GB18466-2001醫(yī)療機構污水排放要求

?醫(yī)療機構污水排放要求

GB18466—2001

中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局2001—10—22批準2002—03—01實施

前言

本標準中第4章、5．1、5．4、5．5條為強制執(zhí)行條文，其他為非強制執(zhí)行條文。

本標準是對GBJ48—1983《醫(yī)療機構污水排放標準》(試行)的修訂。

為了貫徹執(zhí)行《中華人民共和國傳染病防治法》，控制醫(yī)療機構污水對環(huán)境的污染，預防、控制和消除傳染病的發(fā)生和流行，保障人體健康，特此對《醫(yī)療機構污水排放標準(試行)》進行修訂。

本標準對GBJ48—1983的適用范圍、標準值、衛(wèi)生要求和檢驗方法作了較大修改，增加了標準監(jiān)督執(zhí)行內(nèi)容。

本標準從實施之日起，代替GBJ48—1983，同時代替GB8978—1996《污水綜合排放標準》中表2序號25和26以及表4中序號54和55中的標準值。

本標準從2002年3月1日起實施。

本標準的附錄A、B、C、D、E、F、G都是標準的附錄。

本標準由中華人民共和國衛(wèi)生部提出。

本標準負責起草單位；中國預防醫(yī)學科學院環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測所；參加起草單位：江蘇省衛(wèi)生監(jiān)督所。

本標準主要起草人：潘長慶、李霞、張漱潔、周淑玉、陳昌杰。

本標準由衛(wèi)生部委托中國預防醫(yī)學科學院環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測所負責解釋。

1范圍

1．1本標準規(guī)定了醫(yī)療機構污水和污泥的排放標準。

1．2本標準適用于下列醫(yī)療機構：

1)污水直接排入江、河、湖、海、池塘、水庫、溪、溝等地表水體的醫(yī)療機構。

2)污水直接排入終端無污水處理廠的下水管道的醫(yī)療機構。

3)污水無組織排放的醫(yī)療機構。

4)所有的傳染病和結核病醫(yī)療機構。

2引用標準

下列標準所包含的條文，通過在本標準中引用而構成為本標準的條文。本標準出版時，所示版本均為有效。所有標準都會被修訂，使用本標準的各方應探討使用下列標準最新版本的可能性。

GB3838—1988地面水環(huán)境質(zhì)量標準

GB5084—1992農(nóng)田灌溉水質(zhì)標準

GB5749—1985生活飲用水衛(wèi)生標準

GB7959—1987糞便無害化衛(wèi)生標準

GB11607－1989魚業(yè)水質(zhì)標準

GB12941－1991景觀娛樂用水水質(zhì)標準

GB／T14848—1993地下水質(zhì)量標準

3定義

本標準采用下列定義。

3．1醫(yī)療機構medicalorganization

指依據(jù)《醫(yī)療機構管理條例》及《醫(yī)療機構管理條例實施細則》的規(guī)定，經(jīng)登記取得《醫(yī)療機構執(zhí)業(yè)許可證》的機構。

3．2醫(yī)療機構污水medicalorganizationsewage

指醫(yī)療機構門診、病房、手術室、治療室、各類檢驗室、病理解剖室、放射室、洗衣房、太平間等處排出的醫(yī)療、生活及糞便污水。

3．3醫(yī)療機構污泥medicalorganizationsilt

指醫(yī)療機構污水處理構筑物中的沉淀物和被攔截的漂浮物。

4標準值

經(jīng)處理和消毒后的醫(yī)療機構污水以及經(jīng)無害化處理后的污泥，應該符合表1和表2的規(guī)定。

表1醫(yī)療機構污水排放標準值

表2醫(yī)療機構污泥排放標準值

5衛(wèi)生要求

5．1醫(yī)療機構污水必須進行處理和消毒。醫(yī)療機構污水處理構筑物中的污泥必須經(jīng)過無害化處理。未經(jīng)消毒或無害化處理的污水、污泥，不準任意排放或用做農(nóng)肥。

5．2新建、擴建、改建醫(yī)療機構應同時進行污水處理設施建設，其污水及污泥排放應符合表1和表2的規(guī)定。

5．3醫(yī)療機構污水和污泥經(jīng)處理和消毒后排放時，所含有害物質(zhì)的含量還應根據(jù)接納水體和糞便無害化衛(wèi)生標準的功能要求，符合GB5749、GB3838、GB5084、GBll607、GB7959、GBl2941、GB／T14848中的要求。

