雞源鸚鵡熱衣原體MOMP基因重組腺病毒的穩(wěn)定性及SPF雛雞免疫試驗

1、雞源鸚鵡熱衣原體MOMP基因重組腺病毒的穩(wěn)定性及SPF雛雞免疫試驗         07-08-08 10:08:00     作者：周繼章，邱昌慶，張小    編輯：studa20【關(guān)鍵詞】  衣原體,鸚鵡MOMP；重組,遺傳；腺病毒科；中和試驗；雛雞免疫Stability test and SPF chick immune test of recombinant adenovirus containing major ou

2、ter membrane protein  of Chlamydia psittaci of chicken origin【Abstract】 AIM: To detect the stability of the recombinant adenovirus plasmid containing major outer membrane protein (MOMP) gene from Chlamydia psittaci in HEK293 cells, to evaluate whether cross reactivity exists  or not betwee

3、n recombinant adenovirus and positive serum of Egg Drop Symdrome (EDS), and to evaluate whether SPF chicks vaccinated with the recombinant adenovirus  were protected or not when challenged with virulent CpL strain. METHODS: The recombinant adenovirus plasmids were passaged in HEK293 cells in se

4、ries and the target gene was detected by PCR. The recombinant adenovirus was mixed with positive serum of EDS in vitro and then infected HEK293 cells.  The SPF chicks were vaccinated with recombinant adenovirus and then challenged with the CpL strain. RESULTS: The target gene of recombinant ade

5、novirus plasmid could be amplified by PCR in different passages of HEK293 cells. There was no cross reactivity between recombinant adenovirus and positive serum of EDS. 90% of the SPF chicks vaccinated with recombinant adenovirus were protected when challenged with the CpL strain. CONCLUSION: The re

6、combinant adenovirus plasmid can be passaged stably in HEK293 cells. The recombinant adenovirus can not react with positive serum of EDS. The SPF chicks inoculated with the recombinant adenovirus vaccination are protected.【Keywords】 Chlamydophilophila psittaci MOMP; recombination, genetic;  ade

7、noviridae; neutralization tests;  chicks immunity【摘要】 目的： 檢測重組腺病毒質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中的穩(wěn)定性；重組腺病毒是否與減蛋綜合征陽性血清發(fā)生中和反應(yīng)，以及用重組腺病毒免疫SPF小雞是否產(chǎn)生保護(hù). 方法： 將重組腺病毒質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中連續(xù)傳代，并用PCR法檢測目的基因；用減蛋綜合征陽性血清在體外中和重組腺病毒，接種HEK293細(xì)胞；用重組腺病毒免疫SPF小雞，然后用CpL菌株攻擊. 結(jié)果： 重組腺病毒質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中連續(xù)傳代后，仍然用PCR檢測能檢測出目的基因；重組腺病毒與減蛋綜合征陽性血清之間無交叉反應(yīng)；用

8、重組腺病毒免疫SPF雞，用CpL菌株攻擊，90%的小雞獲得了保護(hù). 結(jié)論： 重組腺病毒質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中能穩(wěn)定傳代；重組腺病毒不受減蛋綜合征陽性血清的影響；用重組腺病毒免疫SPF小雞，能夠獲得保護(hù). 【關(guān)鍵詞】 衣原體，鸚鵡MOMP；重組，遺傳；腺病毒科；中和試驗；雛雞免疫0引言禽衣原體病是由嗜性鸚鵡熱衣原體感染禽類而引起的一種疾病. 目前該病被稱為“鸚鵡病”或“鸚鵡熱”，該病最早被認(rèn)為與鸚鵡以及與這些鸚鵡接觸的人相關(guān)聯(lián). 鸚鵡熱衣原體由8個血清型組成. 這些血清型是通過使用血清特異性單克隆抗體直接免疫熒光試驗1或通過PCR核苷酸序列分析或限制型片斷長度多態(tài)性分析（RFLP）被

9、鑒定出來2-3. 至少有6個血清型（AF）被認(rèn)為在家禽中流行. 鸚鵡熱衣原體感染大部分寵物鳥、家禽（包括火雞、鴨、鵝、雞以及相關(guān)的家養(yǎng)品種）和野鳥4. 在家禽中，大爆發(fā)也經(jīng)常發(fā)生在火雞場和鴨場，并且導(dǎo)致人的感染5-8.     目前國內(nèi)外尚無商業(yè)化疫苗預(yù)防禽衣原體病，而化藥防治本病存在成本高、食品安全隱患等系列問題. 因此，為了控制本病，保護(hù)人類健康，促進(jìn)養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，研究和開發(fā)高效、低廉的疫苗勢在必行. 本研究將構(gòu)建的重組腺病毒質(zhì)粒免疫SPF小雞，獲得良好的結(jié)果，為進(jìn)一步的免疫試驗奠定了基礎(chǔ).1材料和方法1.1材料人胚胎腎細(xì)胞（HEK293）由蘭州獸醫(yī)

