電極之間。 （3） 去掉膠條的保護(hù)膜，膠面朝下，先將膠條尖端朝膠條槽的尖端方向放入膠條槽中，慢慢下壓膠條， 并前后移動(dòng)，避免生成氣泡，最后放下膠條平端，使溶液浸濕整

18、個(gè)膠條。 （4） 在膠條上覆蓋適量的覆蓋油，蓋上蓋子。 （5） 將膠條槽平放于一向儀器上，與水平方向垂直。 （6） 設(shè)置儀器的運(yùn)行參數(shù)： 三、膠條的平衡（由一向到二向） （1） 將膠條放入10ml 平衡緩沖液中（加入10mgDTT）封口，在振蕩儀上振蕩15 分鐘。 （2） 將膠條取出放入10ml 新的平衡緩沖液中（加入250mg 的碘乙酰胺）封口，在振蕩儀上振蕩15 分 鐘。 （3） 用去離子水潤(rùn)洗膠條一秒鐘，將膠條的邊緣置于濾紙上幾分鐘，以去除多余的平衡緩沖液。 四、二向電泳 （1） 將平衡好的膠條直接轉(zhuǎn)移到第二向制好的SDS膠上，然后用瓊脂糖封頂，準(zhǔn)備第二向電泳. （2） 設(shè)置儀器的運(yùn)行參

19、數(shù)： 五、平板膠的染色 硝酸銀染色：（整個(gè)操作在搖床上進(jìn)行） （1） 固定：25ml的冰醋酸，100ml甲醇，125ml 去離子水，60 分鐘。 （2） 敏化：75ml甲醇，0.5g硫代硫酸鈉（使用之前加入），17g醋酸鈉，165ml去離子水，30分鐘。 （3） 清洗：用250ml 的去離子水清洗3 次每次5 分鐘。 （4） 銀染：0.625g硝酸銀，250去離子水，（使用之前配制）20 分鐘。 （5） 顯色：6.25g碳酸鈉，100vl 的甲醛（使用之前加入），250ml 去離子水。 （6） 終止：5%的醋酸。 （7） 照相分析。 （8） 保存制作干膠。 藥品： 提取液：含10%TCA 和0

20、.07%的-巰基乙醇的丙酮裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 滅菌的去離子水中（終體積為5ml），使用前再加入1M 的DTT65ul/ml。 平衡緩沖液：1.5MTrisCl ph8.8 6.7ml，尿素72.07g ，87的甘油69ml，SDS 4g，溴酚藍(lán)少許。溶漲液：尿素12g，CHAPS0.5g，溴酚藍(lán)少許溶于無(wú)菌水中，總體積為25ml。使用之前再加入IPG緩沖液0.5vl/100vl，DTT1.5vl/100vl。 制作平板膠： 分離膠的配制方法： 藥品/濃度 5 7.5 10 12.5% 15% 丙烯酰胺 6.7ml 10ml 13.3ml 16.7ml 20ml 分離膠緩沖液 10ml 10ml 10ml 10ml 10ml 10×SDS 0.4ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml 無(wú)菌水 22.7ml 19.4ml 16.1ml 12.8ml 9.5ml 10過(guò)硫酸胺* 200vl 200vl 200vl 200vl 200vl TEMED* 13.3vl 13.3vl 13.3vl 13.3vl 13.3vl *在灌膠之前加入 藥品配制： 丙烯酰胺單體儲(chǔ)液：丙烯酰胺60g甲叉雙丙烯酰胺1.6g溶于無(wú)菌水中總體積200ml分離膠緩沖液：Trisbase181.5g 溶于750ml 無(wú)菌水中調(diào)PH8.8總體積1000m