5．4嚴禁各級各類醫(yī)療機構將污水、污泥排入生活飲用水水源衛(wèi)生防護地帶內(nèi)。

5．5嚴禁各級各類醫(yī)療機構采用滲井、滲坑排放污水、污泥。

5．6醫(yī)療機構污水處理構筑物的位置，宜設在醫(yī)療機構建筑物當?shù)叵募咀钚☆l率風向的上風側，與周圍建筑物之間宜設綠化防護地帶。

5．7醫(yī)療機構污水處理構筑物的設計，應滿足下列要求：

1)確保污水、污泥符合本排放標準；

2)采取防腐蝕、防滲漏措施；

3)備有發(fā)生故障時的臨時消毒設施；

4)使用液氯消毒，必須備有氯泄漏等事故發(fā)生時的應急處理設施，嚴禁直接以鋼瓶向污水中投加氯氣；

5)安全耐用，操作方便，有利于操作人員的勞動保護。

5．8醫(yī)療機構行政區(qū)和職工生活區(qū)的污水，應與病區(qū)的污水分流。

6檢測與監(jiān)測

6．1醫(yī)療機構污水、污泥處理的日常檢測由各醫(yī)療機構負責。檢測項目和頻次應符合以下要求：

6．1．1醫(yī)療機構污水中總余氯：經(jīng)過連續(xù)處理裝置的污水，每日至少檢測2次；經(jīng)過間隙式處理裝置的污水，每次排放前均應檢測。

6．1．2醫(yī)療機構污水中糞大腸菌群：每月檢測不得少于1次。

6．1．3醫(yī)療機構污水中致病菌：每年檢測不得少于2次。主要檢測沙門氏菌和志賀氏菌，結核病醫(yī)療機構檢測結核桿菌。

6．1．4醫(yī)療機構污泥的衛(wèi)生指標：每批污泥排放前，均應按表2要求的項目檢驗。

6．2各級衛(wèi)生防疫機構，應對轄區(qū)內(nèi)醫(yī)療機構污水、污泥處理情況進行經(jīng)常性衛(wèi)生監(jiān)測。并做好轄區(qū)內(nèi)新建、改建、擴建醫(yī)療機構污水處理設施的預防性衛(wèi)生監(jiān)督工作。

6．2．1監(jiān)測頻次：傳染病、結核病醫(yī)療機構污水每年監(jiān)測至少6次；其他醫(yī)療機構污水每年監(jiān)測至少4次。醫(yī)療機構污泥每次排放前監(jiān)測。

6．2．2污水監(jiān)測項目：總余氯、糞大腸菌群、腸道致病菌；結核病醫(yī)療機構增測結核桿菌。

6．2．3污泥監(jiān)測項目：蛔蟲卵死亡率、糞大腸菌值；傳染病醫(yī)療機構增測腸道致病菌；結核病醫(yī)療機構增測結核桿菌。

7檢驗方法

本標準檢驗方法按附錄A、B、C、D、E、F、G執(zhí)行。

附錄A

(標準的附錄)

醫(yī)療機構污水中總余氯的檢測方法

A1儀器和設備

A1．1天平。

A1．2比色管。

A1．3量筒。

A2試劑

鄰聯(lián)甲苯胺溶液：稱取1g鄰聯(lián)甲苯胺，溶于5mL20％(容積／容積)鹽酸中，將其調(diào)成糊狀，加入150～200mL蒸餾水使其完全溶解，置于量筒中補加蒸餾水至505mL，最后加入20％鹽酸495mL，儲于棕色瓶中。

A3測定步驟

A3．1被測樣品溫度宜為15～20℃，如低于此溫度，應先將樣品浸入溫水中使其溫度升至15～20℃后，再測定數(shù)值。

A3．2在盛有5mL樣品的比色管內(nèi)，滴加鄰聯(lián)甲苯胺溶液2～3滴，混勻。

A3．3將樣品置于黑暗處，靜置15min后，與永久性余氯標準比色溶液比色測定，其結果為樣品總余氯含量(比色時，眼睛從管口向下觀察或由前面觀察)。

A3．4如余氯濃度很高時，會產(chǎn)生桔黃色；當樣品堿度過高以及余氯濃度低時，可能產(chǎn)生淡藍綠色或淡藍色。此時，可再加入1mL1：2鹽酸或1mL鄰聯(lián)甲苯胺溶液，即可產(chǎn)生正常的淡黃色，再進行測定。

