創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)Word版

1、黃曲霉毒素和牛血清蛋白偶聯(lián)產(chǎn)物的檢測陳琳梅摘要：黃曲毒素B1是只有反應(yīng)原性而無免疫原性的半抗原,不能直接刺激動物抗體, 只有和牛血清蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)等載體蛋白連接后才能刺激動物分泌抗體, 利用抗體制成膠體金試紙條快速檢測黃曲霉毒素。將黃曲霉毒素肟化、與牛血清蛋白偶聯(lián)反應(yīng)的混合產(chǎn)物，以及黃曲霉毒素AFB1、牛血清蛋白BSA，分別經(jīng)凝膠色譜分離后，選擇波長檢測色譜分離收集液，獲洗脫曲線圖。通過比較曲線的峰面積，判斷黃曲霉毒素與牛血清蛋白交聯(lián)結(jié)果以及它們的偶聯(lián)率。關(guān)鍵詞：黃曲霉毒素 牛血清蛋白 凝膠柱層析 偶聯(lián)Abstract： AFB1 is a hapten that onl

2、y has reactionogenicity but no immunogenicity.Tt does not stimulate animal antibodies directly.Only it connect with BSA,OVA and other carriers can stimulate animals to secrete antibodies.And make antibodies into colloidal gold test strip to detect AFB1 rapidly.Oximated AFB1 mixing with BSA coupling

3、reaction, AFB1 and BSA pass by Sephadex column respectively and separate them.At last,select suitable wavelength to test separation medium and gain eluting diagram. By comparing the curves of the peak areas to determine whether AFB1 and BSA coupled each other or not and their coupling rate.Key words

4、: AFB1 BSA Sephadex column chromatograph couple前言黃曲霉毒素（Aflatoxins）是黃曲霉和寄生曲霉的代謝產(chǎn)物特曲霉也能產(chǎn)生黃曲霉毒素，但產(chǎn)量較少。產(chǎn)生的黃曲霉毒素主要B1，B2，G1 ，G2 以及另外兩種代謝產(chǎn)物M1 ，M2.其中M1 和M2是從牛奶中分離出來的. B1，B2，G1 ，G2, M1 和M2 在分子結(jié)構(gòu)上十分接近。1993年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為1類致癌物，是一種毒性極強(qiáng)的劇毒物質(zhì)。特別是黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)除了有較強(qiáng)的急性毒性外，還有很強(qiáng)的慢性毒性，也是一種強(qiáng)致癌

5、物質(zhì)(CAST of USA，1989) 。黃曲霉毒素B1常會污染植物和動物源性食品，被動物攝入體內(nèi)后，還可轉(zhuǎn)化成毒性也較大的黃曲霉毒素Ml等衍生物。黃曲霉毒素B1具有致癌、致畸、致突變作用，對人類健康構(gòu)成巨大的威脅。加強(qiáng)對黃曲霉毒素2 / 19B1的檢測，對確保食品安全具有重要意義。世界上幾乎所有的國家和地區(qū)都規(guī)定了食品及飼料中AFB1的最大允許含量并作為強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測和控制。為了防止AFB1超標(biāo)的食品和飼料直接或間接地進(jìn)入人類食物鏈,加強(qiáng)對黃曲霉毒素B1的檢測是必要的。薄膜層析法和液相色譜法是目前國內(nèi)絕大多數(shù)檢測機(jī)構(gòu)都在使用的方法。薄層層析法靈敏度不高，特異性不強(qiáng)，易被其它熒光物質(zhì)干擾

