石蠟包埋切片制作法

1、實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案一、制備顯微標(biāo)本的切片法一石蠟包埋切片制作法這是最常用的切片法。以石蠟作為組織的填充支持介質(zhì)，將整塊組織加以包埋，最后凝固成均勻一致的固態(tài)結(jié)構(gòu)。用切片機(jī)制取極薄的切片。為了讓石蠟?zāi)芙?組織內(nèi)部，需將組織經(jīng)過脫水等處理。過程大致如下：固定：生物標(biāo)本脫離機(jī)體或培養(yǎng)環(huán)境，細(xì)胞會(huì)發(fā)生自溶，腐敗分解。因此，需用固定劑處理，使蛋白質(zhì)凝固停止瀕死或死后變化。凡供永久保存的標(biāo)本都需經(jīng) 固定處理。常用的固定劑是甲醛、乙醇等，能使蛋白質(zhì)凝固。還有由幾種試劑配成的固定液， 例如Carnoy固定液，由無水酒精、氯仿、冰醋酸配成，固定力更快更強(qiáng)，不含 水分，可避免水溶性物質(zhì)如糖原等在固定過程中損失。脫水：

2、是將組織細(xì)胞所含水分除去。通常用乙醇（ AlcohoI ,酒精），濃度遞 升到100%。此過程還使組織塊進(jìn)一步硬化。透明：是用既能溶于純酒精又能融解石蠟的有機(jī)溶劑，將組織中的酒精取代， 以便石蠟浸入。通常用二甲苯（xylene ）為透明劑。浸蠟：在溫箱內(nèi)進(jìn)行。已透明的組織塊放入加熱融解的石蠟中，讓石蠟浸透組 織，作為支持介質(zhì)。包埋：將已浸蠟的組織塊放入熱融的包埋石蠟中，迅速冷凝，組織決便被蠟包 埋。切片：用切片機(jī)。常用的切片機(jī)有輪轉(zhuǎn)式、平推式的。用輪轉(zhuǎn)式的易于切出連 續(xù)切片。切片厚度隨制片目的而調(diào)整。教學(xué)標(biāo)本厚度多是56卩m。貼片烤干：石蠟切片在溫水上展平后，移在玻片上，烤干，即可供染色處理。

3、染色后用樹膠、蓋坡片封固，可永久保存。二冷凍切片法冷凍切片法是借組織在低溫下，凍結(jié)變硬而達(dá)到符合切片要求。冷凍切片法需有 冷凍切片機(jī)，或在普通切片上配制冷設(shè)施。恒冷切片機(jī)是高級(jí)冷凍切片設(shè)備。它 有一個(gè)恒冷箱，標(biāo)本致冷臺(tái)和切片機(jī)都裝在箱內(nèi)。 恒冷箱的作用類似冰箱，可在 一定范圍內(nèi)調(diào)整溫度，其結(jié)構(gòu)有利于保持箱內(nèi)恒定低溫，減少箱門打開時(shí)環(huán)境溫 度的干擾。切片機(jī)的輪轉(zhuǎn)把手裝在箱外，便于操縱切片。冷凍切片法的優(yōu)點(diǎn)是：在處理得當(dāng)時(shí)，它可以最大限度地保持組織的新鮮狀態(tài)。并且，由于不需經(jīng)脫水、透明、浸蠟等過程中有機(jī)溶劑的處理，及濕箱浸蠟熱的 影響，甚至可不經(jīng)固定。所以能很好地保存組織細(xì)胞的各種成分和酶的活性，

4、因此在酶的組織化學(xué)研究中常用此切片法。二、顯示標(biāo)本結(jié)構(gòu)成分的染色法一蘇木素伊紅染色法（HE染色法）為最常用的染色法。該法應(yīng)用于各種組織的染色，是組織學(xué)技術(shù)的基本方法，對(duì) 任何液體固定的組織和各種包埋的切片均可使用， 只是對(duì)不同包埋的切片法處理 略有不同。下面簡介石蠟包埋切片的 HE染色法。1、脫蠟：石蠟切片的組織內(nèi)部充滿石蠟，不能使水溶性染液著色，因此在染色前必須首先用二甲苯將石蠟脫掉，共兩次。2、下行入水：將已脫蠟的標(biāo)本浸入無水酒精及各級(jí)酒精，使組織逐步接近水。3、蒸餾水略洗。4、蘇木素溶液染色約5 15分鐘5、自來水洗去多余染料。6、入稀釋的鹽酸酒精溶液中分色，邊分色邊鏡檢，至核呈紅紫色，