A4檢驗結果報告

檢驗結果以每升污水中含總余氯的毫克數(shù)(mg／L)報告。

附錄B

(標準的附錄)

醫(yī)療機構污水中糞大腸菌群的檢驗方法

B1儀器和設備

B1．1高壓蒸汽滅菌器。

B1．2干燥滅菌箱。

B1．3培養(yǎng)箱。

B1．4電爐。

B1．5天平。

B1．6滅菌平皿。

B1．7滅菌刻度吸管。

B2培養(yǎng)基和試劑

B2．1乳糖—膽鹽培養(yǎng)液

B2．1．1成分

蛋白胨20g

豬膽鹽(或牛、羊膽鹽)5g

乳糖5g

0．4％溴甲酚紫水溶液2．5mL

蒸餾水1000mL

B2．1．2制法

將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶解于1000mL蒸餾水中，調(diào)整pH為7．2～7．4。加入指示劑，充分混勻，分裝于有倒管的試管中。置于高壓蒸汽滅菌器中，于115℃滅菌20min。貯存于冷暗處備用。

B2．2伊紅美蘭培養(yǎng)基

B2．2．1成分

蛋白胨10g

乳糖10g

磷酸氫二鉀2g

瓊脂20～30g

蒸餾水1000mL

2％伊紅水溶液20mL

0．5％美蘭水溶液13mL

B2．2．2儲備培養(yǎng)基的制法

B2．2．2．1先將瓊脂加到900mL蒸餾水中，加熱溶解，然后加入磷酸氫二鉀及蛋白胨，混勻使溶解，再以蒸餾水補足至1000mL，調(diào)整pH為7．2～7．4。

B2．2．2．2趁熱用脫脂棉或絨布過濾，再加入乳糖，混勻后，定量分裝于燒瓶內(nèi)，置于高壓蒸汽滅菌器中，以115℃滅菌20min。貯存于冷暗處備用。

B2．2．3平皿培養(yǎng)基的制法

B2．2．3．1將已制備的培養(yǎng)基加熱融化。

B2．2．3．2根據(jù)燒瓶內(nèi)培養(yǎng)基的容量，用滅菌吸管按比例吸取一定量的已滅菌的2％伊紅水溶液及一定量已滅菌的０．5％美蘭水溶液加入已融化的儲備培養(yǎng)基內(nèi)，并充分混勻(防止產(chǎn)生氣泡)。立即將此種培養(yǎng)基適量傾入已滅菌的空子皿內(nèi)，待其冷凝后，備用。

B2．3乳糖蛋白胨培養(yǎng)液

B2．3．1成分

蛋白胨10g

牛肉膏3g

乳糖5g

氯化鈉5g

1．6％溴甲酚紫乙醇溶液1mL

蒸餾水1000mL

B2．3．2制法

將蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化鈉加熱溶解于1000mL蒸餾水中，調(diào)整pH為7．2～7．4。加入1．6％溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混勻，分裝于有倒管的試管中。置于高壓蒸汽滅菌器中，以115℃滅菌20min。貯存于冷暗處備用。

B2．4革蘭氏染色液

B2．4．1結晶紫染色液

結晶紫1g

95％乙醇20mL

1％草酸銨水溶液80mL

將結晶紫溶于乙醇中，然后與草酸銨水溶液混合。

B2．4．2革蘭氏碘液

碘1g

碘化鉀2g

蒸餾水300mL

將碘與碘化鉀先進行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解，再加入蒸餾水至300mL。

B2．4．3脫色液：95％乙醇。

B2．4．4沙黃復染液

沙黃0．25g

95％乙醇10mL

蒸餾水90mL

將沙黃溶于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。

B2．5染色法

B2．5．1將涂片在火焰上固定，滴加結晶紫染色液，染色1min，水洗。

B2．5．2滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗。

B2．5．3滴加95％乙醇脫色，約30s，水洗。

B2．5．4滴加復染液，復染1min，水洗，待干，鏡檢。

B2．6染色結果

革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。

注：亦可用1：10稀釋的石炭酸復紅染色液作復染液，復染時間為10s。

B3檢驗程序

B3．1采樣方法

用采水器或其他滅菌容器采取污水樣1000mL，放入滅菌瓶內(nèi)，如果是經(jīng)過加氯消毒處理的污水，需加1．5％硫代硫酸鈉溶液5mL中和余氯。

B3．2多管發(fā)酵法

B3．2．1初發(fā)酵實驗：將原液作1：10、1：100、1：1000稀釋。依次吸取l：1000、1：100、1：10及原液各1mL，分別注入裝有10mL乳糖膽鹽培養(yǎng)液內(nèi)裝小發(fā)酵管的試管中，將已接種的四支發(fā)酵管置于44℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。

