第三章 高效液相色譜法

1、13.1 概述 高效液相色譜法（HPLC）是20世紀(jì)60年代末70年代初發(fā)展起來的一種新型分離分析技術(shù)(不揮發(fā)有機(jī)物約占70% )，隨著不斷改進(jìn)與發(fā)展，目前已成為應(yīng)用極為廣泛的化學(xué)分離分析的重要手段。它是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測(cè)器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動(dòng)化的特點(diǎn)。為了更好地了解高效液相色譜法優(yōu)越性，現(xiàn)從兩方面進(jìn)行比較： 2高效液相色譜儀高效液相色譜儀主要區(qū)別：固定相差別，輸液設(shè)備和檢測(cè)手段1經(jīng)典LC：僅做為一種分離手段 柱內(nèi)徑13cm，固定相粒徑100m 且不均勻 常壓輸送流動(dòng)相 柱效低（H，n） 分析周期長

2、 無法在線檢測(cè)2HPLC：分離和分析 柱內(nèi)徑26mm，固定相粒徑10m（球形，勻漿裝柱） 高壓輸送流動(dòng)相 柱效高（H，n） 分析時(shí)間大大縮短 可以在線檢測(cè)4l 離線分析在時(shí)間上有滯后性，得到的是歷史性分析數(shù)據(jù)，而在線分析得到的是實(shí)時(shí)的分析數(shù)據(jù)，能真實(shí)地反映生產(chǎn)過程的變化，通過反饋線路，可立即用于生產(chǎn)過程的控制和最優(yōu)化。離線分析通常只是用于產(chǎn)品（包括中間產(chǎn)品）質(zhì)量的檢驗(yàn)，而在線分析可以進(jìn)行全程質(zhì)量控制，保證整個(gè)生產(chǎn)過程最優(yōu)化。在線分析是今后生產(chǎn)過程控制分析的發(fā)展方向。 相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測(cè) 主要差別：分析對(duì)象的差別和流動(dòng)相的差別1分析對(duì)象分析對(duì)象 GC：能氣化、熱穩(wěn)定性好、且

3、沸點(diǎn)較低的樣品， 高沸點(diǎn)、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及 高聚物的樣品不可檢測(cè) 占有機(jī)物的20% HPLC：溶解后能制成溶液的樣品， 不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制 分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及高分子 和離子型樣品均可檢測(cè) 用途廣泛，占有機(jī)物的80%2流動(dòng)相差別流動(dòng)相差別vGC：流動(dòng)相為惰性氣體組分與流動(dòng)相無親合作用力，只與固定相作用 vHPLC：流動(dòng)相為液體流動(dòng)相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、改善分離度增加了因素，對(duì)分離起很大作用流動(dòng)相種類較多，選擇余地廣流動(dòng)相極性和pH值的選擇也對(duì)分離起到重要作用 選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動(dòng)相 可以增大分離選擇性3操作條件差別操作

4、條件差別 GC：加溫操作 HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬?。?人參人參Ginseng8人參、西洋參與三七的鑒別min1020304050mAU050100150200 DAD1 C, Sig=203,16 Ref=360,100 (H:1DATAHUPINGGSSIDE14.D)min1020304050mAU05101520253035 DAD1 C, Sig=203,16 Ref=360,100 (H:1DATAHUPINGGSSIDE15.D)min1020304050mAU020406080100 DAD1 C, Sig=203,16 Ref=360,100 (H:1DATA

5、HUPINGGSSIDE16.D)R1Rg1ReRb1RdABCRg1Rg1ReReRfRb1RcRb2RdRc三種藥材的三種藥材的HPLC指紋圖譜指紋圖譜9 高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)示意，一般可分為4個(gè)主要部分：高壓輸液系統(tǒng)，進(jìn)樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)。此外還配有輔助裝置：如梯度淋洗，自動(dòng)進(jìn)樣及數(shù)據(jù)處理等。 其工作過程如下：首先高壓泵將貯液器中流動(dòng)相溶劑經(jīng)過進(jìn)樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當(dāng)注入欲分離的樣品時(shí)，流經(jīng)進(jìn)樣器貯液器的流動(dòng)相將樣品同時(shí)帶入色譜柱進(jìn)行分離，然后依先后順序進(jìn)入檢測(cè)器，記錄儀將檢測(cè)器送出的信號(hào)記錄下來，由此得到液相色譜圖。 10l 液相色譜中采用梯度洗脫，目的：縮

