中藥多糖及其含藥血清對小鼠淋巴細胞增殖的影響

1、中藥多糖及其含藥血清對小鼠淋巴細胞增殖的影響 作者：羅燕，邵永斌，谷新利，趙宗勝【摘要】 目的探討中藥復(fù)方多糖與各單味中藥多糖及其含藥血清對小鼠淋巴細胞增殖的影響。方法制備各中藥多糖，并分離服用各多糖后的小鼠血清，分別加入到淋巴細胞懸液中，檢測小鼠淋巴細胞增殖情況。結(jié)果各多糖組和含多糖血清組均能不同程度的促進淋巴細胞增殖，其中復(fù)方多糖和含復(fù)方多糖血清組最顯著。結(jié)論血清藥方法更能真實地反映藥物的藥理作用；各單味中藥多糖對細胞免疫具有協(xié)同促進作用。 【關(guān)鍵詞】 中藥 糖 含藥血清 淋巴細胞增殖Abstract：ObjectiveTo discuss the effect of polysaccha

2、rides of traditional Chinese medicine and each single herbal polysaccharide and medicated serum on lymphocyte multiplication of mice.MethodsVarious polysaccharides of traditional Chinese medicines were prepared.After taking various polysaccharides,mouse serum was separated and added into lymphocyte

3、respectively to examine lymphocyte multiplication.ResultsAll of the polysaccharides and medicated serum could increase lymphocyte multiplication,and the total polysaccharide of Chinese herbal recipe and its medicated serum were most remarkable.ConclusionThe serum pharmacology can reflect pharmacolog

4、ical action actually;single herb polysaccharide has the coordination action to the cellular immunity.Key words：Traditional Chinese medicine; Polysaccharide; Medicated serum; Lymphocyte multiplication自擬中藥復(fù)方免疫增強劑由黨參、黃芪、當(dāng)歸、熟地等11味中藥配伍而成，經(jīng)臨床應(yīng)用表明該復(fù)方對雛雞有明顯增重作用，能顯著提高雛雞成活率和飼料轉(zhuǎn)化率；從該復(fù)方中提取的總多糖成分對小鼠免疫功能有顯著促進作用1，

5、2。本實驗采用血清藥理學(xué)方法，培養(yǎng)淋巴細胞，分別加入服用復(fù)方多糖和各單味中藥多糖后的小鼠血清和各多糖水溶液，進行淋巴細胞體外增殖實驗，初步探討該復(fù)方多糖和11味單味中藥多糖對機體細胞免疫功能的影響，以及復(fù)方多糖與各單味中藥多糖之間的關(guān)系。1 材料與儀器1.1 動物昆明種小鼠，812周齡，體重1825 ，雌雄兼用，購自石河子大學(xué)動物養(yǎng)殖中心。1.2 試劑MTT、RPMI-1640、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清均購自華美生物工程公司，臺朌藍購自北京拜爾迪生物公司。1.3 儀器酶標(biāo)儀（BIO-RAD），二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo Forma）。1.4 藥品實驗用的中藥復(fù)方免疫增強劑是由黨參、黃芪、當(dāng)歸、熟地、淫羊

6、藿、茯苓等11味中藥配伍而成，各單味中藥是從石河子醫(yī)藥公司同次購進，按照配伍比例稱取各單味藥混合后制成復(fù)方。中藥復(fù)方多糖和各單味中藥多糖由本院中獸醫(yī)實驗室提供。小鼠口服劑量均指經(jīng)過換算實際進入小鼠體內(nèi)純多糖的含量，各多糖用時用蒸餾水配成0.05%的水溶液（5 mg/ml），115,30 min高壓滅菌,備用。2 方法2.1 水煎劑的制備按照配伍比例稱取各單味藥混合后制成復(fù)方，將復(fù)方中藥粉碎，充分混勻后稱取復(fù)方中藥7.0 g，加100 ml水煎煮，加熱同時不時攪拌，水沸后計時40 min后用紗布過濾，收集濾液，在濾渣中重新加入60 ml水煎煮，水沸后計時30 min，再用紗布過濾棄渣，合并兩次濾

