二至丸對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞作用的活性組分構(gòu)件研究(一)

1、二至丸對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞作用的活性組分構(gòu)件研究(一)    【關(guān)鍵詞】 二至丸；,中藥復(fù)方組合化學(xué)；,血清藥理學(xué)；,細(xì)胞藥理學(xué)；,免疫調(diào)節(jié)；,活性組分構(gòu)件摘要：目的探討二至丸免疫調(diào)節(jié)作用的活性組分構(gòu)件。方法運(yùn)用中藥復(fù)方組合化學(xué)、血清藥理學(xué)和細(xì)胞藥理學(xué)方法，觀察女貞子、墨旱蓮系列提取物及其組合物對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的作用。結(jié)果女貞子乙醇提取物、墨旱蓮乙醇提取物、女貞子乙醇提取物+墨旱蓮乙醇提取物（11）具有較強(qiáng)的絲裂原樣作用，可以促進(jìn)小鼠外周血、脾淋巴細(xì)胞增殖和腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能。結(jié)論二至丸對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞作用的活性組分構(gòu)件是女貞子乙

2、醇提取物+墨旱蓮乙醇提取物（11）。關(guān)鍵詞：二至丸； 中藥復(fù)方組合化學(xué)； 血清藥理學(xué)； 細(xì)胞藥理學(xué)； 免疫調(diào)節(jié)； 活性組分構(gòu)件Study of Active Components with Immunoregulation from Erzhi Pill on Lymphocytes and Macrophages in MiceAbstract：ObjectiveTo study the active components with immunoregulation from Erzhi Pill.MethodsDifferent extractions were extracted fro

3、m Ligustrum lucidum Ait.（LLA）or Eclipta prostrata L.（EPL） with different solvents such as water,alcohol etc.The effect on lymphocytes and macrophages in mice was observed with the methods of Combinatorial Chemical research of Traditional Chinese Prescriptions, blood serum pharmacology and cytopharma

4、cology.ResultsDifferent extraction showed different effects on mice lymphocytes and macrophages in vitro.The alcohol extraction from LLA (NYC),the alcohol extraction from EPL (HYC) or both (11) could stimulate the mouse lymphocytes proliferation of peripheral blood and spleen and enhance the phagocy

5、teses of mice macrophages.ConclusionThe active components with immunoregulation from Erzhi Pill on lymphocytes and macrophages in mice was the mixture of NYC and HYC (11).Key words：Erzhi Pill; Combinatorial Chemical research of Traditional Chinese Prescriptions; Blood serum pharmacology; Cytopharmac

6、ology; Immunoregulation; Active components二至丸是中醫(yī)臨床的經(jīng)典名方，醫(yī)便（明?王三才）記載：“二至丸，清上補(bǔ)下第一方，價(jià)廉而功極大。”1它由女貞子、墨旱蓮各等份組成，組方簡(jiǎn)單，藥性平和，功效確切，作為補(bǔ)益肝腎良藥。數(shù)百年來(lái)，倍受歷代醫(yī)家推崇。現(xiàn)代還用于衰老、神經(jīng)衰弱、疲勞綜合癥及更年期綜合癥等疾病的治療。中成藥二至丸先后被歷版中國(guó)藥典（部）和“第二批國(guó)家非處方藥目錄”收載。一些學(xué)者相繼從現(xiàn)代藥理學(xué)角度對(duì)其進(jìn)行了研究，證明二至丸對(duì)機(jī)體免疫功能具有多方面的調(diào)節(jié)作用，但研究中多以水煎劑、女貞子多糖及方中單味藥提取物給藥25。由于目前對(duì)其復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作