6、短分離時(shí)間；提高分離效果。 l 梯度洗脫：讓流動(dòng)相的組成隨時(shí)間而改變，以調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性、離子強(qiáng)度或pH，使樣品組分的相對(duì)保留值得以改變，從而提高分離效率。l 梯度洗提與氣相色譜中的程序升溫類似，但是前者連續(xù)改變的是流動(dòng)相的極性、pH或離子強(qiáng)度，而后者改變的溫度 l 梯度洗脫中為保證流速的穩(wěn)定，必須使用恒流泵，否則難獲重復(fù)結(jié)果。l優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：分離復(fù)雜混合物，使所有組分都處在最佳的k值范圍內(nèi)。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：檢測(cè)器的使用受到限制，分析結(jié)果的重復(fù)性取決于流速的穩(wěn)定性。柱子需進(jìn)行再生處理。11溶劑溶劑A溶劑B電磁閥A電磁閥B混合室泵溶劑A溶劑B高壓泵A 高壓泵B混合室低壓溶劑梯度方框圖高壓溶劑梯度方框

7、圖n 梯度洗提流程121314流 程15 由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細(xì)，因此對(duì)流動(dòng)相阻力很大，為使流動(dòng)相較快流動(dòng)，必須配備有高壓輸液系統(tǒng)。它是高效液相色譜儀最重要的部件，一般由儲(chǔ)液罐、高壓輸液泵、過濾器、壓力脈動(dòng)阻力器等組成，其中高壓輸液泵是核心部件。對(duì)于一個(gè)好的高壓輸液泵應(yīng)符合密封性好，輸出流量恒定，壓力平穩(wěn)，可調(diào)范圍寬，便于迅速更換溶劑及耐腐蝕等要求。 常用的輸液泵分為恒流泵和恒壓泵兩種。恒流泵特點(diǎn)是在一定操作條件下，輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無關(guān)；恒壓泵是指能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時(shí)間的重現(xiàn)性差，它們各有優(yōu)缺點(diǎn)。目前恒流泵正逐漸取代恒壓

8、泵。恒流泵又稱機(jī)械泵，它又分機(jī)械注射泵和機(jī)械往復(fù)泵兩種，應(yīng)用最多的是機(jī)械往復(fù)泵。l 在液相色譜中, 為什么對(duì)所用的流動(dòng)相進(jìn)行脫氣處理?答 防止在檢測(cè)器流動(dòng)池內(nèi)釋出氣泡產(chǎn)生干擾信號(hào), 溶解在流動(dòng)相中的氧有可能與固定相或試樣發(fā)生反應(yīng)。17進(jìn)樣閥進(jìn)樣閥181920 色譜柱色譜柱是液相色譜的是液相色譜的心臟部件心臟部件，它包括，它包括柱管柱管與與固定相固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長5 530cm3

9、0cm，內(nèi)徑為內(nèi)徑為4 45mm5mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑，凝膠色譜柱內(nèi)徑3 312mm12mm，制備往，制備往內(nèi)徑較大，可達(dá)內(nèi)徑較大，可達(dá)25mm 25mm 以上。以上。一般在分離前備有一一般在分離前備有一個(gè)個(gè)前置柱前置柱，前置柱內(nèi)填充物和分離柱完全一樣，這，前置柱內(nèi)填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過前置柱為其中的固定相飽樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過分離柱時(shí)不再洗脫其中固定相，保和，使它在流過分離柱時(shí)不再洗脫其中固定相，保證分離技的性能不受影響。證分離技的性能不受影響。21 柱體為直型不銹鋼管，見下圖柱體為直型不銹鋼管，見下圖 柱子裝填得好壞對(duì)柱效影響

10、很大柱子裝填得好壞對(duì)柱效影響很大。對(duì)于細(xì)粒度。對(duì)于細(xì)粒度的填料（的填料（20m）一般采用）一般采用勻漿填充法勻漿填充法裝柱，先將裝柱，先將填料調(diào)成勻漿，然后在高壓泵作用下，快速將其壓填料調(diào)成勻漿，然后在高壓泵作用下，快速將其壓入裝有洗脫液的色譜柱內(nèi)，經(jīng)沖洗后，即可備用。入裝有洗脫液的色譜柱內(nèi)，經(jīng)沖洗后，即可備用。22 在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測(cè)器。 一類是溶質(zhì)性檢測(cè)器，它僅對(duì)被分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)，屬于這類檢測(cè)器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測(cè)器等。 另一類是總體檢測(cè)器，它對(duì)試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測(cè)器的有示差折光，電導(dǎo)檢測(cè)器等?，F(xiàn)將常用的檢測(cè)器介紹如下:2

11、31）紫外檢測(cè)器：適于吸收紫外光的物質(zhì)2）熒光檢測(cè)器：只能分析自身發(fā)光的物質(zhì) 靈敏度高3）示差折光檢測(cè)器：利用折光率的差別 靈敏度低,溫度要求嚴(yán)格。 幾乎所有物質(zhì)都有各自不同的折射率，因此示差折光檢測(cè)器是一種通用型檢測(cè)器。靈敏度可達(dá)10-7gcm-3。主要缺點(diǎn)是對(duì)溫度變化敏感，并且不能用于梯度淋洗。 4）電化學(xué)檢測(cè)器 5）化學(xué)發(fā)光 24紫外可見光、電化學(xué)檢測(cè)器的流通池比較25 應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。 特點(diǎn)特點(diǎn)：選擇性檢測(cè)器，如芳烴類化合物的檢測(cè)；靈敏度高，選擇性檢測(cè)器，如芳烴類化合物的檢測(cè)；靈敏度高，可檢測(cè)可檢測(cè)10-9g/mL的物質(zhì)；線性范圍