7、液，濃縮至140 ml，使每毫升水煎劑中含生藥50 mg。2.2 含藥血清的制備3，4小鼠隨機分為14組，每組10只，實驗組分別灌服復(fù)方多糖、復(fù)方水煎劑以及當(dāng)歸多糖、川芎多糖、淫羊藿多糖、麥冬多糖、何首烏多糖、茯苓多糖、補骨脂多糖、熟地多糖、山楂多糖、黨參多糖、黃芪多糖等11味單味中藥多糖，對照組灌服生理鹽水，每天灌服1次（每次0.5 ml/只），連續(xù)7 d，小鼠于末次灌胃后1 h摘除眼球取血，無菌分離血清，同組血清混合后經(jīng)56、30 min滅活處理，再用0.45 m微孔濾膜過濾除菌，置-20保存?zhèn)溆谩?.3 實驗分組藥物組分為復(fù)方多糖組、復(fù)方水煎劑組和當(dāng)歸多糖組、川芎多糖組、淫羊藿多糖組、麥

8、冬多糖組、何首烏多糖組、茯苓多糖組、補骨脂多糖組、熟地多糖組、山楂多糖組、黨參多糖組、黃芪多糖組以及空白對照組，共14組。 含藥血清組也分為14組，即復(fù)方多糖藥物血清組、復(fù)方水煎劑藥物血清組、當(dāng)歸多糖藥物血清組、川芎多糖藥物血清組、淫羊藿多糖藥物血清組、麥冬多糖藥物血清組、何首烏多糖藥物血清組、茯苓多糖藥物血清組、補骨脂多糖藥物血清組、熟地多糖藥物血清組、山楂多糖藥物血清組、黨參多糖藥物血清組、黃芪多糖藥物血清組和空白血清對照組。2.4 淋巴細胞增殖試驗5,6頸椎脫臼處死小鼠，無菌取出小鼠脾臟。200目濾網(wǎng)上捻碎，RPMI-1640液沖洗，收集含脾細胞的沖洗液，1 500 r/min離心5 m

9、in。去上清后加入預(yù)冷的0.83%Tris-NH4Cl裂解紅細胞1 min，重復(fù)裂解一次，再用1640培養(yǎng)液洗23次，棄上清，混勻。臺朌藍染色檢測后，用含10%小牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液（含100 U/ml青霉素，100 U/ml鏈霉素）將脾細胞數(shù)調(diào)整為6106個/ml的細胞懸液。于96孔平底培養(yǎng)板中每孔加入100 l細胞懸液，試驗組加中藥多糖或含藥血清，對照組加培養(yǎng)液，每孔做3個重復(fù)孔。37，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，于終止培養(yǎng)前4 h，每孔加入10 mg/ml MTT溶液10 l，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)結(jié)束后仔細棄去上清，每孔加酸化異丙醇100 l，充分振蕩吹打后靜置20

10、 min，用檢測波長570 nm波長630 nm比色分析，用OD值表示結(jié)果。2.5 統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理，組間差異比較采用單因素方差分析。3 結(jié)果3.1 藥物組對淋巴細胞增殖的影響3.1.1 13個藥物組與空白對照組比較，見表1。表1結(jié)果表明，13個藥物組均能不同程度地增強小鼠淋巴細胞增殖反應(yīng)，其中復(fù)方多糖對淋巴細胞增殖的促進作用最強，與對照組比較差異極顯著（P0.01）；而山楂多糖組和黨參多糖組對小鼠脾淋巴細胞體外增殖的促進作用相對較弱，與對照組比較差異顯著（P0.05），其它11個藥物組對小鼠脾淋巴細胞體外增殖具有較強的促進作用，均與對照組間差異極顯著（P復(fù)