7、用機(jī)理還缺乏系統(tǒng)規(guī)范的研究，致使制劑工藝粗放，日用劑量過(guò)大6，劑型落后，不符合現(xiàn)代中藥要求，影響了它的公眾認(rèn)知度。作者在遵從復(fù)方配伍規(guī)律的前提下，以活性評(píng)價(jià)為導(dǎo)向，運(yùn)用中藥復(fù)方組合化學(xué)、血清藥理學(xué)和細(xì)胞藥理學(xué)方法，對(duì)其免疫調(diào)節(jié)作用的有效組分構(gòu)件進(jìn)行探討，以期進(jìn)一步組成精簡(jiǎn)方劑，從而為二至丸的二次開發(fā)和臨床應(yīng)用提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 動(dòng)物普通級(jí) KM種小鼠，8周齡，體重2224 g，購(gòu)于重慶市中藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究室（許可證號(hào)：310101001）。1.1.2 試劑RPMIl640培養(yǎng)液 (Gibco產(chǎn)品)、無(wú)酚紅 RPMIl640培養(yǎng)液 (Sigma產(chǎn)品)，配制

8、時(shí)加青霉素1×105 IU/L、鏈霉素100 mg/L，過(guò)濾，使用時(shí)加體積分?jǐn)?shù)為15% 的胎牛血清（FBS，超級(jí)，杭州四季青生物工程材料研究所）。ConA(刀豆蛋白A)，F(xiàn)luka產(chǎn)品；LPS(脂多糖)，Sigma產(chǎn)品，用 RPMI1640配成1 mg/ml，0.22 m過(guò)濾，分裝，20凍存，臨用前稀釋。MTT(噻唑藍(lán))，Sigma產(chǎn)品，使用前用 PBS配制成5 mg/ml，過(guò)濾，4避光保存。硫代羥基乙酸鈉 (thioglyc011ate，TG)，北京生物制品所產(chǎn)品。其余試劑均為市售分析純。1.1.3 儀器Napco6lOO型CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)。96孔板，Nunclon，丹麥。微量可

9、調(diào)加樣器，Labsystems，芬蘭。多頭細(xì)胞收集儀，ZT型，上海醫(yī)科大學(xué)。550型酶標(biāo)儀，BioRad，美國(guó)。恒溫水浴搖床，Yamato，日本。1.1.4 藥物女貞子 Ligustrum lucidum Ait.（LLA）、墨旱蓮 E clipta prostrata L.（EPL），購(gòu)于重慶市中藥材公司，符合中國(guó)藥典2005年版部規(guī)定。1.2 方法1.2.1 女貞子、墨旱蓮提取物的制備取女貞子或墨旱蓮藥材，粉碎，過(guò)20目篩，依次用不同溶劑，10倍量提取2次，2 h/次，過(guò)濾，合并提取液，回收溶劑，制備女貞子或墨旱蓮的石油醚提取物（簡(jiǎn)稱 NSYM或 HSYM）、醋酸乙酯提取物（簡(jiǎn)稱 NYSY

10、Z或 HYSYZ）、乙醇提取物（簡(jiǎn)稱 NYC或 HYC）和水煎煮提取物（簡(jiǎn)稱 NSJZ或 HSJZ）。臨用前，分別用生理鹽水（NS）制備藥液，必要時(shí)可加少量 Tween80助溶，濃度相當(dāng)于1 mg生藥/ml。1.2.2 含藥血清的制備7小鼠按體重隨機(jī)分組，每組10只，雌、雄各半。ig給藥，給藥2次，間隔2 h。ig容積10 ml/kg，空白血清組ig NS，各含藥血清組 ig相應(yīng)組分6.7 g生藥 /kg（組合組分13.4 g生藥 /kg）。末次給藥1 h，深度麻醉，心臟無(wú)菌采血，3000 r/min離心10 min，收集血清。同組分血清混合，56水浴30 min，-20凍存，臨用前4凍融。1