12、寬，的物質(zhì)；線性范圍寬，104-105；對(duì)溫度及流動(dòng)對(duì)溫度及流動(dòng)相的改變不敏感；適合梯度洗提；相的改變不敏感；適合梯度洗提；HPLC常規(guī)檢測(cè)器。常規(guī)檢測(cè)器。 分類分類：（1）固定波長的紫外檢測(cè)器（2）可變波長的紫外檢測(cè)器（3）二極管陣列檢測(cè)器26 特點(diǎn)：選擇性檢測(cè)器，如PAH，蛋白質(zhì)；高靈敏度，比紫外高約1000倍；適合梯度洗提。n 對(duì)對(duì)稱結(jié)構(gòu)的多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng).27 除紫外檢測(cè)器之外應(yīng)用最多的檢測(cè)器；可連續(xù)檢測(cè)參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值，差值與濃度呈正比。 特點(diǎn)：通用性檢測(cè)器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）；低靈敏

13、度；基線易受溫度的影響；不適合梯度洗提。 分類： 偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種；2829l其作用原理是根據(jù)物質(zhì)在某些介質(zhì)中離解后所產(chǎn)生的電導(dǎo)變化來測(cè)定離解物質(zhì)含量。l特點(diǎn)：選擇性檢測(cè)器，對(duì)離子型化合物有響應(yīng)；靈敏度高；受溫度的影響；不能梯度洗提30 示差折光示差折光紫外紫外熒光熒光電導(dǎo)電導(dǎo)應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍通用通用選擇性選擇性高選擇高選擇性性選擇性選擇性可否梯度淋洗可否梯度淋洗不可不可可可可可不可不可線性范圍線性范圍104105103104最小檢測(cè)量最小檢測(cè)量gngpgng對(duì)溫度敏感度對(duì)溫度敏感度敏感敏感低低低低敏感敏感溶劑使用情況溶劑使用情況無限制無限制受限制受限制受限制受限制受限制受限制31

14、高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約530 cm），所以柱外展寬（又稱柱外效應(yīng)）較突出。柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管道及檢測(cè)器中存在死體積。柱外展寬可分柱前和柱后展寬。進(jìn)樣系統(tǒng)是引起柱前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對(duì)進(jìn)樣技術(shù)要求較嚴(yán)。 32（）固定相（）固定相 高效液相色譜固定相以承受高壓能力來分類，可分為剛性固體和硬膠兩大類。剛性固體以二氧化硅為基質(zhì)，可承受7.01081.0109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。如果在二氧化硅表面鍵合各種官能團(tuán)，就是鍵合固定相，可擴(kuò)大應(yīng)用范圍，它是目前最廣泛使用的一種固定相。硬膠主要用于離子交換和

15、尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成?？沙惺軌毫ι舷逓?.5108Pa。 固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類。 33 它的基體是實(shí)心玻璃珠，在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料，如硅膠、氧化鋁、離子交換劑、分子篩、聚酸胺等。表面活性材料為硅膠的固定相如國外的Zpax，Corasil I和II，Vydac，Pellosil以及上海試劑一廠的薄殼玻璃珠等；表面活性材料為氧化鋁的固定相，如Pellumina；為聚酰胺的，如Pellion。這類固定相的多孔層厚度小、孔淺，相對(duì)死體積小，出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時(shí)能迅速達(dá)平衡，較適合做常規(guī)

16、分析。由于多孔層厚度薄，最大允許量受限制。 34 它由直徑為10nm的硅膠微粒凝聚而成。如國外的Porasil，Zobbex、Lichrosorb系列，上海試劑一廠的堆積硅珠，青島海洋化工廠的YWG系列，天津試劑二廠的DG系列等。也可由氧化鋁微粒凝聚成全多孔型固定相，如國外的Lichrosorb ALOXT。這類固定相由于顆粒很細(xì)（510m），孔仍然較淺，傳質(zhì)速率快，易實(shí)現(xiàn)高效、高速。特別適合復(fù)雜混合物分離及痕量分析.3536 由于高效液相色譜中流動(dòng)相是液體，它對(duì)組分有親和力，并參與固定相對(duì)組分的競爭。因此，正確選擇流動(dòng)相直接影響組分的分離度。對(duì)流動(dòng)相溶劑的要求是： （1）溶劑對(duì)于待測(cè)樣品，必

