污染物高效降解微生物的分離培養(yǎng)

1、9.8 污染物高效降解微生物的分離培養(yǎng) 微生物是地球生態(tài)系統(tǒng)中最重要的分解者，也是人類(lèi)生存環(huán)境的重要組成部分，同時(shí)也是人類(lèi)極其寶貴的資源庫(kù)。它與人類(lèi)的生產(chǎn)、生活，對(duì)人類(lèi)的生存發(fā)展，有著十分密切的關(guān)系。人們?cè)谥卫砦廴?、保護(hù)環(huán)境的不懈努力中，在為遇到種種難題所困擾的同時(shí)，已經(jīng)自覺(jué)或不自覺(jué)地利用并發(fā)揮著環(huán)境有益微生物的作用，而且在實(shí)踐中越來(lái)越認(rèn)識(shí)到微生物在污染物降解、資源再生利用、綠色產(chǎn)品生產(chǎn)、生態(tài)環(huán)境保護(hù)等方面的重要作用和巨大潛力。獲取高效菌種是開(kāi)發(fā)應(yīng)用環(huán)境有益微生物、并進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)，是該領(lǐng)域研究、開(kāi)發(fā)工作的源頭，也是產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的核心與關(guān)鍵。9.8.1 分離培養(yǎng)的基本原則和方法9.8.1

2、.1 確定分離培養(yǎng)目標(biāo) 了解目標(biāo)菌（微生物）的分布、營(yíng)養(yǎng)、生長(zhǎng)等特點(diǎn)，以及它們具有的或應(yīng)具有的一些功能特性，并進(jìn)而制定試驗(yàn)方案。如用于生物脫氮或NH3-N去除、轉(zhuǎn)化的硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌的分離，前者應(yīng)是具有氨氧化作用的亞硝酸細(xì)菌和能氧化亞硝酸為硝酸的硝酸細(xì)菌。又如用于有機(jī)生活垃圾的快速處理與利用的高效微生物的分離，這些微生物的作用應(yīng)能有效地使垃圾達(dá)到無(wú)害化、減量化、資源化，因此它們的發(fā)酵溫度應(yīng)該很高，即應(yīng)具有耐高溫的特性，以及對(duì)蛋白質(zhì)、纖維素等有機(jī)物的很高的分解能力。9.8.1.2 選擇分離源 以目標(biāo)微生物上述特征為依據(jù)，選擇并確定分離源。該分離源應(yīng)具備以下條件：（1）所處的條件較有利于目標(biāo)微

3、生物的生長(zhǎng)。（2）存在有較大的數(shù)量。（3）有可能具備為目標(biāo)菌設(shè)定的功能特性。9.8.1.3 分離“篩”的設(shè)定是選擇培養(yǎng)法的核心（1）選擇培養(yǎng)基的利用。 根據(jù)目標(biāo)微生物特定的營(yíng)養(yǎng)要求，設(shè)計(jì)相應(yīng)的選擇培養(yǎng)基。例如，可利用不加氮源的培養(yǎng)基來(lái)分離固氮菌；解酚菌的培養(yǎng)基中應(yīng)以酚作為碳源。（2）選擇培養(yǎng)條件的利用。 可利用目標(biāo)菌對(duì)氧、光、pH、溫度、鹽分、壓力等的不同要求來(lái)設(shè)定選擇培養(yǎng)條件。例如，可用搖床培養(yǎng)來(lái)滿足好氧菌生長(zhǎng)時(shí)對(duì)氧的要求；為分離芽孢桿菌，可利用芽孢耐高溫的特性，預(yù)先對(duì)樣品用800C水浴處理1020分鐘。（3）對(duì)毒物、抗菌素等特殊的敏感性或耐受性的利用。 例如，分離放線菌時(shí)可加重鉻酸鉀來(lái)抑制

4、細(xì)菌和霉菌生長(zhǎng)，其加量為每300ml改良高氏一號(hào)培養(yǎng)基中加3%重鉻酸鉀1ml。9.8.1.4 分離樣品的破碎、分散處理進(jìn)行微生物分離培養(yǎng)前，必須對(duì)分離樣品，如土壤、淤泥、活性污泥或生物膜等等充分破碎、分散，盡可能使著生在土壤粒子內(nèi)外的微生物、組成污泥菌膠團(tuán)的微生物都分散成單個(gè)細(xì)胞懸浮在樣品中。樣品分散程度關(guān)系到分離培養(yǎng)與計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性，必須十分重視。具體可采用以下方法： 在放有少量玻璃珠的無(wú)菌三角瓶中加入樣品(土壤、淤泥、活性污泥、生物膜等)，再加入0.01%的焦磷酸鈉作為解絮劑，用旋渦振蕩器振蕩使樣品充分分散后，再用超聲波破碎（在冰浴中進(jìn)行），然后以無(wú)菌水稀釋備用。9.8.1.5 富集培養(yǎng)

5、 利用目標(biāo)微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)、生長(zhǎng)條件、毒物敏感性、生長(zhǎng)速度等方面的特點(diǎn)，也即利用設(shè)定的篩子先進(jìn)行富集培養(yǎng)，使分離源中的目標(biāo)微生物數(shù)量增加，有用的性狀得到改善與提高。（1）增加目標(biāo)微生物的數(shù)量，提高優(yōu)勢(shì)度。（2）與定向馴化培養(yǎng)相結(jié)合，提高、改善目標(biāo)微生物某些特定的性狀。（3）減少非目標(biāo)微生物的數(shù)量。（4）有利于獲得與特定環(huán)境相融性好的目標(biāo)微生物群體。9.8.1.6 目標(biāo)微生物的分離純化 （1）用稀釋平板法(混菌、涂布或劃線分離)或MPN法進(jìn)行分離純化。 挑取單菌落，獲得一批菌株，并進(jìn)一步作純化分離，最后得到純菌株。（2）性狀確認(rèn)，并與篩選相結(jié)合，好中選優(yōu)。9.8.1.7 純化分離菌株的保存 菌種保存

6、時(shí)一般都要求不受雜菌污染，菌株變異很少，并能盡量保持細(xì)菌的形態(tài)和生理性狀不發(fā)生變化。同時(shí)，還應(yīng)注意以下事項(xiàng)：（1）做好菌種保存記錄，注明菌株名稱(chēng)、分離年月日、分離者姓名、 分離地點(diǎn)等，還應(yīng)記錄有關(guān)菌株性質(zhì)的數(shù)據(jù)。（2）為防止雜菌污染及意外事故，一種菌應(yīng)保存23支試管備用。（3）原始菌株必須妥善保存。 具體保存方法請(qǐng)參考有關(guān)文獻(xiàn)。 9.8.2 細(xì)菌、放線菌、真菌和酵母菌的計(jì)數(shù)與分離9.8.2.1 計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基 細(xì)菌、放線菌在清蛋白瓊脂培養(yǎng)基上，280C、培養(yǎng)10天計(jì)數(shù)。 清蛋白瓊脂培養(yǎng)基配方：蛋清蛋白 0.25 gFe2(SO4)3微量葡萄糖 1.0g 瓊脂 15 gK2HPO4 0.5g水 1