11、.2.3 細(xì)胞懸液的制備8小鼠腹腔注射3% TG溶液（2 ml/只），72h后眼眶采血（肝素500 IU/ml抗凝），隨即脫頸椎處死小鼠，ip PBS 5ml，收集腹腔洗液，同時(shí)無(wú)菌取脾。常規(guī)方法制備細(xì)胞懸液，PBS液洗滌，離心，細(xì)胞沉淀加入 RPMI164010% FBS培養(yǎng)液，調(diào)整濃度為2×106 cells/ml，臺(tái)盼蘭排除法檢查細(xì)胞存活率大于95%。1.2.4 淋巴細(xì)胞增殖（lymphocytes proliferation，LP）實(shí)驗(yàn)996孔細(xì)胞培養(yǎng)板，各給藥組每孔加入50l淋巴細(xì)胞懸液、20 l含藥血清和120 l RPMI164010%FBS培養(yǎng)液（對(duì)照組、刺激組分別用

12、20 l空白血清），混勻后預(yù)孵1 h，再加入10 l ConA或 LPS（終濃度為5 g/ml）刺激（對(duì)照組用10 l PBS），各設(shè)8個(gè)復(fù)孔。5% CO2培養(yǎng)箱（Forma.USA）37培養(yǎng)48 h后，加入 MTT 10 l/孔（10 mg/ml）培養(yǎng)8 h，棄上清，加入 DMSO 100 l/孔，MTT結(jié)晶充分溶解后，酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)定A值。1.2.5 腹腔巨噬細(xì)胞（PM）吞噬活性實(shí)驗(yàn)1096孔細(xì)胞培養(yǎng)板，各給藥組每孔加入50 l腹腔巨噬細(xì)胞懸液、20 l含藥血清和120 l無(wú)酚紅 RPMI164010% FBS培養(yǎng)液（對(duì)照組用20 l空白血清），各設(shè)8個(gè)復(fù)孔。5% CO2培養(yǎng)箱（F

13、orma.USA）37培養(yǎng)24 h，棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，加0.075%中性紅溶液100 l/孔，培養(yǎng)1 h，棄上清液，預(yù)溫的 PBS液洗3遍，加入細(xì)胞溶解液（0.1 mol/L乙酸：無(wú)水乙醇）100 l/孔，室溫放置，過(guò)夜。次日，取上清液于酶標(biāo)板中，酶標(biāo)儀540 nm處測(cè)定A值。1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包。運(yùn)用單向方差分析（OneWay ANOVA），選用 Dunnett法進(jìn)行組間顯著性分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示。2 結(jié)果2.1 女貞子或墨旱蓮提取物對(duì)小鼠 LP和PM活性的影響結(jié)果見表1。表1 女貞子或墨旱蓮提取物對(duì)小鼠 LP和PM活性的影響（略）與正常對(duì)照組比較

14、，1）P0.01，2) P0.05；與刺激劑組比較，3) P0.01，4) P0.05；刺激劑指刀豆蛋白 A或脂多糖從表1可以看出，女貞子或墨旱蓮提取物對(duì) ConA或 LPS誘導(dǎo)的小鼠外周血和脾淋巴細(xì)胞增殖、對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性均有較明顯的促進(jìn)作用。強(qiáng)度順序依次為，NYCNYSYZNSJZNSYM；HYCHYSYZHSJZHSYM。提示，女貞子或墨旱蓮促進(jìn)小鼠LP和PM活性作用最強(qiáng)的組分分別是 NYC或 HYC，即女貞子乙醇提取物或墨旱蓮乙醇提取物。表2 女貞子墨旱蓮提取物組合對(duì)小鼠 LP和PM活性的影響（略）與正常對(duì)照組比較，1) P0.01，2) P0.05；與刺激劑組比較，3) P