17、須具有合適的極性和良好的選擇性。 （2）溶劑要與檢測(cè)器匹配。對(duì)于紫外吸收檢測(cè)器，應(yīng)注意選用檢測(cè)器波長比溶劑的紫外截止波長要長。所謂溶劑的紫外截止波長指當(dāng)小于截止波長的輻射通過溶劑時(shí)，溶劑對(duì)此輻射產(chǎn)生強(qiáng)烈吸收，此時(shí)溶劑被看作是光學(xué)不透明的，它嚴(yán)重干擾組分的吸收測(cè)量。表20-2列出了一些常用溶劑的紫外截止波長。 對(duì)于折光率檢測(cè)器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動(dòng)相，以達(dá)最高靈敏度。3738（3）高純度。由于高效液相靈敏度高，對(duì)流動(dòng)相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會(huì)引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。痕量雜質(zhì)的存在，將使截止波長值增加501OOnm。（4）化學(xué)穩(wěn)定性好。不能選與樣品發(fā)生反應(yīng)或聚合

18、的溶劑。（5）低粘度。若使用高粘度溶劑，勢(shì)必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙腈等。但粘度過于低的溶劑也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它們易在色譜柱或檢測(cè)器內(nèi)形成氣泡，影響分離. 39（）液一液分配色譜法（LLPC） 在液-液色譜中,流動(dòng)相和固定相都是液體,它能適用于各種樣品類型的分離和分析，無論是極性的和非極性的，水溶性和油溶性的，離子型的和非離子型的化合物。1分離原理 液液分配色譜的分離原理基本與液液萃取相同，都是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的分配系數(shù)。所不同的是液液色譜的分配是在柱中進(jìn)行的，使這種分配平衡可反復(fù)多次進(jìn)行，造成各組分的差速遷移，提高了

19、分離效率，從而能分離各種復(fù)雜組分。 40 2. 固定相固定相 由于液液色譜中流動(dòng)相參與選擇競爭，因此，對(duì)固定相選擇較簡單。只需使用幾種極性不同的固定液即可解決分離問題。例如，最常用的強(qiáng)極性固定液，一氧二丙睛，中等極性的聚乙二醇，非極性的角鯊?fù)榈取?為了更好解決固定液在載體上流失問題。產(chǎn)生了。它是將各種不同有機(jī)基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到載體表面的一種方法。它代替了固定液的機(jī)械涂漬，因此它的產(chǎn)生對(duì)液相色譜法迅速發(fā)展起著重大作用，可以認(rèn)為它的出現(xiàn)是液相色譜法的一個(gè)重大突破。它是目前應(yīng)用最廣泛的一種固定相。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約有3/4以上的分離問題是在化學(xué)鍵合固定相上進(jìn)行的。 413流動(dòng)相流動(dòng)相 在液液色譜中為了避

20、免固定液的流失。對(duì)流動(dòng)相的一個(gè)基本要求是流動(dòng)相盡可能不與固定相互溶，而且流動(dòng)相與固定相的極性差別越顯著越好。根據(jù)所使用的流動(dòng)相和固定相的極性程度，將其分為正相分配色譜正相分配色譜和反相分配色譜反相分配色譜。如果采用流動(dòng)相的極性小于固定相的極性，稱為正相分正相分配色譜配色譜，它適用于極性化合物的分離。其流出順流出順序是極性小的先流出，極性大的后流出序是極性小的先流出，極性大的后流出。如果采用流動(dòng)相的極性大于固定相的極性，稱為反相分配色譜。它適用于非極性化合物的分離，其流出順序與正相色譜恰好相反。 42 采用化學(xué)鍵合相的液相色譜稱為化學(xué)鍵合相色譜法，簡稱鍵合相色譜。由于鍵合固定相非常穩(wěn)定，在使用中

21、不易流失，適用于梯度淋洗，特別適用于分離容量因子k值范圍寬的樣品。由于鍵合到載體表面的官能團(tuán)可以是各種極性的，因此它適用于種類繁多樣品的分離。 1鍵合固定相類型鍵合固定相類型 用來制備鍵合固定相的載體，幾乎都用硅膠硅膠。利用硅膠表面的硅醇基(Si一OH)與有機(jī)分可成鍵,即可得到各種性能的固定相。一般可分三類（1）疏水基團(tuán) 如不同鏈長的烷烴（C8和C18）和苯基等。（2）極性基團(tuán) 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。（3）離子交換基團(tuán) 如作為陰離子交換基團(tuán)的胺基，季鍍鹽； 作為陽離子交換 基團(tuán)的磺酸等.43 化學(xué)鍵合固定相: 目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳鍵型：硅氧碳鍵型： SiOC b

22、. 硅氧硅碳鍵型：硅氧硅碳鍵型：SiOSi C 穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣； c. 硅碳鍵型：硅碳鍵型： SiC d. 硅氮鍵型：硅氮鍵型： SiN443鍵合固定相的制備鍵合固定相的制備（l）硅酸酯（Si一OR）鍵合固定相,它是最先用于液相色譜的健合固定相。用醇與硅醇基發(fā)生酯化反應(yīng)： Si0HROHSiORH20 由于這類鍵合固定相的有機(jī)表面是一些單體，具有良好的傳質(zhì)特性,但這些酯化過的硅膠填料易水解且受熱不穩(wěn)定，因此僅適用于不含水或醇的流動(dòng)相。（2）SiC或Si一N共價(jià)鍵合固定相 制備反應(yīng)如下 45 共價(jià)鍵健合固定相不易水解，并且熱穩(wěn)定較硅酸