注：接種量為10mL時，可用與接種量相等的雙料乳糖膽鹽培養(yǎng)液。

B3．2．2平板分離：取經(jīng)培養(yǎng)24h后產(chǎn)酸產(chǎn)氣，以及只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣的發(fā)酵管中培養(yǎng)液，分別劃線接種伊紅美藍培養(yǎng)基上，置37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18～24h，挑選符合下列特征的菌落，進行涂片，革蘭氏染色，鏡檢。

伊紅美藍培養(yǎng)基上的菌落色澤：深紫黑色，具有金屬光澤的菌落；紫黑色，不帶或略帶金屬光澤的菌落；淡紫紅色，中心色較深的菌落。

B3．2．3復發(fā)酵實驗：上述涂片鏡檢的菌落，如為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，再挑取該菌落接種于乳糖發(fā)酵管中(內(nèi)有倒管)，置于44℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者即證實有糞大腸菌群存在，按陽性管數(shù)查表。

視其水質(zhì)污染程度，決定稀釋度和接種量。例如，污染較輕可接種總量11．11mL，如污染嚴重可接種總量0．1111mL。

表B1糞大腸菌群檢索表

(接種總量1．111mL)

B4檢驗結果報告

接種水樣總量同表B1，檢驗結果可直接查表，得出糞大腸菌群數(shù)(MPN值)；如接種水樣總量比表1大10倍(11．11mL)，檢驗結果為查表所得MPN值除以10。

附錄C

(標準的附錄)

醫(yī)療機構污泥中糞大腸菌值的檢驗方法

C1儀器和設備

C1．1高壓蒸汽滅菌器。

C1．2干燥滅菌箱。

C1．3培養(yǎng)箱：37℃。

C1．4恒溫水浴箱。

C1．5電爐。

C1．6天平。

C1．7滅菌平皿。

C1．8滅菌刻度吸管。

C2培養(yǎng)基和試劑

C2．1乳糖—膽鹽培養(yǎng)基：同附錄B2．1。

C2．2伊紅美蘭培養(yǎng)基：同附錄B2．2。

C2．3乳糖蛋白胨培養(yǎng)液：同附錄B2．3。

C2．4革蘭氏染色液，同附錄B2．4。

C3檢驗程序

C3．1初發(fā)酵試驗：按圖C1所示將污泥稀釋，分別將污泥樣品接種于盛有10mL乳糖膽鹽培養(yǎng)液的試管中(內(nèi)有小倒管)。再將已接種的四支試管置于44℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h。

圖C1污泥的稀釋和接種示意圖

C3．2平板分離：經(jīng)24h培養(yǎng)后，將產(chǎn)酸產(chǎn)氣及只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣的發(fā)酵管培養(yǎng)液分別劃線接種于伊紅美蘭培養(yǎng)基上。置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h。挑選符合下列特征的菌落，進行涂片，革蘭氏染色，鏡檢。

伊紅美蘭培養(yǎng)基上的菌落色澤：深紫黑色，具有金屬光澤的菌落；紫黑色，不帶或略帶金屬光澤的菌落；淡紫紅色，中心色較深的菌落。

C3．3復發(fā)酵試驗：上述涂片鏡檢的菌落如為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，則挑取該菌落的另一部分再接種于內(nèi)有倒管的乳糖發(fā)酵管中，置于44℃恒溫箱培養(yǎng)24h。有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者即證實有糞大腸菌群存在。

表C2糞大腸菌值檢索表

(接種總量1．111g)

C4檢驗結果報告

根據(jù)經(jīng)證實的糞大腸菌群陽性管數(shù)，按表C2報告糞大腸菌值。

附錄D

(標準的附錄)