5、細(xì)胞質(zhì)無 色為合適。7、分色后用自來水或加數(shù)滴氨水堿化，直至細(xì)胞核變成藍(lán)色。這一步驟也可稱 為“藍(lán)化”。8、入蒸餾水洗去堿性水分。9、入70%酒精一 8%酒精各5分鐘。10、入伊紅染液染色30秒至數(shù)分鐘。11、以95%酒精對(duì)伊紅分色，至胞漿，結(jié)締組織等呈桃紅色。12、上行脫水：染色后的切片，因組織內(nèi)含水而不透明，不能清晰地觀察其微細(xì)結(jié)構(gòu)。因此，須將組織內(nèi)的水分經(jīng)各級(jí)酒精一無水酒精逐步置換，最后進(jìn)入不含水份的透明劑內(nèi)。13、透明：入二甲苯透明劑，二次（各數(shù)分鐘）。14、取出切片：將組織周圍多余的二甲苯擦去，滴樹膠后加蓋玻片封固。結(jié)果：細(xì)胞核藍(lán)紫色，胞漿、膠原纖維、肌纖維為桃紅色，嗜酸性顆粒為鮮紅

6、色， 彈性纖維呈明亮桃紅色。二組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)染色法組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)，是將物理和化學(xué)的技術(shù)運(yùn)用到組織標(biāo)本，用顯微鏡和化學(xué) 分析方法來研究組織和細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)成分， 并觀察該化學(xué)成分在組織、細(xì)胞內(nèi)的 定位、含量及其變化規(guī)律。這些化學(xué)成分借著化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的不溶性著色物質(zhì) 來顯示。對(duì)于某些化學(xué)成分，例如：Fe+糖原、核酸等，可以用直接或間接的 化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生著色沉淀而顯示其部位和相對(duì)含量。對(duì)于酶類，顯示它的活性，須 有該種酶的底物（被該種酶作用的物質(zhì)），由酶對(duì)底物的分解，直接或間接地生成著色物質(zhì)而被顯示。凡是在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞原位顯示的化學(xué)物質(zhì)，稱組 織化學(xué)，若用電鏡觀察細(xì)胞原位化學(xué)成分的著色

7、部位， 則稱電鏡細(xì)胞化學(xué)，下面 從原理方面簡要介紹幾種常用的組織化學(xué)染色技術(shù)：1、顯示琥珀酸脫氫酶（SDH ）活性的硝基-BT法：（Succi nate dehydroge nase ）酶的定位及生物學(xué)意義：琥珀酸脫氫酶是線粒體標(biāo)志酶，其存在于所有有氧呼吸的細(xì)胞，和線粒體內(nèi)膜緊 密結(jié)合。該酶不需輔酶而自身有黃素蛋白（FP,Flavoprotein ）為輔基。在組化 反應(yīng)中常用來反映三羧酸循環(huán)的情況。其催化過程如下：弱-單甲（紫紅色）HOOC-CH2-CH2-COOHFPH2 四唑（甲）J（有色）強(qiáng)-雙甲（深紫藍(lán)色）（琥珀酸）（黃素蛋白）HOOC-CH=CH=COOHFPH2 四唑（無色）（延胡

8、索酸）原理：上述的反應(yīng)最后一步的原理是，硝基 -BT （Nitro-blue tetrozolyum，四唑氮藍(lán)）系異環(huán)族化合物四唑鹽，當(dāng)它接受氫時(shí)，本身被還原為有色沉淀產(chǎn)物（甲）（Formazan ）。孵育液配制：A液（貯備液）0.2M磷酸緩沖液（PH7.6） 10ml等量混合0.2M 琥珀酸鈉（SOl.succinate ） 10ml 備用B液：硝基四唑（Nitro-Br ）2mg2ml0.2M 磷酸緩沖液（PH7.6） 2ml?。篈液2mlB液2ml孵育液聚乙烯吡烷酮（PVP）300mg方法： 新鮮恒冷箱冷凍切片，厚68卩m,平貼在蓋玻片上。 滴染法：將有冷凍切片的蓋玻片（標(biāo)本面朝上）平放

