單純皰疹病毒疫苗的研究進(jìn)展

1、單純皰疹病毒疫苗的研究進(jìn)展作者：傅錦堅，林元藻，胡立勇【關(guān)鍵詞】單純皰疹病毒；疫苗單純皰疹病毒是引起生殖器皰疹最常見的原因。近年來生殖器皰疹發(fā)病率在許多國家不斷上升，成為感染率最高的性傳播疾病之一。據(jù)WHO古計每年生殖器皰疹的新發(fā)病例約2000萬。而臨床上80%HSV染者表現(xiàn)為無癥狀感染或癥狀未被識別，這是造成HSVS染流行的重要因素。盡管現(xiàn)有的抗病毒藥物應(yīng)用能縮短有生殖器皰疹感染的病程，并且對治療復(fù)發(fā)性感染取得一些效果，但這些抗病毒藥物不能有效預(yù)防皰疹病毒原發(fā)感染以及控制皰疹病毒潛伏感染和復(fù)發(fā)性感染。因此，研制和接種HSV苗是預(yù)防該病毒感染的理想方法。大量研究表明：在動物模型中，已獲得HSV

2、疫苗能預(yù)防病毒原發(fā)感染， 并能有效地控制復(fù)發(fā)性生殖器皰疹感染的證據(jù) 1。 目前HSVgE苗的研制日益受到人們的重視2,研究較多的有滅活病毒疫苗、亞單位疫苗、減毒活疫苗、復(fù)制受限疫苗、DISC疫苗、活載體疫苗以及DNAE苗等，現(xiàn)分述如下。1滅活病毒疫苗早期的滅活病毒疫苗是利用加熱、化學(xué)處理、紫外線照射等方法將接種在雞胚中的HSVW毒滅活制備疫苗?，F(xiàn)在的滅活疫苗是將在細(xì)胞中培養(yǎng)的病毒滅活并經(jīng)過一系列的特別純化制成的。滅活疫苗既可用于預(yù)防HSVS染，也可用于治療HSVS染。 但滅活疫苗存在免疫原性弱、 不能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生廣泛持久的免疫反應(yīng)、不能確定是否所有病毒均被滅活、裂解的DNAt段潛在致癌的可能性

3、、生產(chǎn)費用高等缺點3o因此，目前歐美一些國家已經(jīng)放棄了對這些疫苗的研制。2減毒活疫苗近年來HSV減毒活疫苗的研制主要集中在造成特異性地缺失病毒基因某一區(qū)段，使HSV勺神經(jīng)毒性減弱，建立潛伏感染的能力降低，DNAM制障礙等，同時保持病毒的增殖能力和免疫原性這一目標(biāo)上。Post和Roizman等以HSV-1型的F株為原型構(gòu)建的HSV毒活疫苗就是通過刪減決定皰疹病毒毒性的基因片段來制備的。他們首先將胸音激酶（TK）基因、以及獨特長區(qū)域（UL）、獨特短區(qū)域（US）基因間的連接部分基因切除，目的是去除神經(jīng)毒性相關(guān)基因片段。然后將HSV-2編碼糖蛋白gD,gG,gI的基因片段插入內(nèi)部反向重復(fù)序列中，最后，

4、將TK基因重新插入，構(gòu)建的這種重組病毒稱為R7020在動物和人體內(nèi)均證實R7020能有效地誘導(dǎo)免疫應(yīng)答4,50Prichard6以HSV-2的毒株G為原型，將病毒的丫134.5基因、UL55-56基因、UL43.5基因以及US10-12基因去除，將此構(gòu)建好的重組減毒活疫苗命名為AD472用HSV手生毒株HSV-2（G）攻擊豚鼠生殖道后，給予減毒活疫苗AD472結(jié)果顯示，肌肉注射AD472后，可以減少原發(fā)性生殖道感染的發(fā)生，減輕皮損癥狀，減少排毒，同時還可以降低病毒復(fù)發(fā)率，表明該重組減毒活疫苗能減少潛伏感染的建立以及能抑制潛伏病毒的再激活，其抗感染作用較強。ICP10是HSV復(fù)制所必需的核糖核甘