醫(yī)療機構污水及污泥中沙門氏菌的檢驗

D1儀器和設備

D1．1高壓蒸汽滅菌器。

D1．2干燥滅菌箱。

D1．3培養(yǎng)箱。

D1．4恒溫水浴箱。

D1．5電爐。

D1．6天平。

D1．7滅菌平皿。

D1．8滅菌刻度吸管。

D2培養(yǎng)基和試劑

D2．1亞硒酸鹽(SF)增菌液

D2．1．1成分

胰蛋白胨(或多價胨)10g

磷酸氫二鈉(Na2HPO4)16g

磷酸二氫鈉(NaH2PO4)2．5g

乳糖4g

亞硒酸氫鈉4g

蒸餾水1000mL

D2．1．2制法

除亞硒酸氫鈉外，將以上各成分放于蒸餾水中，加熱溶化。再加入亞硒酸氫鈉，待完全溶解后，調(diào)整pH為7．0～7．1。分裝，于流通蒸汽滅菌器中滅菌15min備用。

D2．2SS培養(yǎng)基

D2．2．1基礎培養(yǎng)基

D2．2．1．1成分

牛肉膏5g

示胨5g

三號膽鹽3．5g

瓊脂17g

蒸餾水1000mL

D2．2．1．2制法

將牛肉膏、示胨和膽鹽溶解于400mL蒸餾水中，將瓊脂加入600mL蒸餾水中，煮沸使其溶解，再將二者混合，121℃高壓滅菌15min，保存?zhèn)溆谩?/p>

D2．2．2完全培養(yǎng)基

D2．2．2．1成分

基礎培養(yǎng)基1000mL

乳糖10g

檸檬酸鈉8．5g

硫代硫酸鈉8．5g

10％檸檬酸鐵溶液10mL

1％中性紅溶液2．5mL

0．1％煌綠溶液0．33mL

D2．2．2．2制法

加熱溶化基礎培養(yǎng)基，按比例加入上述染色液以外的各成分，充分混合均勻，調(diào)整pH為7．0，加入中性紅和煌綠溶液，傾注平板。

注：制好的培養(yǎng)基宜當日使用，或保存于冰箱內(nèi)于18h內(nèi)使用?；途G溶液配好后應在10天以內(nèi)使用。

D2．3亞硫酸鉍瓊脂(BS)

D2．3．1成分

蛋白胨10g

牛肉膏5g

葡萄糖5g

硫酸亞鐵0．3g

磷酸氫二鈉4g

煌綠0．025g

檸檬酸鉍銨2g

亞硫酸鈉6g

瓊脂18～20g

蒸餾水1000mL

D2．3．2制法

將前面5種成分溶解于300mL蒸餾水中；將檸檬酸鉍銨和亞硫酸鈉另用50mL蒸餾水溶解；將瓊脂于600mL蒸餾水中煮沸溶解，冷至80℃。將前三種溶液混合，補充蒸餾水至1000mL，調(diào)整pH為7．5，加0．5％煌綠水溶液5mL，搖勻。冷至50～55℃，傾注平皿。

注：此培養(yǎng)基不需高壓滅菌。應在臨用前—天制備，貯存于室溫暗處，超過48h不宜使用。

D2．4三糖鐵瓊脂(TSＩ)

D2．4．1成分

蛋白胨20g

牛肉膏5g

乳糖10g

蔗糖10g

葡萄糖1g

氯化鈉5g

硫酸亞鐵銨0．2g

硫代硫酸鈉0．2g

瓊脂12g

酚紅0．025g

蒸餾水1000mL

D2．4．2制法

將除瓊脂和酚紅以外的各成分溶解于蒸餾水中，調(diào)pH為7．4。加入瓊脂，加熱煮沸，再加A．0．2％酚紅水溶液12．5mL，搖勻。分裝試管，裝量宜多些，以便得到較高的底層。121℃高壓滅菌15min。放置高層斜面?zhèn)溆谩?/p>

D2．4．3沙門氏菌屬診斷血清

D3檢測程序

D3．1樣品處理和增菌

污水：取250mL污水，用無菌紗布或脫脂棉進行初濾，然后再用濾膜進行抽濾。將初濾后的紗布或脫脂棉和濾膜，放入到盛有100mL左右的單倍SF增菌液的三角燒瓶中進行增菌培養(yǎng)。置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24h。