6、，且分析時(shí)間較長；高效液楣色譜法雖然靈敏度高，但檢測儀器化程度高、設(shè)備昂貴，操作技術(shù)要求高，前處理凈化要求高；免疫學(xué)方法由于其特異性強(qiáng)、靈敏度商，前處理簡單，操作簡便，比較容易推廣使用。研制簡便、快速、經(jīng)濟(jì)可行的黃曲霉毒素B1的檢測方法，對于從源頭上控制糧食黃曲霉毒素污染十分重要。黃曲毒素B1是只有反應(yīng)原性而無免疫原性的半抗原,不能直接刺激動物抗體, 只有和牛血清蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)等載體蛋白連接后才能刺激動物產(chǎn)生分泌抗體。故可采用免疫學(xué)方法，將黃曲霉毒素與牛血清蛋白偶聯(lián)產(chǎn)物注射到小鼠體內(nèi)，刺激小鼠產(chǎn)生抗體，利用抗體制成膠體金試紙條快速檢測黃曲霉毒素，本方法就解決了上述的問題。

7、黃曲霉毒素AFB1與牛血清蛋白BSA偶聯(lián)產(chǎn)物AFB1-BSA的檢測，是建立免疫學(xué)快速檢測農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素方法的一項(xiàng)重要工作內(nèi)容。目前多采用紫外掃描的方法，根據(jù)吸收峰的變化判斷偶聯(lián)是否成功，但反應(yīng)體系共存成分會產(chǎn)生干擾，影響檢測判定結(jié)果的可信度。本實(shí)驗(yàn)用凝膠柱層析的方法對黃曲霉毒素與牛血清蛋白的偶聯(lián)產(chǎn)物AFB1-BSA的檢測方法，在識別黃曲霉毒素與牛血清蛋白偶聯(lián)產(chǎn)物的同時(shí)，可給出偶聯(lián)反應(yīng)偶聯(lián)率的具體數(shù)值，提高了檢測判定結(jié)果的可信度，具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。1.材料和方法1.1主要試劑葡聚糖凝膠G100（北京索萊寶科技有限公司），甲醇（分析純，國際集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），黃曲霉毒素（以色列，F(xiàn)E

8、RMENTEK公司），牛血清蛋白（上海，生工生物工程有限公司），黃曲霉毒素和牛血清蛋白的偶聯(lián)產(chǎn)物，黃曲霉毒素和牛血清蛋白的偶聯(lián)產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)樣品（美國，sigma公司），CMO：羧甲氧基羥氨半鹽酸鹽，（Adamas Reagent co,ltd.），EDC:對乙基-N-N二甲基丙基二亞胺（程度貝斯特試劑有限公司），DMF：N-N二甲基甲酰胺（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），吡啶（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）1.2主要儀器DBS-160F電腦自動部份收集器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司），層析柱（柱高25.5cm,內(nèi)徑1.2cm左右,市售），石英比色皿（市售，寬1cm），恒溫?fù)u床（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），

9、分光光度計(jì)（UV110 ，SPECTROPHOTOMETER）1.3方法1.3.1層析柱凝膠的選擇凝膠層析又稱分子排阻層析或凝膠過濾，是以被分離物質(zhì)的分子量差異為基礎(chǔ)的一種層析分離技術(shù)，這一技術(shù)為純化蛋白質(zhì)等生物大分子提供了一種非常溫和的分離方法。凝膠的選擇根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌x擇不同型號的凝膠。葡聚糖凝膠G-75、G-100、G-200分離分子量范圍分別是3-80kDa、4-150kDa、5-600kDa，牛血清蛋白的分子量是66.430kDa，試驗(yàn)選用葡聚糖凝膠G100作為層析柱凝膠。1.3.2洗脫劑選擇牛血清蛋白BSA易溶于水，而黃曲霉毒素不溶于水，可溶于甲醇。故應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)乃c甲醇的比例，

10、使洗脫時(shí)牛血清蛋白和黃曲霉毒素都能溶于洗脫劑中。分別在A,B,C,D試管中加入水：甲醇分別為9:1,8:2，7:3,6:4，并加入黃曲霉毒素，結(jié)果A,B試管中出現(xiàn)渾濁，C,D試管中澄清，故以30%甲醇為洗脫劑。1.3.3裝柱1.3.3.1葡聚糖凝膠G100前處理除去影響流速的過細(xì)顆?！八Ω∠捶ā保簩㈩w粒粗細(xì)不均的凝膠懸浮在大體積的水中，讓它自然沉降，過細(xì)的顆粒浮在上面，倒去即可。反復(fù)幾次。1.3.3.2溶脹取葡聚糖凝膠8g于燒杯中，使用前需直接在欲使用的洗脫液中浸泡溶脹。使用“熱法”溶脹，即在沸水浴中，將懸浮于洗脫液中的凝膠漿逐漸升溫到近沸，1-2小時(shí)即可。 1.3.3.2裝柱裝填的重要原則