11、方水煎劑黃芪多糖淫羊藿多糖茯苓多糖當(dāng)歸多糖補骨脂多糖麥冬多糖川芎多糖熟地多糖何首烏多糖山楂多糖黨參多糖。3.1.2 復(fù)方多糖組與復(fù)方水煎劑、單味藥物多糖組比較見表1。表1結(jié)果表明，與復(fù)方水煎劑組和11個單味中藥多糖組比較，復(fù)方多糖組對小鼠淋巴細胞增殖的促進作用較強，優(yōu)于復(fù)方水煎劑組，與之產(chǎn)生顯著性差異(P0.05)；明顯優(yōu)于其它11個單味中藥多糖組，與這11組均產(chǎn)生極顯著性差異(P0.01)。3.1.3 復(fù)方水煎劑組與11個單味藥物多糖組比較見表1。表1結(jié)果表明，與組成復(fù)方的11個單味中藥的多糖組比較，復(fù)方水煎劑組對小鼠淋巴細胞增殖的促進作用較強，優(yōu)于黃芪多糖組，與黃芪多糖組產(chǎn)生顯著性差異（P

12、0.05），顯著優(yōu)于其余10組，與其它10個單味中藥多糖組均具有極顯著性差異（P0.01）。1 3.1.4 11個單味藥物多糖組組間比較見表1。由表1可知，11個單味中藥多糖組對小鼠淋巴細胞增殖促進程度不同，其中山楂多糖和黨參多糖對促進小鼠脾臟淋巴細胞的增殖作用較弱，與其它9種單味中藥多糖間均產(chǎn)生極顯著性差異(P0.01)；黃芪多糖與何首烏多糖間具有顯著性差異(P0.05)；當(dāng)歸多糖組、川芎多糖組、淫羊藿多糖組、麥冬多糖組、茯苓多糖組、補骨脂多糖組、熟地多糖組7組多糖對淋巴細胞增殖的影響程度相似，組間無差異，同時這7個多糖組與何首烏多糖組、黃芪多糖組組間也無差異(P0.05)。表1 13個藥物

13、組對淋巴細胞增殖的影響（略）3.2 藥物血清組對小鼠淋巴細胞增殖的影響3.2.1 13個含藥物血清組與空白血清組比較見表2。由表2結(jié)果可知，13個藥物血清組中，麥冬多糖藥物血清、熟地多糖藥物血清、山楂多糖藥物血清對小鼠淋巴細胞增殖的促進作用較弱，與對照組沒有差異（P0.05），其它10個藥物血清組對小鼠淋巴細胞的增殖均具有不同程度的增強作用，均與對照組產(chǎn)生極顯著性差異（P復(fù)方水煎劑血清組補骨脂多糖血清組茯苓多糖血清組黃芪多糖血清組淫羊藿多糖血清組川芎多糖血清組何首烏多糖血清組當(dāng)歸多糖血清組黨參多糖血清組麥冬多糖血清組熟地多糖血清組山楂多糖血清組。表內(nèi)數(shù)字右上角*或不同小寫字母表示組間比較差異顯

14、著（P0.05），*或不同大寫字母表示組間比較差異極顯著（P0.01）。組間有任一大寫/小寫字母相同，表示無極顯著性/顯著性差異3.2.2 含復(fù)方多糖藥物血清組與含復(fù)方水煎劑血清、11個含單味藥多糖血清組比較見表2。由表2結(jié)果可知，與含復(fù)方水煎劑的藥物血清組和11個含單味中藥多糖的藥物血清組比較，含復(fù)方多糖的藥物血清組能顯著促進小鼠淋巴細胞增殖，顯著強于其它藥物血清組，與其它12個藥物血清組均產(chǎn)生極顯著性差異（P0.01）。表2 13個含藥物血清組對淋巴細胞增殖的影響（略）表內(nèi)數(shù)字右上角*或不同小寫字母表示組間比較差異顯著（P0.05），*或不同大寫字母表示組間比較差異極顯著（P0.01）。組

15、間有任一大寫/小寫字母相同，表示無極顯著性/顯著性差異3.2.3 復(fù)方水煎劑藥物血清組與11個單味藥物多糖組比較見表2。由表2結(jié)果可知，與11個含單味中藥多糖的藥物血清組比較，含復(fù)方水煎劑的藥物血清能顯著促進小鼠淋巴細胞增殖，作用效果強于11個單味中藥多糖藥物血清組，與11個藥物血清組均產(chǎn)生極顯著性差異（P0.01）。3.2.4 11個單味藥物多糖血清組組間比較見表2。由表2可知，11個單味中藥多糖血清組對小鼠淋巴細胞增殖的促進作用存在差異，含補骨脂多糖血清對淋巴細胞的增殖的促進作用最強，補骨脂多糖血清組與川芎多糖血清組、何首烏多糖血清組差異顯著(P0.05)；與當(dāng)歸多糖血清組、麥冬多糖血清組