污泥：用滅菌匙稱取污泥30g，放入滅菌容器內(nèi)，加入300mL滅菌水，充分混勻制成1：10混懸液。吸取上述1：10混懸液100mL，加于100mL雙料亞硒酸鹽(SF)增菌液內(nèi)，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24h。

D3．2平板分離

取上述增菌培養(yǎng)液，分別接種SS平板和BS平板，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48h。觀察各平板上生長的菌落特征。

D3．3挑選菌落

挑取在SS平板上呈無色透明或中間有黑心，直徑1～2mm的菌落；挑取在BS平板上呈黑色有金屬光澤的菌落或灰綠色的菌落。

每個平板最少挑取5個以上¨疑腸道病原菌菌落，轉種三糖鐵培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18～24h。

D3．4生化試驗及血清學檢驗

在三糖鐵培養(yǎng)基中，如不發(fā)酵乳糖，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣或只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，一般產(chǎn)生硫化氫。有動力者，先與沙門氏A—F群○多價血清作玻璃片凝集，凡與多價○血清凝集者，再與○因子血清凝集，以確定其所屬群別，然后用H因子血清，確定血清型。雙向菌株應證實兩相的H抗原，有Vi抗原的菌型(傷寒和丙型副傷寒沙門氏菌)應用Vi因子血清檢查。

生化試驗：應進行葡萄糖、甘露醇、麥芽糖、乳糖、蔗糖、靛基質(zhì)、硫化氫、動力、尿素試驗。沙門氏菌屬中除傷寒沙門氏菌和雞沙門氏菌不產(chǎn)氣外，通過發(fā)酵葡萄糖、產(chǎn)氣、均發(fā)酵甘露醇和麥芽糖(但豬沙門氏菌、雛沙門氏菌不發(fā)酵麥芽糖)，不分解乳糖、蔗糖，尿素酶和靛基質(zhì)為陰性，通常產(chǎn)生硫化氫。除雞、雛沙門氏菌和傷寒沙門氏菌的○型菌株無動力外，通常均有動力。

如遇多價○血清不凝集而一般生化反應符合上述情況時，可加做側金盞花醇、水楊素和氰化鉀試驗，沙門氏菌均為陰性。

D4檢驗結果報告

根據(jù)以上鑒別培養(yǎng)、生化試驗和血清學檢驗結果報告結果。

附錄E

(標準的附錄)

醫(yī)療機構污水及污泥中志賀氏菌的檢驗方法

E1儀器和設備

E1．1高壓蒸汽滅菌器。

E1．2干燥滅菌箱。

E1．3培養(yǎng)箱。

E1．4恒溫水浴箱。

E1．5電爐。

E1．6天平。

E1．7滅菌平皿。

E1．8滅菌刻度吸管。

E2培養(yǎng)基和試劑

E2．1革蘭氏陰性(GN)增菌液

E2．1．1成分

胰蛋白胨(或多價胨)20g

葡萄糖1g

甘露醇2g

枸櫞酸鈉5g

去氧膽酸鈉0．5g

磷酸氫二鉀16g

磷酸二氫鉀2．5g

氯化鈉5g

蒸餾水1000mL

E2．1．2制法

將以上各成分加入蒸餾水中溶化，調(diào)整pH至7．0，煮沸過濾，高壓115℃滅菌20min。貯存于冷暗處備用。

雙料GN增菌液配制：除蒸餾水改為500mL外，其它成分不變。

E2．2SS培養(yǎng)基：同附錄D2．2。

E2．3伊紅美蘭瓊脂(EMB)：同附錄B2．2。

E2．4三糖鐵瓊脂(TSI)：同附錄D2．4。

E2．5志賀氏菌診斷血清

E3檢驗程序

E3．1樣品處理和增菌

污水：取污水250mL，用無菌紗布或脫脂棉進行初濾，然后再用濾膜進行抽濾。將初濾后的紗布或脫脂棉和濾膜，放入到盛有100mL左右的單倍GN增菌液的三角燒瓶中進行增菌培養(yǎng)。置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)6～8h。

污泥：用滅菌匙稱取污泥30g，放入滅菌容器內(nèi)，加入300mL滅菌水，充分混勻制成1：10混懸液。．吸取上述1：10混懸液100mL，加到100mL雙料革蘭氏陰性(GN)增菌液內(nèi)，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)6～8h。

E3．2分離

取上述增菌培養(yǎng)液，分別接種SS平板和E．M．B．平板，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h。