11、之一就是需要形成一個穩(wěn)定均一的柱床。膠顆粒越均一(粒徑分布越窄)，越容易獲得穩(wěn)定均一的柱床。取層析柱，將層析柱固定在支架上，調(diào)整層析柱與水平面垂直。裝柱前須將凝膠上面過多的溶液傾出。柱內(nèi)裝放適量洗脫液，排除下接頭處濾膜下的空氣泡，關(guān)閉出口，柱內(nèi)存留四分之一床體積的洗脫液，加入攪拌均勻的凝膠漿液，打開出口，控制流速，凝膠隨柱內(nèi)溶液慢慢流下而均勻沉隆到層析柱底部，不斷補(bǔ)充凝膠漿液至膠面上升至層析柱上部，注意凝膠面上應(yīng)始終保持有洗脫液。繼續(xù)加入凝膠懸液，至凝膠沉積約15cm高度即可。新裝好的柱要檢驗(yàn)其均一性，可用帶色的高分子物質(zhì)如藍(lán)色葡聚糖-2000（又稱藍(lán)色右旋糖，商品名為Blue dextran

12、-2000）、紅色葡聚糖或細(xì)胞色素C等配成2mg/ml的溶液過柱，看色帶是否均勻下降，或?qū)⒅芟蚬庹辗较蛴醚劬τ^察，看是否均勻，有無“紋路”或氣泡。若層析柱床不均一，必須重新裝柱。新柱子裝好后，要檢查其密閉性，保證密閉良好。用30%甲醇進(jìn)行平衡6h左右，調(diào)整流速12滴/分鐘，保證凝膠的緊實(shí)，防止膠面大幅度下沉。1.3.4牛血清蛋白、黃曲霉毒素樣品的制備1.3.4.1牛血清蛋白溶液的制備 取牛血清蛋白0.45mg溶于200uL的30%甲醇中備用。1.3.4.2黃曲霉毒素溶液的制備取黃曲霉毒素0.318mg溶于200uL的30%甲醇中備用。1.3.4.3 AFB1與BSA偶聯(lián)產(chǎn)物樣品的制備AFB1

13、與BSA偶聯(lián)路線：AFB1肟的制備根據(jù)文獻(xiàn)采用兩種方法制備AFB1O。方法一是1 mg AFB1與2mg CMO 溶解于400uL吡啶中，25避光振搖攪拌過夜。方法二是1 mg AFB1與2mg CMO 溶解于1.25mL甲醇吡啶雙蒸水混合液中(V:V:V=4:1:1)，25避光振搖攪拌過夜。肟化產(chǎn)物真空冷凍干燥，薄層層析檢測。AFB1肟與BSA偶聯(lián)物的制備分子量AFB1 AFB1O EDC BSAOVAM: 312.27 191.7 66.430K 43K/38Km: 1mg 8.6mg 3.5mg1mg AFB1 肟溶于200uLDMF和水(V:V=6:9)的混合液中，加入1mg EDC避

