免疫親和_光化學(xué)柱后衍生高效液相色譜熒光法測定花生粕中黃曲霉

1、中國飼料2007年第24期檢測分析黃曲霉毒素由黃曲霉菌和寄生曲霉菌產(chǎn)生,主要包括B1、B2、G1和G24種毒素,其中B1是毒性和危害最大的一種,B2和G2分別是B1和G1的雙羥基衍生物。黃曲霉毒素是一級致癌物質(zhì),其毒性比氰化鉀要強10倍,能使植物和動物細(xì)胞染色體發(fā)生畸變,使胎兒發(fā)生畸形。花生粕的營養(yǎng)價值較高,適口性好,是豬、雞等單胃動物及反芻動物的良好飼料。但是其易感染黃曲霉菌而產(chǎn)生黃曲霉毒素,所以要加強花生粕原料和以花生粕為原料的混合飼料中黃曲霉毒素的檢測和控制。目前國際上黃曲霉毒素測定普遍采用熒光光度計法,但該法只能測定總黃曲霉毒素(GB/T 18979-2003。黃曲霉毒素主要的衍生方法

2、有柱前三氟乙酸衍生,柱后碘衍生、電化學(xué)在線柱后衍生,溴化吡啶溴衍生法(Stroka等,2003;宋歡, 2001。衍生后通過高效液相色譜-熒光法測定黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2。Waltking和Wilson (2006采用柱后光化學(xué)衍生法測定了堅果中的黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2。本研究采用了免疫親和柱凈化,柱后光化學(xué)衍生,高效液相色譜法結(jié)合熒光檢測器測定花生粕中黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2。1材料與方法1.1儀器與試劑L2130型高效液相色譜儀;熒光檢測器;AURA INDUSTRIES光化學(xué)衍生器;高速均質(zhì)器;免疫親和柱分離6位泵流操作架; Afla-P黃曲霉毒素免疫親和柱;

3、1.5m玻璃纖維濾紙。黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(美國SUPLCO公司;甲醇(色譜純。黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制:將黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL全部轉(zhuǎn)移到10mL棕色容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度。0.1%吐溫-20/PBS清洗液的配制:稱取8.0g NaCl,1.2g Na2HPO4,0.2g KH2PO4,0.2g KCl,用免疫親和-光化學(xué)柱后衍生高效液相色譜熒光法測定花生粕中黃曲霉毒素的研究中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所陳新北京中檢維康技術(shù)有限公司王雄雷達(dá)摘要研究建立了光化學(xué)柱后衍生-高效液相色譜(HPLC-熒光檢測器測定花生粕中黃曲霉毒

4、素B1、B2、G1和G2的方法。甲醇/水提取樣品中黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2,Afla-P黃曲霉毒素免疫親和柱凈化,經(jīng)高效液相色譜分離后,由光化學(xué)柱后衍生,通過熒光檢測器測定。結(jié)果表明:在優(yōu)化條件下,黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2的檢出限分別為1.0、0.3、1.0g/kg和0.3g/kg,回收率為67.0%117%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(R SD低于18.2%。該方法簡便快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好,滿足飼料用花生粕中黃曲霉毒素檢測的需要。關(guān)鍵詞免疫親和柱;光化學(xué)衍生;高效液相色譜;黃曲霉毒素;花生粕中圖分類號S816.17文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號1004-3314(200724-0030-03 A

5、bstractA method for determination of Aflatoxin B1,B2,G1and G2by using photochemical derivatization-HPLC-fluorescence detector was developed.The Aflatoxin B1,B2,G1and G2in samples were extracted by methanol/water and were cleaned up by immuno affinity columns.The separation of Aflatoxin B1,B2,G1and G

6、2was conducted by HPLC,the determination was carried out by fluorescence detector after photochemical derivatization.Under optimum conditions,the limits of determination of Aflatoxin B1,B2,G1and G2were1.0,0.3,1.0g/kg and0.3g/kg respectively,the recoveries of analytes were from67.0%to117%and the rela

7、tive standard deviations were below18.2%.The method is simple,high sensitive and good repeatability,which is suitable for the determination of Aflatoxin in peanut residues.Key wordsimmunoaffinity column;photochemical derivatization;HPLC;Aflatoxin;peanut residues30中國飼料2007年第24期(下轉(zhuǎn)第34頁黃曲霉毒素線性方程相關(guān)系數(shù)線性范

