固相萃取高效液相色譜熒光檢測土壤中喹諾酮類抗生素

1、固相萃取高效液相色譜熒光檢測土壤中喹諾酮類抗生素         11-04-22 15:20:00     編輯：studa20                作者：邰義萍 莫測輝 李彥文 包艷萍 張艷 姚圓 羅曉棟 【摘要】  建立了固相萃取高效液相色譜熒光(HPLCFLD)檢測土壤中4種喹諾酮類抗生素的

2、分析方法。樣品采用50% Mg(NO3)210% NH3·H2O（964，V/V）超聲提取，過HLB柱富集凈化，再用乙腈0.067 mol/L H3PO4溶液洗脫。采用高效液相色譜熒光檢測器，以乙腈0.067 mol/L H3PO4(用三乙胺調(diào)節(jié)至pH 2.5)為流動相，于激發(fā)波長280 nm、發(fā)射波長450 nm處進(jìn)行檢測。土壤樣品中4種喹諾酮類抗生素的加標(biāo)回收率在60.4%99.3%之間，檢出限為0.581.0 g/kg。對蔬菜基地土壤樣品分析結(jié)果表明，本方法能夠滿足實際樣品的分析要求，4種喹諾酮類抗生素均被檢出，土壤中抗生素污染問題值得關(guān)注。 【關(guān)鍵詞】  土壤， 喹

3、諾酮類抗生素， 固相萃取， 高效液相色譜， 熒光檢測1  引言    喹諾酮類抗生素(QNs)大量用于人類和動物醫(yī)療，還添加于飼料中以提高飼料利用率和促進(jìn)動物生長1,2。抗生素攝入后大部分（>85%）以原藥和代謝產(chǎn)物的形式隨糞尿排出體外1，成為新的環(huán)境污染物，并以多種途徑進(jìn)入土壤。其中人用抗生素在城市污水中的濃度高達(dá)10 g/L3，在污水處理過程中其去除率通常較低4，導(dǎo)致大量抗生素進(jìn)入地表水，造成河流抗生素污染5，并通過灌溉水進(jìn)入農(nóng)業(yè)土壤6。規(guī)?；B(yǎng)殖場畜禽廢物（糞尿）中抗生素的濃度高達(dá)0.010.1 g/kg水平7，并作為有機肥廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，

4、每年由此輸入土壤中抗生素的數(shù)量甚至不亞于農(nóng)藥，從而導(dǎo)致土壤抗生素污染，并引發(fā)水體污染，產(chǎn)生耐藥性，危及生態(tài)安全和人體健康8，。    近年來，喹諾酮類抗生素在水體、土壤和畜禽廢物中被普遍檢出，10，但在環(huán)境中主要以痕量存在，在水體中含量通常為108g/L水平1，在養(yǎng)殖場附近底泥中含量可達(dá)104g/kg水平。目前，主要采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(HPLCMS)分析環(huán)境中喹諾酮類抗生素，1，。因儀器昂貴而難以普及，且主要是針對水體進(jìn)行分析。雖然肉奶蛋等動物性食品中抗生素殘留的高效液相色譜分析方法已成熟且有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，但由于土壤與動物性食品間的性質(zhì)差異很大，且土壤中雜質(zhì)更為復(fù)雜

5、。因此，不能直接采用食品中的提取凈化方法來分析土壤中的抗生素。目前，利用高效液相色譜儀分析土壤中喹諾酮類抗生素的報道很少，檢測的化合物種類少，或是以靈敏度欠佳的紫外光來進(jìn)行檢測。為此，本研究建立了有效價廉的高效液相色譜熒光同時測定土壤中4種喹諾酮類抗生素的分析方法。2  實驗部分2.1  儀器與試劑    高效液相色譜儀（日本島津公司）；SHZ82恒溫震蕩器；KQ250E超聲波清洗器；24管固相萃取裝置；HLB固相萃取柱(3 mL， 60 mg），Supelco公司)；C18固相萃取柱(3 mL， 500 mg），Supelco公司)；雷磁PH

6、S3C精密pH計；氮吹儀。    4種喹諾酮類抗生素：諾氟沙星(NOR)、環(huán)丙沙星(CIP)、洛美沙星(LOM)和恩諾沙星(ENR)，（純度98.0%，德國r. Ehrenstorfer公司）。甲醇和乙腈（色譜純，Sigma公司）；其余試劑均為分析純；實驗用水為高純水。    標(biāo)準(zhǔn)品母液：準(zhǔn)確稱取4種喹諾酮類抗生素標(biāo)準(zhǔn)品各0.0100 g, 溶入0.05 mol/L NaOH溶液，并用高純水稀釋定容至100 mL，配制成濃度為100 mg/L的工作母液，在4 下避光保存。50% Mg(NO3)2溶液：稱取50g Mg(NO3)2

7、83;6H2O溶于100 mL高純水，室溫保存。10% NH3·H2O將的氨水用水稀釋部，現(xiàn)配現(xiàn)用。0.067 mol/L H3PO4/三乙胺溶液(pH 2.5)：取5 mL H3PO4，加高純水稀釋至1000 mL，滴加三乙胺調(diào)pH至2.5。2.2  樣品預(yù)處理    稱取1.00 g粉碎后風(fēng)干過0.30 mm孔徑篩的土壤樣品于10 mL離心管中，加入50%Mg(NO3)210% NH3·H2O（964， V/V） 5 mL，振蕩5 min，超聲提取15 min，離心（4500 r/min）5 min，收集上清液。殘渣再用上述方法反