14、光活化4h，再補(bǔ)加1mg EDC。稱7mg BSA（BSA加過量，確保AFB1較多的反應(yīng)），用 0.13mol/L的NaHCO3溶液制成10% BSA 活化溶液，將BSA溶液逐滴加入上述反應(yīng)液中。并在28度的恒溫振蕩搖床上震蕩反應(yīng)。偶聯(lián)后置于透析袋中透析三天，盡可能除去黃曲霉毒素等小分子雜質(zhì)后進(jìn)行冷凍干燥。1.3.4上樣打開上接頭，用移液槍吸去床面上大部分洗脫液，當(dāng)洗脫液面接近凝膠床面時(shí)，關(guān)閉層析柱出口端，用移液槍吸BSA樣品0.2毫升，沿管壁小心加樣于柱床表面，打開層析柱出口端，待樣品完全摻入膠內(nèi)，開始收集流出液，同時(shí)小心加適量洗脫液，連接好層析柱上接頭。黃曲霉毒素，黃曲霉毒素和牛血清蛋白的

15、偶聯(lián)產(chǎn)物用同樣的方法上樣。1.3.5洗脫和收集為了獲得分離，使用適當(dāng)?shù)牧魉?，確保有足夠的時(shí)間允許分子可以彌散進(jìn)入或流出主料，控制流速為每管7滴。將層析柱的上端與電腦自動部份收集器相連，為樣品能洗脫完全，通過計(jì)算，共設(shè)160管。2.結(jié)果與分析2.1 AFB1肟的制備將肟化后的兩組溶液做TLC，TLC法監(jiān)控肟化效果見圖1： AFB1 AFB1O5 4 3 2 1圖1：TLC法監(jiān)控肟化效果方法一為點(diǎn)2、4，方法二為點(diǎn)3、5。點(diǎn)1為純AF B1溶于甲醇中，點(diǎn)2、3點(diǎn)樣量為2g AFB1初始物，點(diǎn)4、5為6g AFB1初始物。從圖中可以看出方法一的溶液中的AFB1較少，說明方法一的肟化效果更好。點(diǎn)1為純

16、AFB1溶于甲醇中，余為肟化產(chǎn)物：點(diǎn)2、3點(diǎn)樣量為2g肟化產(chǎn)物，點(diǎn)4、5為6g肟化產(chǎn)物。2.2 AFB1、BSA及其偶聯(lián)產(chǎn)物紫外掃描AFB1、BSA及其偶聯(lián)產(chǎn)物紫外掃描結(jié)果見圖2：BSAAFB1AFB1-BSA圖2 AFBI、C·BSA及其偶聯(lián)產(chǎn)物紫外掃描圖AFB1和BSA的特征吸收波長分別為363nm和278nm，故可選擇278nm和363nm檢測黃曲霉毒素、牛血清蛋白、以及偶聯(lián)產(chǎn)物。2.3 AFB1、BSA及其偶聯(lián)產(chǎn)物凝膠層析AFB1、BSA及其偶聯(lián)產(chǎn)物凝膠層析結(jié)果（檢測波長AFB1：363nm、BSA：278nm、AFB1-BSA：363nm）見圖3：圖3 AFB1、BSA及其

17、偶聯(lián)產(chǎn)物凝膠層析洗脫曲線圖3顯示：黃曲霉毒素洗脫時(shí)間約為50 min，牛血清蛋白洗脫時(shí)間約為8 min。由于363nm檢測波長牛血清蛋白基本無吸收，故偶聯(lián)產(chǎn)物363nm檢測波長所得洗脫曲線20-40 min所示峰為偶聯(lián)產(chǎn)物，55 min所示峰為未透析完全留存的黃曲霉毒素，該結(jié)果表明偶聯(lián)成功。3.討論本文通過黃曲霉毒素、牛血清蛋白、偶聯(lián)產(chǎn)物凝膠層析洗脫曲線分析，實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)產(chǎn)物的識別。由于時(shí)間、試驗(yàn)條件等因素的影響，未對偶聯(lián)率等進(jìn)行試驗(yàn)和判定。柱料的死體積過大，分光光度計(jì)的精密性等因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果會產(chǎn)生一定的影響。進(jìn)一步的工作，將通過優(yōu)化試驗(yàn)條件，嚴(yán)格定量黃曲霉毒素、牛血清蛋白、偶聯(lián)產(chǎn)物凝膠層析上樣量