8、圍(ng/mL 檢出限(ng/mL B 1y=151354x-1137270.99390501.0B 2y=282044x-761520.99340150.3G 1y=67639x-597540.99410501.0G 2y=136211x-413860.99210150.3990mL 純水將上述試劑溶解,加入1mL 的吐溫-20,然后用濃HCl 調(diào)pH 至7.0,最后用純水稀釋至1000mL 。1.2色譜條件高效液相色譜用分析柱是Cloversil ODS-C 18柱,粒徑5m ,內(nèi)徑4.6mm ,柱長150mm 。甲醇水(5050,V V 為流動相;流動相流速為1mL/min ;進(jìn)樣量為2

9、0L ;柱溫為25;檢測器為熒光檢測器,檢測激發(fā)波長為360nm ,發(fā)射波長為440nm 。1.3實驗方法1.3.1樣品制備。花生粕樣品為均勻顆粒狀,粒徑為23mm 。在進(jìn)行黃曲霉毒素添加回收率實驗,需將25g 空白樣品中添加適量的黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,放置4h 以上或過夜。1.3.2提取。稱取25g 樣品于高速均質(zhì)器中,加5g 的氯化鈉,加入100mL 甲醇+水(8020,V V ,以均質(zhì)器高速提取12min ,用中速濾紙過濾,收集濾液10mL ,用40mL 純水稀釋。1.3.3凈化。將上述稀釋后的濾液以玻璃纖維濾紙過濾,移取濾液20mL (相當(dāng)于1.0g 樣品過Afla-P 黃曲霉毒素免

10、疫親和柱,調(diào)節(jié)流速12滴/s ,直至空氣完全通過免疫親和柱。用10mL0.1%吐溫-20/PBS 清洗液以23滴/s 清洗免疫親和柱。然后用10mL 的純水以23滴/s 清洗免疫親和柱兩次,直至空氣完全通過免疫親和柱。加入1mL 甲醇,調(diào)節(jié)流速12滴/s 的流速將免疫親和柱中的黃曲霉毒素淋洗下來。1.3.4測定。從上述淋洗下來的1mL 洗脫液中準(zhǔn)確移取200L ,加200L 純水混勻,然后取20L 注入高效液相色譜儀中,用峰面積計算,外標(biāo)法定量。2結(jié)果與分析2.1光化學(xué)衍生本實驗采用的光化學(xué)衍生池利用紫外光照射,使流動相光解出具有熒光特性的基團(tuán),與黃曲霉毒素B 1、G 1分子上的活性雙鍵發(fā)生羥

11、基化反應(yīng),生成熒光特性更強、更穩(wěn)定的物質(zhì),解決了黃曲霉毒素B 1、G 1在水溶液中有熒光淬滅的現(xiàn)象。由圖1和圖2可知,在未進(jìn)行光化學(xué)衍生化時,因流動相中水對黃曲霉毒素B 1和G 1具有強烈的熒光淬滅作用,熒光強度大幅度減小,信號響應(yīng)低。通過光化學(xué)衍生后時,黃曲霉毒素B 1和G 1熒光強度增強。2.2方法性能按1.2的色譜條件進(jìn)行測定,以各黃曲霉毒素峰面積(y 為縱坐標(biāo),黃曲霉毒素濃度(x ,ng/mL 為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,結(jié)果見表1。由表1可知,在050ng/mL ,黃曲霉毒素B 1和G 1具有良好的線性關(guān)系。在015ng/mL 范圍內(nèi),黃曲霉毒素B 2和G 2具有良好的線性關(guān)系。2.3回收

12、率和精密度測定用不含黃曲霉毒素B 1、B 2、G 1和G 2的花生粕作為空白樣品進(jìn)行添加回收和精密度實驗,樣品中添加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)、攪拌均勻后靜置4h 以上,以保證黃曲霉毒素被樣品充分的吸收,然后按照本方法進(jìn)行處理,結(jié)果見表2。從表2可知,該方法準(zhǔn)確度好,黃曲霉毒素B 1、B 2、G 1和G 2回收率為67%117%;精密度高,其RSD 低于18%。2.4樣品測定將該方法用于隨機抽樣獲得的25個花生粕樣品測定,均有檢出。大部分黃曲霉毒素總量分布在250ng/g 之間。只有1個樣品黃曲霉毒素總量為147ng/g ,其中黃曲霉毒素B 1圖2衍生后的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖圖1未衍生的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶

13、液色譜圖50.035.020.05.0-10.00.03.36.710.013.316.720.06.44G 29.18B 210.95B 150.035.020.05.0-10.00.03.36.710.013.316.720.06.41G 29.15B 210.90B 17.44G 1表1方法的性能響應(yīng)強度時間(min 響應(yīng)強度時間(min 31中國飼料2007年第24期(上接第31頁為121ng/g,黃曲霉毒素B2為20ng/g,黃曲霉毒素G1為4ng/g,黃曲霉毒素G2為2ng/g。說明花生粕中黃曲霉毒素污染比較嚴(yán)重,必須對這類原料與產(chǎn)品中黃曲霉毒素進(jìn)行嚴(yán)格的檢測與控制。3結(jié)論采用免疫

14、親和柱凈化,光化學(xué)在線衍生,高效液相色譜熒光法檢測花生粕中黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2。該方法簡便快速,準(zhǔn)確可靠,靈敏度高,重現(xiàn)性好,能夠滿足飼料用花生粕中黃曲霉毒素檢測的需要。(基金項目:國家科技支撐計劃項目,項目編號:2006BAD12B03參考文獻(xiàn)1宋歡.液相色譜法測定飼料中的黃曲霉毒素B1J.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2001,3:257258.2中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB/T18979-2003.食品中黃曲霉毒素的測定-免疫親和層析凈化高效液相色譜法和熒光光度法S.北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2003-7-01.3Stroka J,Houst C V,Anklam E,et

15、 al.Immunoaffinity Column Cleanup with Liquid Chromatography Using Post-Column Bromination for Determination of Aflatoxin B1in Cattle Feed:Collaborative StudyJ.J of AOAC International,2003,86(6:11791186.4Waltking A E,Wilson D.Liquid Chromatographic Analysis of Aflatoxin Using Post-Column Photochemic

16、al Derivatization:Collaborative StudyJ.J of AOAC International,2006,89(3:678692.通訊地址:北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街12號,郵編:100081表2回收率及精密度試驗結(jié)果(n=7黃曲霉毒素添加量(g/kg測定量(g/kg回收率(%相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(%B11.00.8383.016.2 109.1491.410.7 5046.2392.49.5B20.30.35116.717.8 3.02.6287.312.6 1513.2688.411.6G11.01.14114.012.5 109.0590.513.1 5045.909

17、1.89.2G20.30.2066.718.2 3.02.1872.716.2 1510.0667.112.33討論植酸酶酶活國標(biāo)測定法是在BASF和AOAC 植酸酶酶活測定法的基礎(chǔ)上確立起來的。在國標(biāo)法發(fā)布之前,我國科學(xué)工作者對植酸酶測定方法進(jìn)行了研究和論證,其中底物建議應(yīng)用Sigma試劑公司生產(chǎn)的P3168。而國標(biāo)測定法發(fā)布后對底物的應(yīng)用只是規(guī)定了分子式是C6H6O24P6Na12,而對其他方面沒有作詳細(xì)說明。Sigma試劑公司生產(chǎn)的底物P0109和P3168的化學(xué)式分別為C6H6O24P6Na12xH2O和C6H6O24P6Na12,絕干狀態(tài)下相對分子質(zhì)量都是923.8,是植酸的鈉鹽形式

18、,其水溶液呈堿性。底物P3168和P0109在應(yīng)用pH 5.5的乙酸緩沖液配制后pH值達(dá)到6.46.5,而植酸酶國標(biāo)法中酶活單位定義是在pH為5.5的條件下測定的。所以在植酸酶酶活測定過程中,應(yīng)將底物溶液P3168和P0109的pH校正到5.5。同樣,當(dāng)在pH5.0條件下檢測時也應(yīng)將底物溶液P3168和P0109的pH校正到5.0。有研究報道,將植酸鈉P3168溶液pH由6.48調(diào)至5.5,極顯著影響植酸酶活性,未調(diào)節(jié)pH組植酸酶活性僅相當(dāng)于調(diào)節(jié)pH組的66%。而底物P8810的化學(xué)式為C6H18O24P6xNayH2O,相對分子質(zhì)量是660.3,在應(yīng)用pH5.5和5.0的乙酸緩沖液配制后底物pH值5.485.49和4.984.99,未發(fā)生很大變化。但用P8810測定的植酸酶酶活值大于P3168和P0109測定值,這說明不同分子式的底物對植酸酶酶活測定影響很大,所以在應(yīng)用P8810進(jìn)行植酸酶酶活測定,不能直接替代使用,必須考慮P8810與P3168之間的換算關(guān)系。植酸鈉是影響植酸酶酶活測定結(jié)果的重要因素,在測定過程中,如果更換底物的類型和品種,必須對產(chǎn)品進(jìn)行校正,以便得到正