8、復(fù)提取2次。合并提取液，過HLB固相萃取小柱（小柱先后用6 mL甲醇、6 mL水進(jìn)行預(yù)處理）萃取富集。用6 mL高純水清洗小柱，真空干燥10 min，再用3 mL乙腈H3PO4溶液(51， V/V)洗脫小柱。洗脫液在40 水浴下用氮氣吹至近干，用流動相定容至1 mL，溶液過0.22 m膜，收集濾液于樣品瓶中待測。    2.3  色譜條件    Waters色譜柱(250 mm×4.6 mm， 5 m)；激發(fā)波長280 nm，發(fā)射波長450 nm；柱溫25 ；進(jìn)樣量 20 L；流動相：乙腈0.067 mol/L H

9、3PO4溶液(1585，V/V)； 流速：1.0 mL/min。3  結(jié)果與討論3.1  色譜條件的確定    喹諾酮類抗生素能夠產(chǎn)生熒光，可采用熒光檢測器進(jìn)行定量分析。結(jié)合其最大吸收波長，實驗確定了激發(fā)波長為280 nm，發(fā)射波長為450 nm。喹諾酮類抗生素結(jié)構(gòu)中游離羧基及堿性氮原子的解離會造成色譜峰拖尾嚴(yán)重和保留值不穩(wěn)定等問題1。因此，采用H3PO4溶液作為離子抑制劑，加入三乙胺（調(diào)節(jié)pH 2.5）以消除出峰脫尾現(xiàn)象。實驗確定了乙腈0.067 mol/L H3PO4(1585, V/V) 溶液為流動相，可獲得4種喹諾酮類抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液理想

10、的色譜分離圖標(biāo)樣（0.5 mol/L）、土壤和加標(biāo)土壤中4種喹諾酮類抗生素的色譜分離圖見圖1，且出峰時間較短(圖2b)。圖1  4種喹諾酮類抗生素的HPLC分離圖（略）Fig.1  Chromatograms for the separation of four quinolone antibiotics（QNs）a. 0.5 mg/L標(biāo)樣（tandards solution）； b. 土壤（oil sample）; c. 加標(biāo)土壤（piked soil sample，0.5 mg/L)。1. 諾氟沙星(Norfloxacin, NOR)； 2. 環(huán)丙沙星(Ciproflo

11、xacin, CIP)； 3. 洛美沙星(Lomefloxacin, LOM)； 4. 恩諾沙星(Enrofloxacin, ENR).3.2  提取條件的優(yōu)化3.2.1   提取液的篩選  喹諾酮類抗生素的極性結(jié)構(gòu)決定了其可溶于有機溶劑和堿性水溶液，且弱堿性時能與Mg2+形成穩(wěn)定的螯合物。因此，選取兩種極性有機溶劑的堿性溶液10%乙腈NH3·H2O和10%丙酮NH3·H2O，以及50% Mg(NO3)2溶液和50% Mg(NO3)22% NH3·H2O(964, V/V)4種提取液各5 mL，分別對1.00 g加標(biāo)（0.5

12、 g/g）土壤樣品中4種喹諾酮類抗生素進(jìn)行超聲提?。?0 min），獲得4種喹諾酮類抗生素的回收率見圖3?？梢钥闯?，50% Mg(NO3)22% NH3·H2O（964，V/V）對土壤中4種喹諾酮類抗生素的提取效果均較理想（58.7%79.1%）。實驗進(jìn)一步考察該提取液添加不同濃度NH3·H2O對提取效果的影響（圖4），可以看出，NH3·H2O濃度為10%時4種喹諾酮類抗生素的回收率達(dá)69.2%82.0%。因此，選擇50% Mg(NO3)210% NH3·H2O（964，V/V）作為提取液。3.2  提取液用量的確定  提取液用量會影

13、響喹諾酮類抗生素的提取效果。用量太少造成提取不完全；太多則會提取更多雜質(zhì)。當(dāng)提取液用量為4 mL時，4種喹諾酮類抗生素的回收率均在70%以上（70.2%85.0%），高于2 mL（62.6%77.9%）， 3 mL（61.8%67.8%）和5 mL（69.4%80.1%）的回收率。因此，選擇1 g土壤樣品用4 mL提取液進(jìn)行提取。圖2  流動相中H3PO4溶液不同配比對喹諾酮類抗生素出峰的影響（略）Fig.2  Effect of mobile phase with different volume of phosphoric acid on separation of q

14、uinolone antibioticsa. 乙腈(cetonitrile)H3PO4溶液(Solution)=1783, V/V； b. 乙腈(cetonitrile)H3PO4溶液(Solution)=1585, V/V； c. 乙腈(cetonitrile)H3PO4溶液(Solution)=1387， V/V。 1. 諾氟沙星(Norfloxacin)； 2. 環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin)； 3. 洛美沙星(Lomefloxacin)； 4. 恩諾沙星(Enrofloxacin)。  圖3  不同提取液對喹諾酮類抗生素的回收率（略）Fig.3  Recovery o