挑取在SS和E．M．B．平板上呈無色透明，直徑1～1．5mL的菌落。

每個平板最少挑取5個以上可疑腸道病原菌菌落，轉種三糖快培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18～24h。

挑取在三糖鐵培養(yǎng)基中，葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，無動力，不產(chǎn)生硫化氫，上層斜面乳糖不分解的菌株，可做血清學和生化試驗。

E3．3血清學檢查：志賀氏菌屬分為四個群，先與多價血清作玻璃片凝集試驗，如為陽性，再分別與A、B、C、D群血清凝集，并進一步與分型血清做玻璃片凝集，最后確定其血清型。

E3．4生化試驗：應進行葡萄糖、甘露醇、麥芽糖、乳糖、蔗糖、靛基質(zhì)、硫化氫、動力、尿素試驗。志賀氏菌屬能分解葡萄糖，但不產(chǎn)氣(福氏志賀氏菌6型有時產(chǎn)生少量氣體)，一般不能分解乳糖和蔗糖，宋內(nèi)氏志賀氏菌對乳糖和蔗糖遲緩發(fā)酵產(chǎn)酸。志賀氏菌屬均不產(chǎn)生硫化氫，不分解尿素，無動力。對甘露醇、麥芽糖的發(fā)酵及靛基質(zhì)的產(chǎn)生，則因菌株不同而異。

如遇多價血清玻璃片凝集試驗為陰性，而生化反應符合上述情況時，可加做肌醇、水楊素、V—P、櫞酸鹽、氰化鉀等試驗。志賀氏菌屬均為陰性反應。

附錄F

(標準的附錄)

醫(yī)療機構污泥中蛔蟲卵的檢驗方法

F1儀器和設備

F1．1離心機。

P1．2金屬篩：60目。

F1．3顯微鏡。

F1．4恒溫培養(yǎng)箱。

F1．5高壓蒸汽滅菌器。

F1．6冰箱。

F1．7振蕩器。

F2培養(yǎng)基和試劑

F2．13％～5％福爾馬林或3％鹽酸溶液。

F2．2飽和氯化鈉溶液。

F2．330％次氯酸鈉溶液。

F3檢驗程序

F3．1污泥樣品的采集

先把泥堆劃分為四等份，而后在每份的中間，用鐵锨或小鏟各采污泥約500g。同時，在泥堆的中間也采500g一并放在塑料桶或陶瓷桶中。攪拌均勻，并除去固體雜物，再從中取出500g置于塑料袋或其他容器中，帶回實驗室。

F3．2污泥樣品的處理

將現(xiàn)場帶回的樣品，倒于燒杯中，如遇樣品變干且有結塊時，可將其倒人搪瓷盤中，再行攪拌，同時用大鑷子，一面攪拌，一面將硬塊夾碎，去掉肉眼能看出的夾雜物，如腐爛的布條、草梗、小石塊等。然后，將樣品裝入廣口瓶中，貼上標簽，標明樣品號碼、醫(yī)療機構名稱、采樣日期等情況。

F3．3污泥樣品的檢驗

上述樣品經(jīng)處理后，應立即進行檢驗，如不能立即檢驗時，可加入5～10mL3％～5％福爾馬林或3％鹽酸溶液，用平皿蓋住廣口瓶瓶口。然后放于冰箱內(nèi)，以防微生物的繁殖和蛔蟲卵的發(fā)育。

F3．3．1水洗

從已經(jīng)處理過的500g污泥樣品中，稱取100g置于500mL錐形瓶中，加水約500mL。用玻璃棒攪拌后，靜置，使其自然沉淀，經(jīng)1～2h后，倒去污泥上面的水，另換清水攪拌后，再讓其自然沉淀，經(jīng)30min后，再倒去上面的清水，另換清水，反復進行3～4次，直到污泥上面的水接近五色為止。

F3．3．2過濾

倒去沉淀上面的清水，用金屬篩過濾于另一500mL錐形瓶中，棄去阻留在篩子上的泥渣。沉淀20～30min后，倒去沉淀上面的液體，另加新水，如此反復水洗2～3次，最后倒去上清液，將沉淀物倒入10mL離心管中。經(jīng)2500轉／min離心3min后，倒去上清液。