23、酯好。缺點(diǎn)是格氏反應(yīng)不方便；當(dāng)使用水溶液時(shí)，必須限制pH在48范圍內(nèi).OHSiSOCl2ClSi+HgBrSiSiNHCH2CHNH2H2NCH2CH2NH246（3）硅烷化（SiOSiC）鍵合固定相制備反應(yīng)如下： OHSiClSiR3+SiO(ROSiR3)SiR3+ HCl 這類鍵會(huì)固定相具有熱穩(wěn)定好，不易吸水，耐有機(jī)溶劑的優(yōu)點(diǎn)。能在70以下，pH = 28范圍內(nèi)正常工作，應(yīng)用較廣泛. 47（1）傳質(zhì)快傳質(zhì)快，表面無深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；（2）壽命長壽命長，化學(xué)鍵合，無固定液流失，耐流動(dòng)相沖擊； 耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，穩(wěn)定； （4）選擇性好選擇性好，可鍵合不同官能團(tuán)，提高選擇性

24、；（5）有利于梯度洗脫；有利于梯度洗脫； 存在著存在著雙重分離機(jī)制雙重分離機(jī)制：(鍵合基團(tuán)的覆蓋率決定分離機(jī)理),高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主； 48 此法是以極性的有機(jī)基團(tuán)，CN、NH2雙羥基等鍵合在硅膠表面，作為固定相；而以非極性或極性小的溶劑（如烴類）中加入適量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙腈等）為流動(dòng)相，分離極性化合物。此時(shí)，組分的分配比k值隨其極性的增加而增大，但隨流動(dòng)相極性的增加而降低。 這種色譜方法主要用于分離異構(gòu)體、極性不同的化合物，特別適用于分離不同類型的化合物。49 此法的固定相是采用極性較小的鍵合固定相，如硅膠一C18H37、硅膠一苯基等；流動(dòng)相是采用極性較強(qiáng)的溶劑

25、，如甲醇一水、乙腈一水、水和無機(jī)鹽的緩沖溶液等。它多用于分離多環(huán)芳烴等低極性化合物；若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液為流動(dòng)相，也可用于分離極性化合物；若采用水和無機(jī)鹽的緩沖液為流動(dòng)相，則可分離一些易離解的樣品，如有機(jī)酸、有機(jī)堿、酚類等。反相鍵合相色譜法具有柱效高，能獲得無拖尾色譜峰的優(yōu)點(diǎn)。 P94圖形（a）和（b） 50l關(guān)于反相鍵合相色譜的分離機(jī)理，可用所謂疏溶劑作用理論來解釋。這種理論把非極性的烷基鍵合相看作一層鍵合在硅膠表面上的十八烷基的“分子毛”，這種“分子毛”有較強(qiáng)的疏水特性。當(dāng)用極性溶劑為流動(dòng)相來分離含有極性官能團(tuán)的有機(jī)化合物時(shí)，一方面，分子中的非極性部分與固定相表面上的疏水烷

26、基產(chǎn)生締合作用，使它保留在固定相中；而另一方面，被分離物的極性部分受到極性流動(dòng)相的作用，促使它離開固定相，并減小其保留作用（見圖20-5）。顯然，兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行為。5152 對(duì)極性吸附和正相色譜，P與k的關(guān)系可大用下式表示：k2/k1=10(P1-P2)/2 對(duì)于反相色譜：k2/k1=10(P2-P1)/2什么是色譜的鍵合固定相什么是色譜的鍵合固定相?它與機(jī)械涂布的它與機(jī)械涂布的固定液有什么不同固定液有什么不同?l（1）通過化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合到）通過化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合到載體表面，形成吸附和分配機(jī)理兼有的載體表面，形成吸附和分配機(jī)理兼有的固定相稱為鍵合固定相。

27、固定相稱為鍵合固定相。l（2）鍵合固定相的有機(jī)分子是通過化）鍵合固定相的有機(jī)分子是通過化學(xué)反應(yīng)結(jié)合到載體表面，克服了固定液學(xué)反應(yīng)結(jié)合到載體表面，克服了固定液涂漬不均衡和流失等問題。固定液只涉涂漬不均衡和流失等問題。固定液只涉及到分配平衡機(jī)理，而鍵合固定相吸附及到分配平衡機(jī)理，而鍵合固定相吸附和分配平衡機(jī)理兼有。和分配平衡機(jī)理兼有。 54 當(dāng)以薄殼型或全多孔微粒型硅膠為基質(zhì)，化學(xué)鍵合各種離子交換基團(tuán)，如一SO3H 一CH2NH2、C00H、一CH2N（CH3）等時(shí)，就形成了離子性鍵合相色譜的固定相；流動(dòng)相一般采用緩沖溶液。其分離原理與離子交換色譜類同。 以上討論了各種類型化學(xué)鍵合相色譜法，歸納鍵