7、000 mlMgSO47H2O0.2 g pH6.87.0蛋清蛋白用0.1N NaOH數(shù)mL溶解，加一滴酚酞，使呈微紅色即可。該培養(yǎng)基適于營(yíng)養(yǎng)貧瘠型類(lèi)群計(jì)數(shù)使用。非貧營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌的計(jì)數(shù)可采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。 牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基配方：牛肉膏35g瓊脂1520g蛋白胨10 g水1000 mlNaCl5 g pH7.07.2121， 20 min 若培養(yǎng)厭氧菌，則再加入：半胱氨酸-HCl 0.3g 真菌在孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基上，25、培養(yǎng)35天計(jì)數(shù). 孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基配方：KH2PO41.0g孟加拉紅0.033gMgSO47H2O0.5g 瓊脂20 g蛋白胨5.0g水1000 ml葡萄糖1

8、0.0gpH6.8100ml培養(yǎng)基中加入1/300孟加拉紅1ml，加壓滅菌，冷卻至4245時(shí)，無(wú)菌地加入經(jīng)賽氏濾器過(guò)濾除菌的鏈霉素30微克/毫升或金霉素2微克/毫升。9.8.2.2 細(xì)菌、放線菌、霉菌和酵母菌的區(qū)別方法不論是何種培養(yǎng)基，除加有抑制劑外，一般三大類(lèi)菌都可能生長(zhǎng)，所以應(yīng)了解它們菌落特征的基本區(qū)別。細(xì)菌：菌落小，細(xì)胞球狀（直徑0.51.0m），桿狀（寬0.51.5m，長(zhǎng)1.04.0m)。放線菌：菌落較細(xì)菌干燥，不光滑，與培養(yǎng)基結(jié)合較牢.菌絲細(xì)（寬約1.0m），直徑與細(xì)菌相仿，分枝不分隔，可擴(kuò)展成放射狀；一般有基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲之分，由孢子絲產(chǎn)生孢子。孢子的顏色、形狀大小和菌絲

9、體可溶性色素的有無(wú)等特征，是菌種鑒別的主要依據(jù)之一。 霉菌：霉菌是絲狀真菌的通稱(chēng)。菌絲粗大，寬約4.08.0m，無(wú)色透明或呈現(xiàn)各種鮮艷的顏色，有營(yíng)養(yǎng)菌絲與繁殖菌絲之分.多數(shù)霉菌菌絲有分隔，為多細(xì)胞分枝絲狀體.菌落疏松呈絮狀.孢子成熟時(shí)使菌落表面呈粉末狀或顆粒狀.孢子顏色因種而異，常與霉菌的水溶性色素不一而形成菌落正反面呈現(xiàn)不同顏色.各種霉菌在一定的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成的菌落大小、形狀、顏色等特征相對(duì)穩(wěn)定，是霉菌鑒定的主要依據(jù)之一。酵母菌：多數(shù)酵母菌菌落與細(xì)菌相似，但較大而厚，且多數(shù)不透明。大多菌落光滑、濕潤(rùn)、粘稠，乳白色，少數(shù)干皺，呈紅色或粉紅色。菌體直徑410m，圓形、橢圓 形、卵形、檸檬形、黃

10、瓜形等，在液體培養(yǎng)中酵母菌體生長(zhǎng)常會(huì)生成沉淀或形成菌膜。這些都是菌種鑒定的依據(jù)。9.8.2.3 放線菌的分離培養(yǎng) 放線菌為G+、單細(xì)胞原核微生物，菌體絲狀，分枝而不分隔，一般有基內(nèi)菌絲、氣生菌絲及孢子絲之分。放線菌中有許多種類(lèi)產(chǎn)抗生素，諾卡氏菌的某些種在石油脫蠟、烴類(lèi)分解、丙烯腈廢水的處理中起作用，還有的種可分解纖維素、木質(zhì)素。 放線菌分離方法如下：（1）樣品充分分散，并制成稀釋?xiě)乙?，分純培養(yǎng)宜取高稀釋度。（2）在稀釋液中加細(xì)菌抑制劑：鏈霉素 2550/ml，或30%酚 10滴。再加霉菌抑制劑：制霉菌素 50/ml。（3）培養(yǎng)基：Waksman清蛋白培養(yǎng)基：蛋清蛋白0.25g瓊脂1520gFe

11、2(SO4)30.01gH2O1000 mlMgSO47H2O0.2 gpH6.87.0葡萄糖1 g 蛋清蛋白用0.1N NaOH數(shù)ml溶解，此培養(yǎng)基可供菌數(shù)測(cè)定及菌種純化分離使用。 改良高氏一號(hào)培養(yǎng)基：FeSO47H2O0.01gK2HPO4 0.5gMgSO47H2O0.5g淀粉(可溶性)20g NaCl0.5gH2O1000ml KNO31.0g 以少量水把淀粉調(diào)成糊狀后加入培養(yǎng)基中.每300ml培養(yǎng)基中加3%重鉻酸鉀1ml，以抑制細(xì)菌和霉菌的生長(zhǎng).（4）平板分離：平板涂布分離培養(yǎng)：接種菌懸液取0.1ml.推布均勻。平板混菌分離培養(yǎng)：接種菌懸液取0.51ml，加入無(wú)菌平皿，倒入 450C

12、左右的培養(yǎng)基，混勻。把接種好的平板置于25300C，培養(yǎng)715天。（5）在上述平板上挑取單菌落，接入高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板，進(jìn)行純化培養(yǎng)，280C，培養(yǎng)714天（一般7天）。9.8.2.4 酵母菌的分離培養(yǎng) 酵母菌與人類(lèi)關(guān)系密切。菌體內(nèi)蛋白質(zhì)含量高，含多種氨基酸、VB、脂肪及其他生長(zhǎng)因素。酵母菌許多種具有同化烴類(lèi)化合物的能力，分解石油中的的蠟質(zhì)，使凝固點(diǎn)降低，并獲得大量菌體；還可用于酒精廢水、屠宰廢水、糖蜜廢水等的處理與資源化，得到飼料酵母。另?yè)?jù)研究，熱帶假絲酵母對(duì)含酚廢水有很好的處理效果。 酵母菌往往生長(zhǎng)在含糖較高的環(huán)境中。多數(shù)為腐生，喜偏酸條件，最適pH為4.56。在酸性液體培養(yǎng)基中酵母菌比霉