10、研究所病毒室劉在新研究員提供；DMEM, RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；重組腺病毒質(zhì)粒由本室構(gòu)建并鑒定9；胎牛血清購自杭州四季青生物科技有限公司；植物血凝素（PHA）購自北京博大泰克生物科技有限公司；7日齡SPF小雞購自甘肅省中醫(yī)學(xué)院. 1.2方法1.2.1重組腺病毒與減蛋綜合征陽性血清的中和試驗雞減蛋綜合癥病毒（EDSV）為腺病毒，因此有必要用減蛋綜合征陽性血清檢測是否對重組腺病毒有抑止作用. 聚體操作步驟如下：取反復(fù)凍融的重組腺病毒HEK293 細(xì)胞液1 mL，進(jìn)行10-1, 10-210-11系列稀釋. 將購買的減蛋綜合征陽性血清置56水浴中，滅活30 

11、min. 取稀釋的重組腺病毒HEK293細(xì)胞液100 L，加入滅活的減蛋綜合征陽性血清100 L, 37作用1 h. 將中和液加入到已長滿的HEK293細(xì)胞單層，37, 50 mL/L的CO2條件下培養(yǎng)，觀察結(jié)果. 同時作對照. 1.2.2重組腺病毒穩(wěn)定性試驗將重組腺病毒連續(xù)傳代20代以上，觀察并記錄細(xì)胞病變時間. 取第5代、第10代、第15代、第20代病變細(xì)胞，反復(fù)凍融3次. 取1 mL的凍融液，加入50 L 100 g/L SDS和3 L（20 g/L）, 60作用30 min，然后置37作用2 h. 提取腺病毒基因組DNA，進(jìn)行PCR檢測. 1.2.3重組腺病毒電鏡觀

12、察取于36 h內(nèi)病變的細(xì)胞，反復(fù)凍融3次，取2 mL 3000 r/min離心30 min，除去細(xì)胞碎片. 將磷鎢酸配置成20 g/L的溶液，以1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)整pH為6.8，濾過后蓋緊瓶蓋，4保存. 將染液與病毒液等量混合后，在無菌柜或防塵罩內(nèi)用噴霧器將樣品噴到帶膜的載網(wǎng)上，待干燥后進(jìn)行電鏡觀察. 1.2.4重組腺病毒制備免疫用重組腺病毒AdMOMP為第21代毒，其毒價為3.4×1013 TCID50/L. 收集于30 h內(nèi)病變的HEK293細(xì)胞，用PBS重懸，反復(fù)凍融3次，6000 r/min離心30 min，收取上清，直接用于小雞免疫. 空白對照HEK293

13、細(xì)胞懸液、野生型腺病毒Ad5的制備方法同上. 1.2.5CpL雞胚適應(yīng)毒CpL菌株在7 d齡雞胚測定其毒力，毒力為2.8×1011. 1.2.6試驗動物及分組試驗動物為7日齡SPF雛雞，共60只，分重組腺病毒組、野生型腺病毒組、HEK293細(xì)胞組，經(jīng)翅根肌肉和皮下兩個途徑進(jìn)行接種，每組10只，接種量分別為： 7.7×109 TCID50,  4×108 TCID50和0.4 mL.1.2.7血清抗體效價測定于接種前1日和免疫后15 d，分別于試驗雞翅根部靜脈采血，用衣原體間接血凝（IHA）試驗檢測血清衣原體抗體. 操作步驟如下： 取經(jīng)

14、處理過的干凈的96孔V型板，每孔加入25 L的稀釋液. 取25 L自然析出的血清，加入到第一孔中，混勻，吸取25 L，加入到下一孔，如此對倍稀釋，直至第7孔，混勻后吸棄25 L. 同時作對照. 每孔加入抗原致敏紅細(xì)胞25 L，在振蕩器上輕輕振蕩1 min. 置室溫下23 h，觀察并記錄結(jié)果. 1.2.8攻毒保護(hù)試驗免疫后21 d，經(jīng)翅根肌肉免疫的小雞用分離株CpL進(jìn)行攻擊，攻毒量為0.2 mL（5.6×1010 ELD50），攻毒途徑為鼻內(nèi)接種. 攻毒后逐日觀察，記錄發(fā)病情況.2結(jié)果2.1重組腺病毒減蛋綜合征陽性血清中和試驗將重組腺病毒HEK293細(xì)胞反復(fù)凍融，系列稀釋后與減蛋綜合征陽性血清作用，接入已長滿HEK293細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37, 50 mL/L的CO2條件下培養(yǎng)培養(yǎng)26 d，對照組只接入系列稀釋的減蛋綜合征陽性血清(表1).表1重組腺病毒減蛋綜合征陽性血清中和試驗（略）注A, B, C, D, E, F為試驗組, G, H為對照組.  “+”表示有細(xì)胞病變，“-”表示無細(xì)胞病變.從