5、酸還原酶。Wachsma”7等將其大亞基蛋白激酶（PK）去除后，評價這種重組復(fù)制減毒活疫苗ICP10APK在減少和預(yù)防豚鼠生殖器皰疹復(fù)發(fā)中的作用。結(jié)果解剖鼠的神經(jīng)節(jié)后，發(fā)現(xiàn)疫苗接種組僅有12%勺個體神經(jīng)節(jié)中有病毒潛伏，遠(yuǎn)低于對照組（70%,并且疫苗接種組神經(jīng)節(jié)內(nèi)病毒DNAt量也明顯低于對照組。疫苗接種組鼠HSV發(fā)感染率為6%復(fù)發(fā)感染率為6%而安慰劑組鼠HSV發(fā)感染率為100%復(fù)發(fā)率為70%以上結(jié)果表明，ICP10APK重組復(fù)制減毒活疫苗能保護機體抵抗HSV染，明顯減少潛伏感染和臨床復(fù)發(fā)，是一種較好的預(yù)防性和治療性疫苗。另據(jù)報道，ICP10APK重組復(fù)制減毒活疫苗能激發(fā)HSV#異的CD4+Th1

6、5應(yīng)以及CD8+田胞毒性T淋巴細(xì)胞的抗病毒活性，其抗感染能力較強8。但也有報道指減毒活疫苗隱患較多，一方面，重組的HSVW毒經(jīng)過反復(fù)的細(xì)胞培養(yǎng)后，仍然不能獲得穩(wěn)定的減毒株，減毒活疫苗可能重新獲得病毒毒性；另一方面，減毒的病毒可能會潛伏于病人體內(nèi)，有可能會與感染的HSVE于生病毒株重組， 重新獲得病毒毒性。 此外， 某些HSV因也存在致癌的潛在可能。 從HSV毒活疫苗存在的這些缺陷來看，HSVE苗的發(fā)展趨勢在于活載體基工程疫苗。3亞單位疫苗許多研究采用HSVft面糖蛋白作為免疫原來制作亞單位疫苗。HSV蛋白定位于病毒囊膜上，包膜蛋白均為糖基化蛋白，這些糖蛋白產(chǎn)生的免疫應(yīng)答與病毒的中和作用有關(guān)。已

7、發(fā)現(xiàn)的HSV蛋白有11種，目前亞單位疫苗研究的熱點在HSV勺gB和gD,因為它們均能誘導(dǎo)體7免疫和細(xì)胞免疫9。在HSV-1和HSV-2感染者體內(nèi)，這2種蛋白抗原均較易被抗體識別，激發(fā)遲發(fā)超敏反應(yīng)和T細(xì)胞增殖反應(yīng)。gD是抗HSVS染中最重要的保護性抗原，能保護動物免受HSV的攻擊，抑制潛伏感染的發(fā)生。甚至當(dāng)病毒已經(jīng)在機體建立潛伏感染后，還能降低病毒的復(fù)發(fā)率。早期人們從HSV染的細(xì)胞培養(yǎng)物中分離純化病毒的包膜糖蛋白來制取亞單位疫苗。目前，除了從感染的細(xì)胞溶菌產(chǎn)物中分離gRgD之外，人們還可利用DNA重組技術(shù)，在大腸桿菌、酵母、桿狀病毒、哺乳動物細(xì)胞等多種表達(dá)系統(tǒng)中分別或聯(lián)合表達(dá)各種HSV表面糖蛋白

8、，制成亞單位疫苗。以上疫苗分別在動物和人體中進(jìn)行了試驗，較有意義的結(jié)果主要來自重組亞單位疫苗10。動物實驗證實，亞單位疫苗能不同程度地誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和性抗體，抗體產(chǎn)生水平高低與動物遭受病毒感染的程度成正比。該疫苗還可不同程度地降低動物被病毒感染后的發(fā)病率和死亡率。一種較有前景的亞單位疫苗是由G鈴司生產(chǎn)的HSV-2gD明磯-MPL疫苗。 在早期的實驗中，這種疫苗顯示出較強的免疫原性11,可誘發(fā)保護性免疫應(yīng)答。當(dāng)這種疫苗用于HSVM發(fā)感染的豚鼠模型時，能刺激鼠產(chǎn)生丫-干擾素、IL-2等細(xì)胞因子。Roberto12等評價了一種以氫氧化鋁作為佐劑的重組gB-gD-gE亞單位疫苗在治療豚鼠復(fù)發(fā)生殖器皰疹