13、菌生長(zhǎng)快，酸性又可抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，故可用于酵母菌的富集培養(yǎng)。（1）培養(yǎng)基 乳酸-馬鈴薯-葡萄糖培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g乳酸5 mL 葡萄糖20 g水1000 Ml制法：馬鈴薯去皮、切片、稱(chēng)取200g，加水煮沸30分鐘，紗布過(guò)濾，補(bǔ)足水至1000mL，成20% 馬鈴薯汁，加入其他成分即成。1150 C， 20分鐘， pH自然。 麥芽汁培養(yǎng)基制法： 發(fā)芽：大麥或小麥若干，洗凈，浸水612小時(shí)，150C，暗處發(fā)芽，上蓋紗布一塊，早、中、晚各淋水一次。當(dāng)麥根長(zhǎng)至麥粒兩倍時(shí)，停止發(fā)芽，曬干或烘干備用。 糖化：將麥芽磨碎，1份麥芽加4份水，650C水浴中糖化34小時(shí)，用碘液檢查糖化程度。 過(guò)濾：糖化液用46

14、層紗布過(guò)濾。若混濁，可用蛋清一只與20mL水調(diào)至生泡沫，加入糖化液中攪拌、煮沸，再過(guò)濾。 稀釋?zhuān)簩V清的糖化液稀釋至56波美度，pH約6.4，加2% 瓊脂，1210C，20分鐘滅菌。（2）富集培養(yǎng) 將待分離樣品放入盛有無(wú)菌水與玻璃珠的三角瓶中，使樣品振蕩分散后取上清液，接種于乳酸-馬鈴薯-葡萄糖培養(yǎng)液中（或酸性麥芽汁中），25280C，培養(yǎng)37天，培養(yǎng)液變混濁，產(chǎn)生菌膜或沉淀物。制片，用美蘭染液染色?；罱湍缚蛇€原美蘭染液，故菌體無(wú)色。（3）分離 取富集液，經(jīng)適當(dāng)稀釋?zhuān)?.2mL接入馬鈴薯-葡萄糖瓊脂平板或麥芽汁瓊脂平板，用玻璃棒涂布。正放于25280C，培養(yǎng)24小時(shí)，表面水份吸干后再倒置培

15、養(yǎng)。（4）純化與保存 挑取單菌落，用平板劃線分離、純化。純化后的菌株接種于麥芽汁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2天后注入液體石蠟（無(wú)菌石蠟要滅菌2次以上）。45保存。9.8.2.5 絲狀真菌(霉菌)的分離培養(yǎng) 霉菌喜生存于偏酸性、有機(jī)質(zhì)較豐富的環(huán)境。絕大多數(shù)為好氧菌。 霉菌中不少菌種被應(yīng)用于發(fā)酵食品、制有機(jī)酸、抗生素、酶制劑。還有人利用鐮刀霉處理含氰廢水，利用根霉、毛霉處理酒精廢水，顯示了較強(qiáng)的分解有機(jī)質(zhì)的能力。 霉菌分離的主要關(guān)鍵是選擇合適的培養(yǎng)基和控制適宜的培養(yǎng)條件。（1）培養(yǎng)基 馬鈴薯培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g 蔗糖20 g瓊脂1520 g水1000 mLpH 自然，制法同酵母菌的乳酸-馬鈴薯-葡

16、萄糖培養(yǎng)基。 馬?。∕artin）培養(yǎng)基：蛋白質(zhì)5gMgSO47H200.5g葡萄糖10gKH2PO41.0g瓊脂1820gH2O 1000 mL 加入1%孟加拉紅水溶液3.3mL.1210C，20分鐘滅菌. 臨用時(shí)每100mL培養(yǎng)基加入1%鏈霉素溶液0.3mL. 乳酸-馬鈴薯-葡萄糖培養(yǎng)基中的葡萄糖改成蔗糖，可用于霉菌培養(yǎng)。 查氏培養(yǎng)基：蔗糖30gFeSO40.01g NaNO32.0gMgSO47H200.5gKCl0.5 g瓊脂1820gK2HPO41.0gH2O1000mlpH自然，1150C，滅菌20分鐘。 其他： 利用一些特定的材料作培養(yǎng)基，如可利用新鮮橘皮培養(yǎng)青霉，利用甜酒曲培養(yǎng)

17、根霉等等。（2） 霉菌的分離與純化 將分離用的樣品，以無(wú)菌水制成一系列10倍稀釋?xiě)乙骸?根據(jù)樣品來(lái)源選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基。分離土壤樣品較多采用馬丁（Martin）瓊脂培養(yǎng)基或馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，霉變材料及河塘泥、生物膜等樣品中霉菌的分離多用查氏瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯-葡萄糖瓊脂、或馬丁氏瓊脂等。 用無(wú)菌吸管分別吸取0.51mL不同稀釋度的菌懸液，接入無(wú)菌平板，按常規(guī)的混菌法或涂布法進(jìn)行分離操作.每個(gè)稀釋度一般做三個(gè)平皿. 置于23280C培養(yǎng)37天，待菌落長(zhǎng)好作進(jìn)一步分離純化. 依據(jù)菌落形狀、質(zhì)地和正反面顏色，判斷是否為純培養(yǎng)物。如有細(xì)菌或其他雜菌污染，則可挑取霉菌孢子或菌絲，用平板劃線法重復(fù)分

18、離純化。對(duì)于形成固定菌落的如青霉、曲霉等，可用稀釋平板混菌法分離純化。菌落不定形、蔓延繁殖的如根霉、毛霉等，因兩個(gè)菌落極易接觸混雜，故分離時(shí)需采用較高的稀釋度或以培養(yǎng)1624小時(shí)內(nèi)生長(zhǎng)的菌絲接種。 9.8.3 特定微生物的分離培養(yǎng)9.8.3.1 芽孢菌的分離培養(yǎng) 芽孢菌參與許多有機(jī)物的轉(zhuǎn)化及生物降解，多數(shù)為好氧或兼性厭氧微生物，菌體桿狀或球狀。芽孢是在菌體內(nèi)形成的圓形或橢圓形的內(nèi)生孢子。芽孢的代謝活力弱，對(duì)不良環(huán)境如高溫、干燥、化學(xué)藥品等的抵抗力強(qiáng)。 分離步驟如下：（1）將水樣接種于刺激芽孢生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中，350C培養(yǎng)1824小時(shí)。將培養(yǎng)好的菌懸液置于800C水浴中加熱1020分鐘以殺死不能形

19、成芽孢的菌體。 刺激芽孢生長(zhǎng)的培養(yǎng)基如下：蛋白胨10gKH2PO41.5g酵母膏3gNa2HPO42 g淀粉3gH2O1000 mlMgSO47H2O0.1gpH7.81210C，15分鐘（2）將加熱處理過(guò)的菌懸液稀釋為10-3、10-4、10-5，分別取0.5mL接入無(wú)菌平板，倒入芽孢菌分離培養(yǎng)基，混勻，置于35，培養(yǎng)1824小時(shí)。 芽孢菌分離培養(yǎng)基如下： 用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基與70Bx麥芽汁培養(yǎng)基，溶化后以1:1的量混勻即成.營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配方為：肉膏35gNaCl5 g 蛋白胨10 g瓊脂1520g H2O1000mlpH 7.07.2121，20分鐘 （3）挑取單菌落作分離純化培養(yǎng)： 單菌