28、合相色譜的最大優(yōu)點(diǎn)是：通過改變流動(dòng)相的組成和種類，可有效地分離各種類型化合物（非極性、極性和離子型）。此外，由于鍵合到載體上的基團(tuán)不易流失，特別適用于梯度淋洗。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在高效液相色譜法中，約有8O的分離問題是用鍵合相色譜法解決。此法的最大缺點(diǎn)是不能用于酸、堿度過大或存在氧化劑的緩沖溶液作流動(dòng)相的體系。如何根據(jù)樣品極性種類來選擇化學(xué)鍵合的固定相，請(qǐng)參看表20-3。5556 液一固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相，吸附劑通常是些多孔的固體顆粒物質(zhì)，在它們的表面存在吸附中心。液固色譜實(shí)質(zhì)是根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同來進(jìn)行分離的。1分離原理 當(dāng)流動(dòng)相通過固定相（吸附劑）時(shí)，吸附劑表面的活性中心就

29、要吸附流動(dòng)相分子。同時(shí)，當(dāng)試樣分子（X）被流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，只要它們?cè)诠潭ㄏ嘤幸欢ǔ潭鹊谋Ａ艟鸵〈鷶?shù)目相當(dāng)?shù)囊驯晃降牧鲃?dòng)相溶劑分用）于是，在固定相表面發(fā)生競爭吸附: X + nSad = Xad + nS57達(dá)平衡時(shí),有 nadnadadSXSXK 其中Kad為吸附平衡常數(shù)，值大表示組分在吸附劑上保留強(qiáng)，難于洗脫。Kad值小,則保留值弱，易于洗脫。試樣中各組分據(jù)此得以分離。Kad值可通過吸附等溫線數(shù)據(jù)求出。 58 吸附色譜所用固定相多是一些吸附活性強(qiáng)弱不等的吸附劑，如硅膠、氧化鋁、聚酸膠等。由于硅膠的優(yōu)點(diǎn)較多，如線性容量較高，機(jī)械性能好，不溶脹，與大多數(shù)試樣不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)等，因此，以硅膠用得

30、最多。 在高效液相色譜法中，表面多孔型和全多孔型都可作吸附色譜中的固定相，它們具有填料均勻、粒度小。孔穴淺的優(yōu)點(diǎn)，能極大地提高柱效。但表面多孔型由于試樣容量較小，目前最廣泛使用的還是全多孔型微粒填料。59 一般把吸附色譜中流動(dòng)相稱作洗脫劑。在吸附色譜中對(duì)極性大的試樣往往采用極性強(qiáng)的洗脫劑；對(duì)極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑。洗脫劑的極性強(qiáng)弱可用溶劑強(qiáng)度參數(shù)（0）來衡量。0越大，表示洗脫劑的極性越強(qiáng)。表20-4列出一些常用溶劑在氧化鋁吸附劑中的0值。在硅膠吸附劑中0值的順序相同，數(shù)值可換算（0硅 膠=0770氧化鋁）。 6061 此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來測(cè)定溶液中陽離子和陰離子

31、的一種分離分析方法。凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換色譜法進(jìn)行分離。它不僅適用無機(jī)離子混合物的分離，亦可用于有機(jī)物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，應(yīng)用范圍較廣。 621離子交換原理 離子交換色譜法是利用不同待測(cè)離子對(duì)固定相親和力的差別來實(shí)現(xiàn)分離的。其固定相采用離子交換樹脂，樹脂上分布有固定的帶電荷基團(tuán)和可游離的平衡離子。當(dāng)待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹脂上可游離的平衡離子進(jìn)行可逆交換，其交換反應(yīng)通式如下：陽離子交換： RSO3-H+M+RSO3-M+ H+陰離子交換： RNR3+Cl-+ X-RNR3+X-+ Cl-一般形式： R一AB RBA63 式中Ar，

32、Br 分別代表樹脂相中洗脫劑離子（A）和試樣離子（B）的濃度，A、B則代表它們?cè)谌芤褐械臐舛?。離子交換反應(yīng)的選擇性系數(shù)見從表示試樣離子B對(duì)于A型樹脂親和力的大小：KB/A越大，說明B離子交換能力越大，越易保留而難于洗脫。一般說來，B離子電荷越大，水合離子半徑越小，KB/A值就越大。rrABABABK/64 對(duì)于典型的磺酸型陽離子交換樹脂，一價(jià)離子的KB/A按以下順序：Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li+二價(jià)離子的順序?yàn)椋?Ba2+Pb2+Sr2+Ca2+Cd2+Cu2+，Zn2+Mg2+對(duì)于季鋁型強(qiáng)堿陰離子交換樹指，各陰離子的選擇性順序?yàn)椋?ClO4-I-HS04-SCN-NO2-Br-C