9、中的作用。使用病毒攻擊豚鼠建立HSVM發(fā)感染模型后，于豚鼠皮下注射疫苗，1周注射7d,間隔1周再重復(fù)接種，連續(xù)5周。以后每隔半個月接種1次，共免疫接種23次。結(jié)果表明，此亞單位疫苗能有效地降低豚鼠HSV-2復(fù)發(fā)感染的頻率。按照這種接種方法，在人體接種重組gB-gD-gE亞單位疫苗或許能治療人類復(fù)發(fā)生殖器皰疹感染。目前，進(jìn)一步的實驗正在進(jìn)行中。盡管gB和gD是HSV勺主要抗原，能引起機體體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，由于HSVfe疫是一個復(fù)雜的過程，單憑某種抗原尚不足以建立完全的免疫保護13。使用亞單位疫苗，就不可避免面臨窄譜、效果短暫等問題。為此人們正在尋找控制HSV復(fù)發(fā)感染的重要免疫效應(yīng)因子以及病

10、毒作用的靶點，以期在未來能開發(fā)出一種高效的治療性疫苗。4活載體基因工程疫苗非致病性的活載體基因工程疫苗是把表達(dá)HSV-2抗原的基因插入到能完整復(fù)制的病毒或細(xì)菌載體上。HSV舌載體基因工程疫苗兼具了減毒活疫苗和亞單位疫苗的優(yōu)點，同時它能避免HSV勺毒性、潛伏性、活化以及致癌性等問題。目前人們研究的非致病性復(fù)制載體包括：牛痘病毒、腺病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、腺相關(guān)病毒、沙門氏菌14,15等。在免疫接種時，這些病毒或細(xì)菌的載體能表達(dá)具有免疫原性的蛋白，并且相關(guān)基因編碼產(chǎn)物能誘導(dǎo)體液免疫以及細(xì)胞免疫。在眾多載體中，最令人感興趣的是腺病毒載體。其獨特優(yōu)勢在于腺病毒基因組內(nèi)有2個能插入外源基因的功能區(qū)域，

11、第一個位于基因組的左側(cè)，稱為E1區(qū)，此區(qū)域是腺病毒復(fù)制必需區(qū)。第二個是E3區(qū)，該區(qū)是腺病毒復(fù)制非必需區(qū)。Gallichan14等用表達(dá)HSVgB勺重組腺病毒作為活疫苗在鼠鼻腔內(nèi)接種后，產(chǎn)生局部黏膜免疫，并能有效抵抗HSV勺致死劑量攻擊。血清中IgG和IgA抗體水平較高，且從小鼠的陰道洗液中能檢出IgA抗體，說明該疫苗局部免疫效果較好。這個突出的特點使得腺病毒載體疫苗有望能成為有效的預(yù)防性疫苗之一。Clement16等利用同源重組技術(shù)，將HSV-2胸昔激酶的基因插入到細(xì)菌人工染色體（BAC序列中，將來自于感染細(xì)胞內(nèi)的重組病毒DNA專染大腸桿菌，當(dāng)再次轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞時，HSV2-BACDNA有感