F3．3．3離心漂浮

管內(nèi)注入飽和氯化鈉溶液，用玻璃棒攪勻后，離心3min，由于蛔蟲卵的相對密度小于飽和氯化鈉溶液的相對密度，所以管內(nèi)絕大多數(shù)的蛔蟲卵均浮聚在液面(注意：加入氯化鈉溶液量不得少于沉淀物的20倍)。

F3．3．4離心沉淀

用毛細吸管反復吸取管中斜面上的浮膜于另一離心管中。加入清水，經(jīng)攪勻后，再行離心，蛔蟲卵比水的相對密度大，因而下沉于管底。然后小心倒去上清液。

F3．3．5培養(yǎng)

注入2～3mi。清水于管中，加幾滴5％福爾馬林溶液，置于24～26℃恒溫箱中，培養(yǎng)15～20天。在培養(yǎng)過程中，清水不得少于2mL。

F3．3．6鏡檢

樣品經(jīng)培養(yǎng)15～20天后取出，用毛細吸管吸去上面的清水，余下含蟲卵的沉淀物。在一張干凈的載玻片的中央滴一滴清水，用毛細吸管吸一小滴沉淀物于水中，涂勻后蓋以蓋玻片，在低倍鏡下檢查，必要時，再換以高倍鏡。記錄500個以上死、活蟲卵數(shù)。查完一張片子而蟲卵數(shù)不及500個時，依同法作第二張涂片檢查。涂片不宜太厚，否則視野模糊不清。影響觀察，一般涂片厚度能以透過涂片尚能辨認報紙上的字跡為宜。因為在適宜的溫度和濕度下，經(jīng)過15～20天的培養(yǎng)，活蟲卵就會逐漸發(fā)育到幼蟲期，而死蟲卵則在同一條件下仍然保持單細胞期或停留于某一發(fā)育階段，故易于區(qū)別。

鏡檢時為達到較為快速而明顯地辨認幼蟲起見，可在載玻片上滴一滴預先配好避光保存的30％次氯酸鈉溶液[商品名為安替福明(antiformin))以代替清水作成涂片，置于顯微鏡下觀察，可以看見被包在卵的最外層的蛋白質(zhì)殼逐漸溶解，使卵內(nèi)的幼蟲一目了然。如遇沉淀物中沉渣較多、卵數(shù)較少時，可以直接注入幾滴此脫殼液于離心管中，與沉淀物混合并攪勻之，而后吸一滴混合液于載玻片上，蓋以蓋玻片，直接鏡檢即可。此時視野格外清晰。在培養(yǎng)第15～20天未查見幼蟲時，應繼續(xù)培養(yǎng)30天(注意：加過30％次氯酸鈉溶液，不能再繼續(xù)培養(yǎng))后再觀察。

F4檢驗結果報告

根據(jù)500個以上的蛔蟲卵數(shù)，求出死卵的百分數(shù)，見式(F1)。

…………(F1)

式中：A——蛔蟲卵死亡率，％；

m——死亡蛔蟲卵數(shù)；

n——存活蛔蟲卵數(shù)。

附錄G

(標準的附錄)

醫(yī)療機構污水和污泥中結核桿菌的檢驗方法

G1儀器和設備

G1．1電爐。

G1．2恒溫水浴箱。

G1．3高壓蒸汽滅菌器。

G1．4濾菌器。

G1．5離心機。

C1．6恒溫培養(yǎng)箱。

G1．7乙酸纖維膜：孔徑為0．3～0．7μm

G1．8玻璃漏斗G2：孔徑為10～15μm

G1．9玻璃漏斗G4：孔徑為3～4μm

G2培養(yǎng)基和試劑

G2．1改良羅氏培養(yǎng)基

G2．1．1成分

磷酸二氫鉀2．4g

硫酸鎂0．24g

枸櫞酸鎂0．6g

谷氨酸鈉1．2g

甘油12mL

淀粉30g

蒸餾水600mL

雞蛋(包括蛋清和蛋黃)1000mL

20％孔雀綠20mL

G2．1．2制法

將磷酸二氫鉀、枸櫞酸鈉、味精、甘油及蒸餾水混合于燒杯內(nèi)，放在沸水浴中加熱溶解。加入淀粉繼續(xù)加熱1h，搖動使其溶解，待冷卻至50C加入蛋液及孔雀綠，溶解，充分混勻。制成斜面，保持溫度90℃，滅菌1h。

G2．2小川氏培養(yǎng)基

G2．2．1成分

甲液：無水磷酸二氫鉀1g

味