20、落液體培養(yǎng)基菌懸液劃線分離，經(jīng)數(shù)次重復(fù)，直至由單個(gè)細(xì)胞形成單獨(dú)的菌落。9.8.3.2 硝化細(xì)菌的分離培養(yǎng) 在污水、污泥或土壤中，有機(jī)氮化合物經(jīng)氨化細(xì)菌作用，分解成氨，硝化細(xì)菌又將氨氧化成硝酸鹽，此過(guò)程為硝化作用。它包括兩個(gè)連續(xù)的階段：首先，氨經(jīng)亞硝酸細(xì)菌作用氧化為亞硝酸；亞硝酸又經(jīng)硝酸細(xì)菌作用氧化為硝酸。亞硝酸細(xì)菌與硝酸細(xì)菌合稱(chēng)為硝化細(xì)菌。它們都為好氧化能自養(yǎng)菌。此外，還有一些異養(yǎng)細(xì)菌和放線菌、真菌中的某些種類(lèi)，也能將氨轉(zhuǎn)化成亞硝酸或硝酸。硝化細(xì)菌的分離純化比較困難，主要是因?yàn)橄趸?xì)菌生長(zhǎng)緩慢，而伴生的異養(yǎng)細(xì)菌生長(zhǎng)迅速。在選擇性較強(qiáng)的硅膠平板上長(zhǎng)出的菌落很小，直徑僅有100m，分離難度很大。（

21、1）亞硝酸細(xì)菌的分離培養(yǎng) 樣品采集 作為亞硝酸細(xì)菌的分離源，可采取湖泊中的表層淤泥、溝渠軟泥或城市污水廠的活性污泥。 亞硝酸細(xì)菌富集培養(yǎng)基：(NH4)2S042gK2HPO4 1gMgSO4 7H200.5gCaCO35gFeSO47H2O0.4gH2O1000mL NaCl2gpH 7.2 除CaCO3外，其余成分溶解于水中，裝瓶后按0.5%的比例加入CaCO3，1210C，滅菌20分鐘。 若培養(yǎng)硝酸細(xì)菌，則以KNO2 2g代替(NH4)2S04。 亞硝酸細(xì)菌富集培養(yǎng) 目的是大量淘汰異養(yǎng)細(xì)菌，增加亞硝酸細(xì)菌的菌數(shù)。具體方法如下： a. 取泥樣0.51g，投加于富集培養(yǎng)液中，混勻，置于280C

22、下培養(yǎng)23天后，開(kāi)始檢測(cè)NO2-鹽的生成，通常在7天左右NO2-鹽大量出現(xiàn)。 b. 當(dāng)檢出NO2-鹽后，取0.1mL富集培養(yǎng)液接種到新鮮的富集培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)并檢測(cè)NO2-鹽。 c. 經(jīng)7次重復(fù)富集培養(yǎng)后，開(kāi)始連續(xù)供給能源，即每隔35天，添加5%硫酸銨溶液23mL，并加入適量碳酸鈣。 硅膠平板培養(yǎng)基的制備 將硅酸鉀或硅酸鈉配制成比重為1.10的溶液，過(guò)濾澄清。取比重為1.09的鹽酸，與等體積的上述溶液混合。操作時(shí)將硅酸鈉緩慢加入鹽酸內(nèi)，攪拌均勻，倒入培養(yǎng)皿內(nèi)。每皿2025mL，靜置24小時(shí)，待凝固成平板后用緩流水沖洗23天，以除去氯離子，直至Cl-完全消失。滴加1%硝酸銀溶液測(cè)試，如呈白色，

23、表明有Cl-需繼續(xù)沖洗。沖洗后的平板用煮沸的蒸餾水沖洗三次以滅菌?；蛴米贤饩€照射滅菌。操作時(shí)將培養(yǎng)皿置于距紫外燈20cm處，照射30分鐘，皿蓋置于一邊同時(shí)滅菌。然后，在每個(gè)硅膠平板上加亞硝酸菌富集培養(yǎng)基2mL和5%(NH4)2S04 溶液1mL。輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)液分布均勻。打開(kāi)皿蓋在500C烘箱內(nèi)烘至平板無(wú)水流動(dòng)為止。 .亞硝酸細(xì)菌的分離純化 用無(wú)菌吸管吸取0.10.2mL富集培養(yǎng)液，接種到上述制成的硅膠平板上。用無(wú)菌玻璃推棒將菌液均勻涂布在平板上。置于底部盛水的干燥器內(nèi)（防水分蒸發(fā)，免使平板干裂），在28300C下培養(yǎng)1530天。當(dāng)硅膠平板出現(xiàn)亞硝酸細(xì)菌菌落后，挑起菌落再接種到液體培養(yǎng)

24、基中，通過(guò)測(cè)定NO2-的生成來(lái)確定亞硝酸細(xì)菌的增殖情況。同時(shí)，取少量培養(yǎng)物接種到肉湯蛋白胨培養(yǎng)基中，如觀察到培養(yǎng)液中有異養(yǎng)細(xì)菌生長(zhǎng)，則必須重復(fù)以上的純化分離操作。也可用接種環(huán)挑取富集培養(yǎng)液，點(diǎn)種于硅膠平板分離培養(yǎng)基表面。在皿蓋上放一張濕濾紙或如前法培養(yǎng)。由于硅膠平板有高度的選擇性，在點(diǎn)樣周?chē)木渚莵喯跛峒?xì)菌。 (2) 硝酸細(xì)菌的分離培養(yǎng) 取污泥或土壤少量，分別接種于硝酸細(xì)菌富集培養(yǎng)液中，混勻，30培養(yǎng)。在富集培養(yǎng)時(shí)要連續(xù)供給5%亞硝酸銨溶液數(shù)毫升，以代替硫酸銨，也有利于抑制其他菌的繁殖。 硝酸細(xì)菌的分離純化方法，原則上與亞硝酸細(xì)菌相同，可采用硅膠平板法。但在硅膠平板上要加5%亞硝酸銨溶液1

25、mL以替代硫酸銨溶液，還要投加硝酸細(xì)菌培養(yǎng)基2mL。培養(yǎng)后，在硅膠平板深層形成針頭狀菌落。也可利用硝酸細(xì)菌富集培養(yǎng)基中投加1.52%瓊脂，制成固體平板，用此平板進(jìn)行分離純化。9.8.3.3 纖維素分解菌的分離培養(yǎng) 纖維素是組成植物細(xì)胞壁的主要成分，是地球上存在量最為豐富的有機(jī)物。它性狀比較穩(wěn)定，不易分解。因此，它是一類(lèi)數(shù)量龐大的環(huán)境污染物，同時(shí)又是一項(xiàng)可開(kāi)發(fā)利用的寶貴資源，它的綜合利用具有廣闊前景。自然界有一部分細(xì)菌、放線菌和真菌能誘導(dǎo)產(chǎn)生纖維素酶，進(jìn)行纖維素的分解。能分解纖維素的好氧細(xì)菌主要有： 噬纖維黏菌屬(Cytophaga)、 生孢噬纖維黏菌屬(Sporocytophaga)、 纖維弧