12、染性，而目的病毒胸音激酶為陰性。將構(gòu)建好的HSV2-BACDNA苗接種于鼠體內(nèi)，能誘發(fā)較強的HSV-2特異性抗體反應(yīng)，且該疫苗能保護鼠免遭HS死劑量攻擊。該實驗結(jié)果表明，使用BACS體才建HSV-2疫苗是一種新穎的技術(shù)， 未來有望將這種技術(shù)應(yīng)用于分析HSV-2的免疫效應(yīng)，其開發(fā)前景較好。5復(fù)制受限或復(fù)制缺損的突變疫苗這種方法結(jié)合了減毒活疫苗以及滅活疫苗的某些優(yōu)點。制備方法是將病毒復(fù)制必需基因部分去除后，缺陷性病毒疫苗在經(jīng)過遺傳改造過的細(xì)胞株里生長，以構(gòu)成性地表達(dá)缺失的基因產(chǎn)物1。子代病毒缺乏必需基因產(chǎn)物，因而沒有傳染性。研究表明，在動物實驗中，這種疫苗具有抗HSV原發(fā)感染作用17。Forres

13、ter等研制出一種新穎的HSVg苗，研究者將gH基因從HSVW毒基因組中剔除出去。由于介導(dǎo)HSV8入細(xì)胞的糖蛋白是gH,如果缺失了表面gH的基因后，病毒在宿主細(xì)胞中能完成一個完整的復(fù)制周期，但其釋放出來的子代病毒由于缺乏gH而不具備感染性。這種病毒稱之為非感染性單周期(DISQ病毒。該種缺陷突變病毒除了不能表達(dá)gH蛋白以外，并不影響其它HSV白質(zhì)的表達(dá)。一項實驗顯示。使用gH缺失的DISC疫苗后，能預(yù)防HSV感染，而初次皮損后使用該種疫苗，具復(fù)發(fā)率明顯降低。目前，第一期的臨床試驗18顯示，這種疫苗安全，免疫原性較強。6DNA疫苗DNA6苗，作為20世紀(jì)90年代興起的一種以核酸為基礎(chǔ)的全新免疫接

14、種技術(shù)，為疫苗的研制開辟了新的途徑。DNAS苗主要是將病毒的編碼基因插入質(zhì)粒DNA中，直接接種于機體后，能在體內(nèi)表達(dá)相應(yīng)的病毒蛋白，并誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性的體液免疫及細(xì)胞免疫反應(yīng)19,20:0因為蛋白抗原在體內(nèi)源源不斷地產(chǎn)生，故免疫時間長。它具有活載體免疫的某些優(yōu)點，能克服由非復(fù)制性抗原所誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫效果較低等難題，并且不用擔(dān)心病毒的減毒作用等問題。因而，即使沒有有效的佐劑，這種疫苗也能誘導(dǎo)強的細(xì)胞免疫。目前， 研究得最多的HSVDNAS苗是HSV-2gDS苗以及gBDNAg苗。 豚鼠生殖器皰疹動物模型實驗表明，與對照組相比，這2種疫苗的免疫原性強，不但能預(yù)防HSV發(fā)感染、明顯減少病毒在陰道內(nèi)

15、的復(fù)制，而且能減少病毒的潛伏感染，并且臨床復(fù)發(fā)率也明顯降低210 x隨著分子生物學(xué)和分子克隆技術(shù)的發(fā)展，人們研制HSVDNAE苗的技術(shù)越來越多，思路也越來越廣?，F(xiàn)將近年來HSVDNAS苗研制的進(jìn)展分述如下：多效價DNAS苗的研制：Hyung 22等構(gòu)建了HSV-2gB2HSV-2gD”及HSV-2gB2:gD2三種DNA6苗，比較了它們的免疫原性和保護作用。結(jié)果顯示：HSV-2gB2:gD2DN戚苗誘發(fā)的中和抗體滴度明顯高于gB2及gD2組的抗體滴度。并且此二價DNAS苗對HSVt死劑量攻擊的保護作用也比單用gB或gDDNAS苗效果要好。同時，它所誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞毒性效應(yīng)也比其余2種單效價疫苗