15、0.01，4) P0.05；刺激劑指刀豆蛋白 A或脂多糖2.2 女貞子墨旱蓮提取物組合對(duì)小鼠 LP和 PM活性的影響結(jié)果見表2。從表2可以看出，女貞子墨旱蓮不同提取物交叉組合后，對(duì) ConA或 LPS誘導(dǎo)的小鼠外周血和脾淋巴細(xì)胞增殖、對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性均有較明顯的促進(jìn)作用。強(qiáng)度順序依次為 NYC+HYCNYC+HYSYZHYC+NYSYZNYC+HSJZHYC+NSJZNYC+HSYMHYC+NSYM。提示，二至丸（女貞子和墨旱蓮的組合復(fù)方）促進(jìn)小鼠LP和PM活性作用最強(qiáng)的組分構(gòu)件是NYC+HYC，即女貞子乙醇提取物和墨旱蓮乙醇提取物。3 討論免疫功能低下常常與一些疾病的發(fā)生、發(fā)展密切

16、相關(guān)，已經(jīng)對(duì)人類社會(huì)構(gòu)成了巨大威脅。對(duì)于疾病、衰老或治療藥物引起的免疫功能低下，現(xiàn)代慣用生物制劑，如胸腺素、轉(zhuǎn)移因子、干擾素等，或化學(xué)制劑如左旋咪唑等，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，但這些藥物容易引起發(fā)熱、嘔吐、粒細(xì)胞減少及肝腎功能異常等不良反應(yīng)，而中藥在這方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)11。在人用疫苗佐劑相對(duì)缺乏、人們?nèi)找孀⒅馗纳粕|(zhì)量的今天，具有高活性免疫調(diào)節(jié)作用的中藥有效成分被認(rèn)為是理想的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑12。近年來(lái)通過(guò)臨床或?qū)嶒?yàn)研究發(fā)現(xiàn)四君子湯、生脈散、六味地黃丸、當(dāng)歸補(bǔ)血湯、腎氣丸等補(bǔ)益方劑有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用，二至丸在改善機(jī)體免疫功能方面療效顯著13。目前國(guó)內(nèi)對(duì)六味地黃丸的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)理研究較為深

17、入，相繼研制成功了六味地黃口服液、膠囊、軟膠囊及滴丸等新劑型，取得了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，而對(duì)二至丸的相關(guān)研究卻極為薄弱。中藥復(fù)方本身的分子多樣性決定了其“有用分子”不明確，無(wú)用或誘發(fā)毒副作用的分子占絕大多數(shù)，從而表現(xiàn)出多成分、多途徑、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，這在客觀上增加了中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)理研究的難度。目前，關(guān)于其方法學(xué)研究，觀點(diǎn)和構(gòu)思較多，如三元設(shè)計(jì)方案、霰彈理論、血清藥理學(xué)及天然組合化學(xué)庫(kù)與多靶作用機(jī)理等14，對(duì)于實(shí)際工作具有一定的啟發(fā)和參考價(jià)值。作者在實(shí)際研究工作中發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方組合化學(xué)方法在中藥復(fù)方活性成分群研究中具有明顯的優(yōu)勢(shì)。該方法借鑒現(xiàn)代藥學(xué)組合化學(xué)研究方法，選擇能代表方劑主治病癥病理生理和治則的藥理學(xué)指標(biāo)，通過(guò)組分或單體成分的組合，采用排除篩選法，找出其活性最強(qiáng)的組份構(gòu)件，即確定“有用分子”組合的精簡(jiǎn)方劑15。它與直接測(cè)定成分法不同，既可充分體現(xiàn)中藥復(fù)方多組分協(xié)同的特點(diǎn)，又可簡(jiǎn)化中藥復(fù)方的分子多樣性，符合中醫(yī)藥整體觀和辯證分析的理論精髓?？紤]到二至丸原方及其中成藥均采用方中藥味單獨(dú)處理后再組合制劑的工藝路線，故本文運(yùn)用中藥復(fù)方組合化學(xué)方法進(jìn)行活性部位研究。本研究結(jié)果表明，女貞子乙醇提取物+墨旱蓮乙醇提取物（11）是二至丸復(fù)方最強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用活性部位，能夠協(xié)同LPS、ConA等有