18、，增加對偶聯(lián)產(chǎn)物278nm檢測波長所得洗脫曲線的分析，比對黃曲霉毒素、牛血清蛋白、偶聯(lián)產(chǎn)物凝膠層析洗脫曲線中，黃曲霉毒素、牛血清蛋白、偶聯(lián)產(chǎn)物峰面積的比值，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)率的判定。該項(xiàng)工作的完善，可以為偶聯(lián)工藝條件的優(yōu)化提供評判依據(jù)，并為黃曲霉毒素檢測試劑盒產(chǎn)品開發(fā)提供重要的基礎(chǔ)條件。4.收獲通過這次試驗(yàn)我明白了要做出一些結(jié)果不是一朝一夕就能完成的，其中會遭受很多的失敗，而在每次失敗中必須找出失敗原因，并且尋找解決方案。第一次裝柱的時(shí)候感覺很簡單，以為只是把葡聚糖凝膠倒到柱子中就可以了，結(jié)果出現(xiàn)柱子斷層。向老師請教，吸取經(jīng)驗(yàn)后，倒凝膠的時(shí)候在柱口加上漏斗，并且在柱中牽引一條線，在倒凝膠的時(shí)候不斷

19、拉扯線以驅(qū)趕氣泡。但是又出現(xiàn)新的問題，裝好柱子后，發(fā)現(xiàn)平常用的氯化鈉洗脫劑不能溶解黃曲霉毒素，這樣我們就必須要尋找新的洗脫劑。黃曲霉毒素溶于酒精和牛血清蛋白易溶于水，根據(jù)酒精與水的不同比例不斷嘗試，最終找出適合的洗脫劑30%甲醇的水溶液。于是這次又重新裝柱，但是這次膠體無法下沉，一直呈現(xiàn)透明狀，并且在之前保存過程中沒處理好，出現(xiàn)霉菌。之后，只能重新買葡聚糖凝膠。處理好膠料，裝柱后，開始平衡，但是這次又出現(xiàn)新的問題，平衡時(shí)，柱子的流速比蠕動泵泵出的液體流速不一致，導(dǎo)致凝膠頂部干掉，柱子只能重裝。看似簡單的柱子來來回回裝了一個多月，但是其中失敗的原因只能由我們慢慢摸索，我們也總結(jié)了一些經(jīng)驗(yàn)：在保存

20、膠體的時(shí)候要用到疊氮化鈉防止霉菌生長；在裝柱的過程中凝膠要一次性倒入，不能分次倒，否則柱子中會分層；在裝柱時(shí)要用線牽拉，驅(qū)趕氣泡；最好是用常壓，盡量不用蠕動泵讓液體流出，防止上下流速不一，造成斷層；要盡量減少柱子的死體積。總結(jié)經(jīng)驗(yàn)后，設(shè)計(jì)加工了一套新的柱層析裝置，它是常壓操作，并且有頂上有一個梨形漏斗，有足夠大的體積裝凝膠，避免了多次加凝膠。成功裝柱，洗脫后，測定樣品的吸光度，黃曲霉毒素和牛血清蛋白的吸光度分別是363nm和278nm，屬于紫外光區(qū)，應(yīng)用石英比色皿，而我們不知道這個特點(diǎn)，用了玻璃比色皿，導(dǎo)致吸光度一直是負(fù)值。這樣磕磕碰碰，我們總算是測出了黃曲霉毒素和牛血清蛋白以及它們的偶聯(lián)產(chǎn)物的洗脫曲線。雖然沒有完成預(yù)期的計(jì)算它們的偶聯(lián)率，但是我在試驗(yàn)中受益匪淺，每次的失敗和尋找方法都讓我的能力增長了許多。參考文獻(xiàn)：1. 薛金艷 ，李俏俏，凝膠層析分離蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)化，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002.44（6）2. 陶慧林，壽紅娟，朱仕毅，3種黃酮類小分子與牛血清白蛋白間相互作用及其構(gòu)效關(guān)系的研究，廣西科學(xué)院學(xué)報(bào)，2010