33、N-Cl-BrO3-OH-HCO3-H2P04-IO3-CH3COOF2固定相 作為固定相的離子交換劑，其基質(zhì)大致有三大類：合成樹脂（聚苯乙烯）、纖維素和硅膠。而離子交換劑又有陽離子和陰離子之分。再根據(jù)官能基的離解度大小還有強(qiáng)弱之分（見表20-5）6566 常用的離子交換劑固定相大致可分以下幾種：常用的離子交換劑固定相大致可分以下幾種： （l）多孔型離子交換樹脂 它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交聯(lián)聚合物，直徑約為520m，有微孔型和大孔型之分.（2）薄膜型離子交換樹脂 它是在直徑約對(duì)30m的固體情性核上，凝聚12m厚的樹脂層.67（3）表面多孔型離子交換樹脂 它是在固體惰性核上，覆蓋一層微球硅

34、膠，再在上面涂一層很薄的離子交換樹脂.（4）離子交換鍵合固定相 它是用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團(tuán)鍵合到惰性載體表面。它也分為兩種類型。一種是鍵合薄殼型，其載體是薄殼玻珠。另一種是鍵合微粒載體型，它的載體是多孔微粒硅膠。后者是一種優(yōu)良的離子交換固定相，它的優(yōu)點(diǎn)是機(jī)械性能穩(wěn)定，可使用小粒度固定相和高柱壓來實(shí)現(xiàn)快速分離。 68 離子交換色譜法所用流動(dòng)相大都是一定pH和鹽濃度（或離子強(qiáng)度）的緩沖溶液。通過改變流動(dòng)相中鹽離子的種類、濃度和pH值可控制k值，改變選擇性。如果增加鹽離子的濃度，則可降低樣品離子的競爭吸附能力，從而降低其在固定相上的保留值。 69 關(guān)于pH值的影響，要視不同情況而定。例如，分離有機(jī)

35、酸和有機(jī)堿時(shí)，這些酸堿的離解程度可通過改變流動(dòng)相的pH值來控制。增大pH值會(huì)使酸的電離度增加，使堿的電離度減少；降低pH值，其結(jié)果相反。但無論屬于哪種情況，只要電離度增大，就會(huì)使樣品的保留增大。 70 離子色譜法是由離子交換色譜法派生出來的一種分離方法。由于離子交換色譜法在無機(jī)離子的分析和應(yīng)用受到限制。例如，對(duì)于那些不能采用紫外檢測(cè)器的被測(cè)離子，如采用電導(dǎo)檢測(cè)器，由于被測(cè)離子的電導(dǎo)信號(hào)被強(qiáng)電解質(zhì)流動(dòng)相的高背景電導(dǎo)信號(hào)掩沒而無法檢測(cè)。為了解決這一問題，1975年Small等人提出一種能同時(shí)測(cè)定多種無機(jī)和有機(jī)離子的新技術(shù)。他們?cè)陔x子交換分離柱后加一根抑制柱，抑制柱中裝填與分離柱電荷相反的離子交換樹

36、脂。通過分離柱后的樣品再經(jīng)過抑制柱，使具有高背景電導(dǎo)的流動(dòng)相轉(zhuǎn)變成低背景電導(dǎo)的流動(dòng)相，從而用電導(dǎo)檢測(cè)器可直接檢測(cè)各種離子的含量。這種色譜技術(shù)稱為離子色譜。若樣品為陽離子，用無機(jī)酸作流動(dòng)相，抑制柱為高容量的強(qiáng)堿性陰離子交換劑。當(dāng)試樣經(jīng)陽離子交換劑的分離往后，隨流動(dòng)相進(jìn)入抑制柱，在抑制柱中發(fā)生兩個(gè)重要反應(yīng)：71 R+OHH+Cl- -R+Cl十H2O R+一OH-M+Cl-M+OHR+Cl- 由反應(yīng)可見：經(jīng)抑制柱后，一方面將大量酸轉(zhuǎn)變?yōu)殡妼?dǎo)很小的水，消除了流動(dòng)相本底電導(dǎo)的影響。同時(shí)，又將樣品陽離子M+轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的堿，由于OH-離子的淌度為Cl-離子的2.6倍，提高了所測(cè)陽離子電導(dǎo)的檢測(cè)靈敏度。對(duì)于

37、陰離子樣品也有相似的作用機(jī)理。 在分離柱后加一個(gè)抑制柱的離子色譜亦稱為抑制型離子色譜或稱雙柱離子色譜。由于抑制柱要定期再生，而且譜帶在通過抑制柱后會(huì)加寬，降低了分離度。后來，F(xiàn)rits等人提出采用抑制柱的離子色譜體系，而采用了電導(dǎo)率極低的溶液，例如110-4510-4moldm-3苯甲酸鹽或鄰苯二甲酸鹽的稀溶液作流動(dòng)相，稱為非抑制型離子色譜或單柱離子色譜。72 離子對(duì)色譜法是分離分析強(qiáng)極性有機(jī)酸和有機(jī)堿的極好方法。它是離子對(duì)萃取技術(shù)與色譜法相結(jié)合的產(chǎn)物。在20世紀(jì)7O年代中期，Schill等人首先提出離子對(duì)色譜法，后來，這種方法得到十分迅速的發(fā)展。離子對(duì)色譜法原理 離子對(duì)色譜法是將一種（或數(shù)種