16、、熟地多糖血清組、山楂多糖血清組、黨參多糖血清組差異極顯著(P0.05)。 另對其它10個單味中藥多糖藥物血清組的統(tǒng)計分析結(jié)果表明，當(dāng)歸多糖血清組與茯苓多糖血清組、山楂多糖血清組差異顯著(P0.05)，與補骨脂多糖血清組差異極顯著(P0.01)；川芎多糖血清組與茯苓多糖血清組、補骨脂多糖血清組、山楂多糖血清組差異顯著(P0.05)；淫羊藿多糖血清組與熟地多糖血清組差異顯著( P 0.05)，與山楂多糖血清組差異極顯著(P0.01)；麥冬多糖血清組與茯苓多糖血清組、補骨脂多糖血清組差異極顯著(P0.01)；何首烏多糖血清組與茯苓多糖血清組、補骨脂多糖血清組、山楂多糖血清組差異顯著(P0.05)；

17、茯苓多糖血清組與當(dāng)歸多糖血清組、川芎多糖血清組、何首烏多糖血清組差異顯著(P0.05)，與麥冬多糖血清組、熟地多糖血清組、山楂多糖血清組、黨參多糖血清組差異極顯著(P0.01)；黃芪多糖血清組與黨參多糖血清組有顯著性差異(P0.05)，與麥冬多糖血清組、熟地多糖血清組、山楂多糖血清組差異極顯著(P0.05)；熟地多糖血清組與淫羊藿多糖血清組差異顯著(P0.05)，與茯苓多糖血清組、補骨脂多糖血清組差異極顯著(P0.01)；山楂多糖血清組與當(dāng)歸多糖血清組、川芎多糖血清組、何首烏多糖血清組差異顯著(P0.05)，與淫羊藿多糖血清組、茯苓多糖血清組、補骨脂多糖血清組差異極顯著(P0.01)；黨參多糖

18、血清組與茯苓多糖血清組、補骨脂多糖血清組差異極顯著(P0.01)。4 討論與小結(jié) 測定小鼠淋巴細胞體外增殖反應(yīng)是研究小鼠細胞免疫功能的重要手段和指標(biāo)。藥物組實驗結(jié)果表明，復(fù)方總多糖、復(fù)方水煎劑和11味單味中藥多糖均具有不同程度的促進小鼠淋巴細胞增殖的作用，說明這些藥物都具有促進細胞免疫功能的作用。其中山楂多糖和黨參多糖的促進作用較其他藥物組弱，但與對照組比較有顯著性差異(P復(fù)方水煎劑11味單味藥多糖對照。 中藥血清藥方法在1987年首次提出，即給予動物灌服中藥或復(fù)方制劑后，在一定時間內(nèi)采血，分離血清進行體外藥理實驗的方法。該方法克服以往中藥體外實驗的不利因素，比中藥直接體外實驗有較多的優(yōu)勢，能

19、較客觀和真實地闡明中藥的藥效和作用機制，從而有助于研究中藥復(fù)方配伍和促進中藥復(fù)方藥代動力學(xué)研究的深入開展7。本試驗采用動物含藥血清代替中藥煎劑和中藥多糖進行體外試驗，使反應(yīng)體系更接近于動物體內(nèi)環(huán)境，含藥血清組實驗結(jié)果表明，13個藥物血清組中有10組能不同程度地增強淋巴細胞增殖反應(yīng)，說明這些藥物具有很好的免疫增強活性，能夠確實增強機體的細胞免疫功能，而麥冬多糖藥物血清、熟地多糖藥物血清、山楂多糖藥物血清對小鼠淋巴細胞增殖反應(yīng)沒有增強作用，這可能與有些有效成分未能從消化道吸收，或因其有效成分經(jīng)消化道或肝臟代謝失活所致。同時結(jié)合以上研究者的報道，認(rèn)為中藥的體內(nèi)實驗和體外實驗效果存在不一致性，只有從多方面、多層次、多角度對中藥進行研究才