26、菌屬(Cellvibrio)， 分解纖維素的厭氧細(xì)菌有： 奧氏梭菌(Clostridium omelianski)、 高溫溶纖維梭菌(C. Thermocelluloseum)等。 真菌中主要有以下屬的一些種： 木霉(Trichoderma)、 葡萄狀穗霉(Stachybotrys)、 葡萄孢霉(Botrytis)、 曲霉(Aspergillus)、 青霉(Penicillium)、 毛殼霉、 好熱霉 (Thermomyces)。 放線菌的諾卡氏菌屬（Nocardia）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、小單胞菌屬（Micromonospora）中也都有一些能分解纖維素的種。(1) 好氣性

27、纖維素分解菌的分離 分離源 草地表層土壤、堆腐爛植物體、湖水等可作為好氣性纖維素分解菌的分離源 培養(yǎng)基 Dubos纖維素培養(yǎng)基：NaNO30.5gK2HPO41gFe2(SO4)37H2O微量H2O1000mLMgSO47H2O0.5gpH7.5KCl0.5g 濾紙剪成小條，放入試管中，使略露出液面. Hutchison培養(yǎng)基：KH2PO41gFeCl30.01gMgSO47H2O0.3gNaNO32.5gCaCl20.1gH2O1000mLNaCl0.1gpH7.27.4 若制平板，加瓊脂1820g，1210C，滅菌15分鐘. 操作方法 a. 將采取的待分離樣品，用無(wú)菌水制成10-110-3

28、不同稀釋度的懸液。 b. 用無(wú)菌移液管吸取上述樣品懸液，接種于裝有10mL Dubos纖維素培養(yǎng)基的試管內(nèi) c. 置于25270C條件下培養(yǎng)。 每天觀察培養(yǎng)管內(nèi)的變化，注意液面附近的濾紙變薄或出現(xiàn)斑點(diǎn)。如果分解旺盛甚至可見(jiàn)濾紙條被完全切斷。 d. 將無(wú)菌的Hutchison培養(yǎng)基融化，注入滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，制成平板。把上述試管內(nèi)正在破碎的濾紙適當(dāng)稀釋制成懸液，吸取0.5mL接入平板上，用玻璃推棒涂布均勻，再在瓊脂表面覆蓋一張無(wú)菌濾紙，用玻璃棒（或玻璃刮刀）壓平，使濾紙緊貼在瓊脂表面。 e. 把上述平板置于底部盛水的干燥器隔板上，28300C，培養(yǎng)710天。 f. 純化分離 用接種環(huán)挑取濾紙上的菌落

29、，在含0.1%葡萄糖（過(guò)濾除菌）的赫氏平板上劃線分離。重復(fù)數(shù)次，直至分純。 g. 將濾紙剪成小片，滅菌后放到無(wú)碳源的赫氏培養(yǎng)基平板上。把在葡萄糖赫氏平板上生長(zhǎng)的菌落，移接到濾紙片上，并在皿底相對(duì)應(yīng)地編號(hào)。經(jīng)培養(yǎng)后確認(rèn)分解濾紙的菌種，從相應(yīng)的葡萄糖赫氏平板上移接到赫氏液體培養(yǎng)基（不加瓊脂）的濾紙條上保存。 厭氣性纖維素分解菌的分離 取1g土壤（或稀釋到10-2的菌懸液1mL），接種到已滅菌的磷酸銨鈉培養(yǎng)基中，28300C，嚴(yán)格厭氧培養(yǎng)。培養(yǎng)2周左右，濾紙溶解后，再重復(fù)移殖34次，或取濾紙上生長(zhǎng)的斑點(diǎn)，黃色部分，經(jīng)稀釋后在平板上涂布分離。 磷酸銨鈉培養(yǎng)基配方如下：Na(NH4)HPO42gCaCO

30、35gKH2PO41gCaCl26H2O0.3gMgSO47H2O0.5g蛋白胨1gH2O1000mL 分裝試管，液層要較高，以利于深層培養(yǎng)。同時(shí)，插入濾紙條，一端露出液面。1210C滅菌20分鐘。 注意：濾紙使用前必須檢查是否有淀粉?？稍跒V紙上滴加 稀碘液，如顯蘭色，示有淀粉存在。則可用1%稀醋酸浸泡 一晝夜，用碘液檢查確認(rèn)無(wú)淀粉后，再用2%蘇打水沖洗至中性，干熱滅菌后備用。 9.8.3.4 解酚菌的分離培養(yǎng) 在工業(yè)廢水的生物處理中，針對(duì)一些特定的污染物，分 離、選育高效降解菌 并接種到活性污泥或生物膜中，往往可 使處理效果明顯提高。酚是多種工業(yè)廢水中大量存在的有機(jī) 污染物，含酚廢水的排放量

31、相當(dāng)大，而且較高濃度的酚對(duì)生 物具有毒性。因此，提高含酚廢水的處理效果，或使發(fā)生故 障的系統(tǒng)及時(shí)恢復(fù)處理效果，一直是該領(lǐng)域有關(guān)人員十分關(guān) 注的問(wèn)題。而高效解酚菌的分離培養(yǎng)和應(yīng)用是解決上述問(wèn)題 的有效途徑。這里就酚分解微生物的分離培養(yǎng)方法作一簡(jiǎn)要 介紹。 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基肉膏35gNaCl5g蛋白胨10gH2O1000mlpH7.07.21210C，20 營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基 肉膏35gNaCl5g蛋白胨10g瓊脂1520gH2O1000ml pH 7.07.2，1210C，20 尿素培養(yǎng)基10%尿素5mlMgSO40.05g葡萄糖1gH2O995mLK2HPO40.1gpH77.5 配

32、制時(shí)，除尿素外，其它成分混合在蒸餾水中，調(diào)pH至77.5，1150C滅菌10分鐘，待培養(yǎng)基稍冷，以無(wú)菌操作加入事先滅菌（過(guò)濾除菌）的尿素溶液，備用。 步驟 采樣： 在高濃度含酚廢水流經(jīng)的場(chǎng)所采樣。采取排放含酚廢水下水道的淤泥、沉渣等，也可在處理含酚廢水的活性污泥或生物膜中取樣分離。 單菌株分離： 按常規(guī)稀釋平板法，對(duì)上述樣品進(jìn)行單菌株分離。 解酚能力的測(cè)定： a 將所分得的菌株，在營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（280C，約1216小時(shí)）。 b 培養(yǎng)物中加入少量濃酚液，使培養(yǎng)液酚濃度達(dá)到10mg/L左右，進(jìn)行解酚酶的誘發(fā)。 c 繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2小時(shí)后再次加入濃酚液，使培養(yǎng)液酚濃度提高到