9、于預(yù)熱好的培養(yǎng)皿中（底部墊一濕濾紙），滴加孵育液至全部覆蓋組織，于37 T溫箱中孵育4560分鐘 （肝，心肌組織15分鐘即可）。 于生理鹽水中沖洗二次（輕晃，以防脫片）。 10%福爾馬林生理鹽水固定10分鐘。 15%酒精浸洗5分鐘（換二次）。 甘油明膠封片。結(jié)果：酶活性強(qiáng)處呈藍(lán)色顆粒（雙甲沉淀），酶活性較低時(shí)形成紫紅色單甲。在光鏡下，該酶活性于肝小葉內(nèi)分布呈明顯分帶現(xiàn)象，周邊帶強(qiáng)于中央帶。在心 肌細(xì)胞縱切面，酶活性顆粒沿心肌細(xì)胞長軸整齊排列， 相鄰心肌細(xì)胞的空白處為 閏盤。2、顯示葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase )活性的鉛法：(Glucosel-phosphate phosphohydr

10、olase )酶的定位及其生物學(xué)意義：該酶主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的標(biāo)志酶。G-6-Pase參與糖代謝，能水解葡萄糖-6-磷酸而釋放出葡萄糖和磷酸。原理：G-6-Pase將底物(葡萄糖-6-磷酸鉀鹽)水解產(chǎn)生磷酸離子，后者被孵 育液中的硝酸鉛所捕獲，最終反應(yīng)物為顆粒狀的硫化鉛沉淀，其反應(yīng)式如下：酶 Pb(NO3)2葡萄糖-6-磷酸鉀+H2O葡萄糖+磷酸(NH4)2SPb2(PO4)2PbS J(無色)(棕色)(試劑配制及方法詳見組織學(xué)技術(shù)專著)結(jié)果：酶活性部位呈棕色硫化鉛顆粒沉淀。 在光鏡下G-6-Pase活性顆粒較均 勻地分布于胞質(zhì)中3、顯示堿性磷酸酶(APL)的鈣鉆法(Alkaline p

11、hosphohydrolase )酶的定位及其生物學(xué)意義：ALP在堿性環(huán)境下能催化各種醇和酚的磷酸酯水解，參與磷酸根的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過 程，并有磷酸轉(zhuǎn)移的作用，故在細(xì)胞膜上運(yùn)輸較活躍，如毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，腎 近曲小管刷狀緣，腸上皮紋狀緣等處，該酶的活性較高。原理：ALP將磷酸鹽底物(如 伕甘油磷酸鈉等)分解產(chǎn)生磷酸根離子，后者為孵育液中的氯化鈣捕獲生成磷酸鈣沉淀，但該沉淀為非金屬鹽，需加入硝酸鉆, 使其生成磷酸鉆沉淀，因無色，再需通過硫化銨處理，形成棕黑色硫化鉆沉淀而 被顯示。在PH9.2 9.4環(huán)境中表現(xiàn)最大活性。反應(yīng)式如下：ALPCa+禺甘油磷酸鈉磷酸離子Ca2(PO4)2Co(NO3)2(NH

12、4)2SCO2 (PO4) 2CoS J(無色)(棕黑色)結(jié)果：酶活性部位為棕黑色 CoS沉淀。4、顯示核酸的甲綠一派喏寧(Methyl gree n-pyro nln)染色：原理：甲綠和派喏寧都是堿性染料，對(duì)兩種核酸(DNA和RNA)能分別染色, 其機(jī)制可能在于兩種核酸分子都是多聚體，但聚合程度有所不同。甲綠具有兩個(gè)帶電荷的氨基，而派喏寧只有一個(gè)。因此在混合的染液中，二者競爭的結(jié)果是甲 綠易與聚合程度較高的DNA結(jié)合呈現(xiàn)藍(lán)綠色，而派喏寧則與聚合程度較低的 RNA結(jié)合呈現(xiàn)紅色。(試劑制備及方法詳見組織學(xué)技術(shù)專著)結(jié)果：核內(nèi)DNA呈藍(lán)綠色，核仁及胞質(zhì)內(nèi) RNA呈桃紅色。5、顯示糖原的過碘酸雪夫氏（PAS）反應(yīng)：原理：糖原是一種動(dòng)物多糖，無色，富含于肝細(xì)胞和肌細(xì)胞胞質(zhì)中。PAS反應(yīng)（Periodic acid schiff Reaction ）能在糖原所在部位生成紫紅色物質(zhì)，從而