16、要強。重組質(zhì)粒DNAS苗的研制：細(xì)菌來源的質(zhì)粒DNAt有大量非甲基化的以CpG為核心的核甘酸序列，這些核甘酸序列能通過多種途徑活化細(xì)胞因子如：丫-干擾素、IL-12、IL-18等。Domingo23等將編碼HSV-2gBgD兩種蛋白的序列嵌合于質(zhì)粒DN斫，免疫BALB/c鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠分泌的丫-干擾素的水平增加，并且生存時間比單獨用gB或gD編碼序列與質(zhì)粒共構(gòu)建的DNAS苗來免疫小鼠的生存時間更長。 這些結(jié)果提示了使用質(zhì)粒DN胸碼HSV白質(zhì)嵌合序列以制成DNAS苗的效果比質(zhì)粒編碼單個蛋白質(zhì)序列制成的DNAS苗效果好。利用這種方法，未來我們有望能研制出多價DNAS苗以抗HSV感染，并為防治其它病原

17、體的感染開辟新的途徑。Sara24等設(shè)計了一種HSV-2gDDNAS苗，使用CPG寡聚脫氧核甘酸即（CPGODN作為該疫苗的佐劑以增強其免疫原性，免疫C57Bl/6鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該疫苗誘發(fā)了較強的抗HSV感染的免疫反應(yīng)。并且小鼠體內(nèi)IgG2c的水平較高，而IgG2c在C57Bl/6鼠體內(nèi)是一種Th1型免疫反應(yīng)的指示劑。并觀察到多種細(xì)胞因子如丫-干擾素、IL-2、IL-4等在體內(nèi)高水平地表達(dá)。細(xì)胞因子為佐劑的DNA苗研制：SLee25等選擇了包括能編碼丫-干擾素的T細(xì)胞、NKM胞以及IgG2a同型免疫球蛋白在內(nèi)的細(xì)胞因子基因與質(zhì)粒DNAft同接種動物。結(jié)果表明，該疫苗能提高機體體液免疫以及T細(xì)胞的

18、免疫應(yīng)答，并能降低小鼠HSV感染的發(fā)病率。而對細(xì)胞因子作為DNAS苗佐劑的作用效果進(jìn)行分析時發(fā)現(xiàn)，IL-18的作用效果優(yōu)于IL-12,且系統(tǒng)接種效果優(yōu)于黏膜接種效果。同時，用該疫苗免疫IFN-丫-/-鼠后，該鼠對于病毒的攻擊仍然較為敏感。這表明了疫苗的保護作用主要來自于其誘導(dǎo)產(chǎn)生的丫-干擾素。而Y-干擾素抗HSV染的作用主要來自于CD4+TM胞和CD8+T細(xì)胞。 在HSVK原和抗原遞呈細(xì)胞的共同刺激下，這兩種細(xì)胞均產(chǎn)生大量的Y-干擾素20,26o以上結(jié)果表明，聯(lián)合使用能編碼細(xì)胞因子的DNA具預(yù)期效果較為理想，開發(fā)前景較好。黏附分子LFA-3為佐劑的DNAS苗研制：T細(xì)胞表面的黏附分子如CD雄識

19、別抗原遞呈細(xì)胞表面的細(xì)胞間黏附分子LFA-3。Jeong27等將LFA-3的cDNAWgD質(zhì)粒共接種于小鼠體內(nèi),觀察該疫苗的免疫調(diào)節(jié)作用以及抗HSV-2感染的保護作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該疫苗能提高血清中g(shù)D特異性的IgG水平。此外，LFA-3還可以使Th細(xì)胞的增殖反應(yīng)提高，并且使脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-2、丫-干擾素、IL-4、IL-10的數(shù)量增多。當(dāng)用HS死劑量攻擊小鼠后再使用該疫苗，能明顯提高動物的生存率。該研究表明，黏附分子LFA-3能調(diào)控HSV染鼠的抗原特異性免疫應(yīng)答，這種調(diào)控作用是通過誘導(dǎo)CD4+Th1T細(xì)胞亞群增殖反應(yīng)來實現(xiàn)的。CCR祝體為彳OU的DNA6苗研制：CCR酒己體SLC和ELC近年來被認(rèn)為是在二級淋巴組織中建立功能性細(xì)胞微環(huán)境以啟動免疫反應(yīng)的關(guān)鍵分子。Eo28等把編碼gB以及CCR酒己體的質(zhì)粒DNA過系統(tǒng)給藥和黏膜給藥兩個途徑免疫BALB/c鼠，以觀察不同給藥途徑的免疫