33、50mg/L左右，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4小時(shí)。 d 測(cè)定培養(yǎng)液中殘留酚的濃度，并計(jì)算酚的去除率。 菌膠團(tuán)形成能力的測(cè)試： a將已選得的解酚能力較強(qiáng)的菌株，分別接種在盛有50mL滅菌的尿素培養(yǎng)基內(nèi) b 28，搖床上振蕩培養(yǎng)1216小時(shí)，凡能形成菌膠團(tuán)的菌株，其培養(yǎng)物形成絮狀顆粒，靜置后沉于瓶底，液體澄清。凡解酚能力較強(qiáng)，且又能形成菌膠團(tuán)的菌株即為入選菌株經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后即可提供生產(chǎn)上使用。9.8.3.5 石油降解菌的分離培養(yǎng) 石油降解菌是自然界存在的一大類(lèi)能以石油為唯一碳源的微生物。它們對(duì)環(huán)境中碳?xì)浠衔锏慕到?、轉(zhuǎn)化，起著重要作用。隨著石油的大量開(kāi)采、應(yīng)用以及石油化工生產(chǎn)的發(fā)展，大量石油及其制品因油船觸礁、

34、油井漏油、井噴等事故進(jìn)入環(huán)境；隨石油化工生產(chǎn)排放的廢水而進(jìn)入環(huán)境的碳?xì)浠衔锪恳蚕喈?dāng)可觀。從自然界分離、篩選并應(yīng)用高效的石油降解菌，是提高石油化工廢水處理效果和消除環(huán)境石油污染的有效途徑之一。 分離石油降解菌用的培養(yǎng)基 石油瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基： 葡萄糖 2g 輕柴油或煤油 10mL 酪蛋白水解物 5g 瓊脂 20g 酵母膏 1g 陳海水 1000mL 調(diào)pH至7.0，121滅菌20分鐘，冷卻到450C，加入10mg/L過(guò)濾除菌的制霉菌素，制成平板，供分離石油降解細(xì)菌用。 上述培養(yǎng)基調(diào)pH至5.5，1210C滅菌20分鐘，冷卻到450C，加入50mg/L鏈霉素及50mg/L四環(huán)素（均預(yù)先過(guò)濾除菌），

35、制成平板，供分離石油降解真菌及酵母菌用。 石油鹽培養(yǎng)基： KNO3 2g 輕柴油或煤油 10mL MgSO47H20 1g 陳海水 1000m 121滅菌20分鐘，備用。 石油鹽硅膠平板培養(yǎng)基： a. 配制硅酸鉀溶液：在100mL加熱到近于沸騰的7%KOH溶液中，加入10g硅膠即成。在250mL錐形瓶中倒入50mL硅酸鉀溶液，1210C滅菌20分鐘，備用。 b. 在250mL錐形瓶中加入50mL石油鹽培養(yǎng)基，按0.003%濃度加入酚紅指示劑，1210C滅菌20分鐘。 c. 當(dāng)石油鹽培養(yǎng)液冷卻至室溫時(shí)，加入0.5mL1%KH2PO4溶液及1mL20%磷酸溶液。 d. 將50mL硅酸鉀溶液（pH6

36、7，指示劑紅-橙色）倒入上述50mL石油鹽培養(yǎng)液中，迅速混合均勻，倒入5個(gè)培養(yǎng)皿，每皿約20mL，1分鐘后即可凝固成平板。 e. 該平板應(yīng)使表面干燥后才能使用。 石油降解菌分離操作步驟 選取石油污染近海水域，使用采水器采集水樣，用采泥器采集泥樣。 吸取1mL水樣或1g泥樣，分別加到盛有9mL無(wú)菌海水的試管中，混勻后制成10-2、10-3、10-4稀釋液。 分別吸取0.1mL原始水樣及各稀釋度的水樣，接入加有制霉菌素的石油瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板和添加有鏈霉素、四環(huán)素的石油瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上。前者分離石油降解細(xì)菌，后者分離石油降解真菌和酵母菌。 用無(wú)菌玻璃推棒將水樣均勻涂布在培養(yǎng)基表面。 倒置培養(yǎng)皿

37、，在200C條件下培養(yǎng)。 培養(yǎng)7天后，計(jì)數(shù)降解石油細(xì)菌菌數(shù)。14天后計(jì)數(shù)降解石油真菌和酵母菌菌數(shù)。同時(shí)，挑取單菌落進(jìn)行各石油降解菌的純化培養(yǎng)。 將分純的個(gè)菌株，分別接種到石油鹽培養(yǎng)液中，在200C培養(yǎng)10天后，觀察培養(yǎng)液渾濁程度和液面上菌膜的厚薄，以判斷各菌株利用石油進(jìn)行生長(zhǎng)的狀況。 由于海洋中分布有瓊脂分解菌，在分離降解石油微生物時(shí)，可能有瓊脂分解菌在上述培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。為了避免可能出現(xiàn)的干擾，可在分離中采用石油鹽硅膠平板。操作步驟不變。9.8.3.6 光合細(xì)菌的分離培養(yǎng) 光合細(xì)菌（Photosynthetic Bacteria，略作PSB）是一大類(lèi)能進(jìn)行光合作用的原核生物的總稱(chēng)。除藍(lán)細(xì)菌外，

38、都能在厭氧光照條件下進(jìn)行不產(chǎn)氧的光合作用。研究與應(yīng)用的實(shí)踐表明，光合細(xì)菌在高濃度有機(jī)廢水處理與資源化、水產(chǎn)養(yǎng)殖的水質(zhì)調(diào)控與促進(jìn)健康生長(zhǎng)、在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中作為高效活性菌肥等方面，發(fā)揮著十分有益的和令人矚目的作用。關(guān)于光合細(xì)菌的類(lèi)群、形態(tài)與生理特征、在生態(tài)系統(tǒng)中的地位和作用等內(nèi)容，請(qǐng)參考有關(guān)文獻(xiàn)與專(zhuān)著。這里僅就光合細(xì)菌的分離、培養(yǎng)方法作一介紹。 光合細(xì)菌的富集培養(yǎng)的一般方法 分離源 光合細(xì)菌四個(gè)科紅螺菌科（Rhodospirillaceae）、著色菌科（Chromatiaceae）、綠菌科（Chlorobiaceae）、綠色絲狀菌科（Chloroflexaceae）的各種菌，廣泛分布于地球生物圈的各處

39、。作為光合細(xì)菌的分離源 ，一般可從富營(yíng)養(yǎng)化的湖泊、池沼、海灘、以及水田、硫黃泉、灌水土壤、和污水廠活性污泥、畜牧場(chǎng)水溝等厭氧或缺氧環(huán)境采樣。在較深的水體，可使用采水器采取厭氧層的水。在較淺的地方，可直接用吸管吸取帶底泥的水。采樣的同時(shí)記錄水溫、pH、有無(wú)H2S氣味等項(xiàng)內(nèi)容。將采集到的水樣或泥樣放在厭氧、低溫條件下，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離。 光合細(xì)菌富集培養(yǎng)基 用于光合細(xì)菌富集培養(yǎng)用的培養(yǎng)基有許多配方，這里僅介紹日本星野氏推薦的基本培養(yǎng)基I和基本培養(yǎng)基II。前者適合于紅螺菌科的光合細(xì)菌，后者適用于著色菌科和綠菌科的菌。 基本培養(yǎng)基I：KH2PO40.5g，K2HPO40.6g，(NH4)2SO41.