38、）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（稱對(duì)離子或反離子）加到流動(dòng)相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成離子對(duì)，從而控制溶質(zhì)離子保留行為的一種色譜法。關(guān)于離子對(duì)色譜機(jī)理，至今仍不十分明確，已提出三種機(jī)理：離子對(duì)形成機(jī)理；離子交換機(jī)理；離子相互作用機(jī)理?，F(xiàn)以離子對(duì)形成機(jī)理說明之。假如有一離子對(duì)色譜體系，固定相為非極性鍵合相，流動(dòng)相為水溶液，并在其中加入一種電荷與組分離子A-相反的離子B+，B+離子由于靜電引力與帶負(fù)電的組分離子生成離子對(duì)化合物A-B+。離子對(duì)生成反應(yīng)式 73 由于離子對(duì)化合物A-B+具有疏水性，因而被非極性固定相（有機(jī)相）提取。組分離子的性質(zhì)不同，它與反離子形成離子對(duì)的能力大小不同以及形成的離

39、子對(duì)流水性質(zhì)不同，導(dǎo)致各組分離子在固定相中滯留時(shí)間不同，因而出峰先后不同。這就是離子對(duì)色譜法分離的基本原理。74 式中為相比率。容量因子k隨KAB和B+水相的增大而增大。 鍵合相反相離子對(duì)色譜法操作簡便，只要改變流動(dòng)相的pH值、平衡離子的濃度和種類，就可在較大范圍內(nèi)改變分離的選擇性，能較好解決難分離混合物的分離問題。此法發(fā)展迅速，應(yīng)用較廣泛.1水相BKVVKkABMS75 尺寸排阻色譜法又稱凝膠色譜法，主要用于較大分子的分離。與其他液相色譜方法原理不同，它不具有吸附、分配和離子交換作用機(jī)理，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實(shí)現(xiàn)分離的。 尺寸排阻色譜被廣泛應(yīng)用于大分子的分級(jí)，即用來分析大分子物

40、質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的分布。它具有其他液相色譜所沒有的特點(diǎn)：（1）保留時(shí)間是分子尺寸的函數(shù)，有可能提供分子結(jié)構(gòu)的某些信息。(2)保留時(shí)間短，譜峰窄，易檢測(cè)，可采用靈敏度較低的檢測(cè)器（3）固定相與分子間作用力極弱，趨于零。由于柱子不能很強(qiáng)保留分子，因此柱壽命長。（4）不能分辨分子大小相近的化合物，相對(duì)分子質(zhì)量差別必須大于10才能得以分離。761分離原理分離原理 尺寸排阻色譜是按分子大小順序進(jìn)行分離的一種色譜方法。其固定相為化學(xué)惰性多孔物質(zhì)凝膠，它類似于分子篩，但孔徑比分子篩大。凝膠內(nèi)具有一定大小的孔穴，體積大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早地被淋洗出來；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入

41、內(nèi)，最后洗出色譜柱。這樣，樣品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。其滲透過程模型見圖20-7。 77分離原理示意圖分離原理示意圖78 2固定相固定相 排阻色譜固定相種類很多，一般可分為軟性、半剛性和剛性凝膠三類。表20-6列出了常用的一些固定相。 所謂凝膠，指含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于彈性的物質(zhì)，它是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體。 （1）軟性凝膠）軟性凝膠 如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠都具有較小的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，其微孔能吸入大量的溶劑，并能溶脹到它們干體的許多倍。它們適用以水溶性溶劑作流動(dòng)相，一般用于小分子質(zhì)量物質(zhì)的分析，不適宜用在高效液相色譜中。 （2）半剛性凝膠）半剛性凝膠 如高交聯(lián)度的聚苯乙烯（Styragel）比軟性凝膠稍耐壓，溶脹性不如軟性凝膠。常以有機(jī)溶劑作流動(dòng)相。用于高效液相色譜時(shí)，流速不宜大。 （3）剛性凝膠）剛性凝膠 如多孔硅膠、多孔玻璃等它們既可用水溶性溶劑，又可用有機(jī)溶劑作流動(dòng)相，可在較高壓強(qiáng)和較高流速下操作。一般控制壓強(qiáng)小于7MPa，流速1cm3s-1；否則將影響凝膠孔徑，造成不良分離。793流動(dòng)相流動(dòng)相80l大分子的分離分析大分子的分離分析l聚合物分子量分布的測(cè)定聚合物分子量分布的測(cè)定1.聚乙二醇40000 2.聚乙二醇100003.聚乙二醇3000 4.聚乙二醇1000 5.聚乙二醇81 親和色譜是利用生物大分子和固定相表面存在