40、0g，MgSO47H2O0.2g，NaCl0.2g，CaCl22H2O0.05g，酵母浸出汁0.1g， 微量元素溶液（見(jiàn)后）1mL，生長(zhǎng)因子溶液（見(jiàn)后）1mL，蒸餾水1000ml。 以上配制成的培養(yǎng)基pH值約6.7。 根據(jù)需要，可在上述培養(yǎng)基中添加一些成分，如富集的是缺少同化型硫酸還原系的菌種，則可在基本培養(yǎng)基I中加入0.01%硫代硫酸鈉；如是海洋性菌種，可加入3%NaCl等等。另外，如分離源中含有較多的硫酸還原菌時(shí)（尤其是采自海洋的樣品），為了抑制硫酸還原菌的生長(zhǎng)，可把基本培養(yǎng)基I中的(NH4)2SO4、MgSO47H2O替換成NH4Cl和MgCl26H20。 含單一有機(jī)化合物的基本培養(yǎng)基I

41、配置方法如下： 在容積為20mL的螺口試管中，加入最終濃度為一定量（0.050.1%）的有機(jī)物。 加入基本培養(yǎng)基I至1/2試管的量，松松地旋上螺蓋。 1210C，滅菌15分鐘。 冷卻后加入過(guò)濾除菌的10%抗壞血酸鈉溶液0.1mL（最終濃度為0.05%），作為還原劑。 用另行滅菌的基本培養(yǎng)基I注滿試管，旋緊螺蓋。 用同樣方法可配制含各種不同的單一有機(jī)化合物的基本培養(yǎng)基I。 基本培養(yǎng)基II：KH2PO4 1.0g，NH4Cl 1.0g，MgCl26H2O 0.2g，CaCl22H2O 0.05g，微量元素溶液（見(jiàn)后）1mL，生長(zhǎng)因子溶液（見(jiàn)后）1mL，蒸餾水 1000mL，根據(jù)需要，可在該培養(yǎng)基中

42、加入0.1%硫代硫酸鈉、3% NaCl或0.05%乙酸鈉等。 含一定濃度的H2S和CO2，并有特定pH的基本培養(yǎng)基II的配制，可參照表55進(jìn)行。 例如，要配制No.1的基本培養(yǎng)基II，其中含0.1%Na2S9H2O和0.2%NaHCO3，pH=6.4，具體方法如下：在螺口試管（容積為20mL）中加入半管量的基本培養(yǎng)基II，松松地旋上螺蓋。1210C，滅菌15分鐘。冷卻后依次加入0.3mL1NHCl、0.5mL8%的NaHCO3溶液（過(guò)濾除菌）和1.0mL2%的Na2S9H2O溶液（高壓滅菌）。用另行滅菌的基本培養(yǎng)基II注滿試管，旋緊螺蓋。用同樣方法可配制含所需H2S濃度和pH值的各種基本培養(yǎng)基

43、II。將制得的裝有培養(yǎng)基的試管充分振蕩后，在冷暗處放置1晝夜，使培養(yǎng)基內(nèi)完全呈厭氧狀態(tài)。在這種狀態(tài)下可保存1個(gè)月左右。表55 各種基本培養(yǎng)基II的配制方法培養(yǎng)基編號(hào)培養(yǎng)基中的濃度（%）*最終培養(yǎng)基20mL中應(yīng)加入的mL數(shù)培養(yǎng)基的pHNaHCO3Na2S9H201NHCl1NaOH10.20.10.36.420.20.10.26.730.20.10.156.940.20.10.17.150.20.10.057.360.20.17.670.20.10.057.980.20.050.156.690.20.050.16.9100.20.050.057.0110.20.057.2120.20.050.0

44、57.5130.20.050.157.8140.20.0250.056.9150.20.0257.1160.20.0250.057.3170.20.0250.17.5180.20.0250.157.9 * 最終培養(yǎng)基量20mL中，加入8%NaHCO3溶液0.5mL時(shí)，其最終濃度為0.2%；若分別加入2%Na2S9H2O溶液1.0、0.5、0.25mL，它們的最終濃度分別為0.1%、0.05%、0.025%。 微量元素溶液：EDTA-2Na 2000mg， FeSO47H2O 2000mg， H3BO3 100mg，CoCl26H2O 100mg，ZnCl2 100mg， MnCl24H2O 1

45、00mg，Na2MoO42H2O 20mg，NiCl26H2O 20mg，CuCl22H2O 10mg， Na2SeO3 1mg， 蒸餾水 1000mL，保存于暗處。 生長(zhǎng)因子溶液：維生素B1 50mg， 煙酸（維生素PP） 50mg， 對(duì)氨基苯甲酸 30mg，維生素B12 5mg， 吡多酸（維生素B6） 10mg， 生物素 5mg，蒸餾水 100mL， 保存于冷暗處。 接種 適當(dāng)?shù)慕臃N量對(duì)于有效地富集到目標(biāo)菌種十分重要。因?yàn)檫^(guò)多的接種量會(huì)使培養(yǎng)基條件發(fā)生變化，導(dǎo)致富集培養(yǎng)失敗。合適的接種量為：20mL富集培養(yǎng)基中加入分離用樣品12滴。 培養(yǎng) 接種后的富集培養(yǎng)管，一般先在室內(nèi)暗處放置數(shù)小時(shí)至1

46、晝夜，然后移至光照下開(kāi)始光合成培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間因條件而異，大約需要1星期至1個(gè)月。如果一次富集培養(yǎng)光合細(xì)菌尚未充分生長(zhǎng)，則應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行富集培養(yǎng)。即把上一次的富集培養(yǎng)物移接少量至無(wú)菌的富集培養(yǎng)液中，重復(fù)上述的培養(yǎng)過(guò)程，直至獲得有光合細(xì)菌大量生長(zhǎng)的富集培養(yǎng)物。 光源 進(jìn)行光合成培養(yǎng)時(shí)使用的光源，以白熾燈為好。因?yàn)榕c熒光燈相比，白熾燈不僅發(fā)出光合細(xì)菌的類(lèi)胡蘿卜素吸收的短波光（450550nm），而且大量發(fā)出細(xì)菌葉綠素（Bchl）吸收的長(zhǎng)波光（7151050nm）。 由于不同的光合細(xì)菌菌種所含有的細(xì)菌葉綠素種類(lèi)不同（見(jiàn)表56），因此也可利用特定波長(zhǎng)的光源來(lái)進(jìn)行相應(yīng)菌種的富集培養(yǎng)（van Niel，1971

47、）。 光合成培養(yǎng)的合適光照強(qiáng)度為5002000Lux，把培養(yǎng)管放在距白熾燈（4060W）1550cm處即可。另外，由于白熾燈會(huì)發(fā)出大量的熱，故因注意培養(yǎng)裝置內(nèi)溫度的控制。表56 各種Bchl及其主要吸收光波Bchl最大吸收波長(zhǎng)（nm）Bchl a830890Bchl b10151035Bchl c745760Bchl d725745Bchl e715725 防止藻類(lèi)生長(zhǎng) 富集培養(yǎng)中若有藻類(lèi)生長(zhǎng)，會(huì)因其光合產(chǎn)氧而使培養(yǎng)基內(nèi)呈好氧狀態(tài)，從而引起光合細(xì)菌的生長(zhǎng)受抑制。為了阻止藻類(lèi)的生長(zhǎng)，Swoager和Lindstrom（1971）提出可在培養(yǎng)基中加入光化學(xué)反應(yīng)系II的抑制劑。另外，也可利用濾波器得

48、到波長(zhǎng)700nm以上的光作為光源，在這樣的光照條件下，光合細(xì)菌因含有Bchl（吸收波長(zhǎng)為700nm以上）而能夠生長(zhǎng)，藻類(lèi)則因所含Chl的吸收波長(zhǎng)為700nm以下而不能生長(zhǎng)。（2）各科光合細(xì)菌的富集培養(yǎng) .紅螺菌科（Rhodospirillaceae）光合細(xì)菌的富集培養(yǎng)該科光合細(xì)菌包括4屬17種1亞種。這些菌種都能利用有機(jī)物作為碳源和光合成反應(yīng)的氫供體進(jìn)行生長(zhǎng)。因此，紅螺菌科的菌可用含單一有機(jī)物的基本培養(yǎng)基I，并在20300C，10002000Lux 條件下進(jìn)行富集培養(yǎng)。培養(yǎng)物因菌種不同而呈現(xiàn)紅、紫、茶色等色澤。為富集紅螺菌科中的特定菌種，一般的方法是依據(jù)該菌種對(duì)某種有機(jī)物的特異利用性，配制成以

49、該有機(jī)物為單一碳源的培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)。此外，可利用不同菌種對(duì)培養(yǎng)基pH、生長(zhǎng)因子以及光源波長(zhǎng)范圍的不同要求，來(lái)對(duì)特定菌種進(jìn)行富集培養(yǎng)。實(shí)際應(yīng)用時(shí)，常根據(jù)需要把上述培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件組合起來(lái)，將能更有效地富集到所需的特定菌種。 以下就幾種紅螺菌科細(xì)菌的富集培養(yǎng)法作一簡(jiǎn)要介紹。 aRhodobacter sphaeroides（球形紅菌）（原為Rhodopseudemonas sphaeroides，球形紅假單胞菌）的富集培養(yǎng)： 首先，在含有0.1%乙醇或醋酸鈉的培養(yǎng)基中進(jìn)行第一次富集培養(yǎng)。然后，將一部分富集培養(yǎng)物接種到含0.1%酒石酸鈉的培養(yǎng)基中，進(jìn)行第二次富集培養(yǎng)。用此法可選擇性地富集到球形紅

50、菌（R. Sphaeroides）（van Niel，1971）。但是，在R. Sphaeroides中也有些菌株不能利用酒石酸鈉為碳源。據(jù)星野氏的研究，對(duì)這些菌株的富集培養(yǎng)可在含3%NaCl的蘋(píng)果酸鈉培養(yǎng)基中進(jìn)行。 bRhodopseudomonas acidophila（嗜酸紅假單胞菌）的富集培養(yǎng)： 根據(jù)Pfennig（1969）的研究，可采用不含生長(zhǎng)因子的琥珀酸鈉培養(yǎng)基（pH=5.1）進(jìn)行嗜酸紅假單胞菌的富集培養(yǎng)。 cRhodopseudomonas viridis（綠色紅假單胞菌）的富集培養(yǎng)： 采用乙醇或醋酸鈉培養(yǎng)基，并利用該菌含Bchl b而以紅外濾色器獲得1000-1050nm波長(zhǎng)

51、的光進(jìn)行照射，可有效地富集到綠色紅假單胞菌。其培養(yǎng)物呈綠色。（Drews and Giesbrecht，1966） dRhodospirillum fulvum（黃褐紅螺菌）的富集培養(yǎng)： 采用只含對(duì)-氨基苯甲酸為生長(zhǎng)因子的0.05%苯甲酸鈉培養(yǎng)基，可有效地富集黃褐紅螺菌。（Pfennig，Eimhjellen and Liaaen，1965） 著色菌科（Chromatiaceae）光合細(xì)菌的富集培養(yǎng)法 該科光合細(xì)菌包括10屬27種。該科菌種在以CO2為碳源、H2S為光合反應(yīng)氫供體的堿性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。因此，可采用基本培養(yǎng)基II No.5或No.11，并在15300C，5002000Lux條件

52、下，對(duì)該科光合細(xì)菌進(jìn)行富集培養(yǎng)，其培養(yǎng)物呈紅、紫等顏色。 盡管著色菌科的各菌種，都能在上述同樣的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)，但還是能夠通過(guò)適當(dāng)改變培養(yǎng)條件，如改變培養(yǎng)基的pH、H2S濃度、維生素B12的有無(wú)、光強(qiáng)度或培養(yǎng)溫度的改變等，來(lái)富集一些特定的菌種。研究表明，高濃度H2S（0.10.2%Na2S9H2O）和強(qiáng)光照（10002000Lux）條件，可用于Chromatium（著色菌屬）、Thiospirillum（硫螺旋菌屬）、Thiocapsa（莢硫菌屬）和Thiocystis（囊硫菌屬）等的富集培養(yǎng)。而低濃度H2S（0.05%Na2S9H2O）、弱光照強(qiáng)度（200500Lux）以及低溫（10200C）條件，可用于Lamprocystis（閃囊菌屬）、Amoebobacter（可變桿菌屬）和Thiodictyon（網(wǎng)硫菌屬）等具有氣胞的菌種的富集培養(yǎng)（Pfennig，1967）。 在上述培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下進(jìn)行著色菌科光合細(xì)菌的富集培養(yǎng)時(shí)，往往在培養(yǎng)基中會(huì)出現(xiàn)綠菌科（Chlorob