實(shí)驗(yàn)５蠶豆根尖細(xì)胞微核檢測(cè)工作技術(shù)

1、實(shí)驗(yàn)蠶豆根尖細(xì)胞微核檢測(cè)工作技術(shù)三三 材料材料 蠶豆根尖（新鮮的固定材料）四四 步驟步驟 1 蠶豆浸種催芽 2 待測(cè)液對(duì)根尖的處理 3 根尖細(xì)胞的恢復(fù)培養(yǎng) 4 根尖的固定5 根尖的酸水解：將固定的幼根放入青霉素瓶中，用dH 2 O 浸洗2次，除去水后加入5N HCL 將幼根泡住，放入30OC水浴中水解28 min 左右（水解時(shí)間與水溫有反相關(guān)關(guān)系），待幼根軟化（同時(shí)變?yōu)榘胪该鳎┘纯扇〕?，用dH 2 O 浸洗幼根2次，5min/次。6 制片：將幼根放在擦凈的載片上，用解剖針截下4mm左右的根尖部分，搗碎，加入1-2滴改良苯酚品紅染色液，染色10分鐘左右，然后加蓋片，壓片。7 鏡檢：先在低倍鏡下找

2、出具微核的細(xì)胞，再轉(zhuǎn)入高倍鏡進(jìn)行仔細(xì)觀察。五五 作業(yè)作業(yè) 繪出一個(gè)具微核的蠶豆根尖細(xì)胞圖。附微核識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)附微核識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)： 1、凡是主核大小的1/3以下，并與主核分離的小核； 2、小核著色與主核相當(dāng)或稍淺； 3、小核形態(tài)可為圓形，橢圓形，不規(guī)則形等。凡符合以上3條的小核就是微核（micronucleus,MN)微核形成機(jī)制：微核形成機(jī)制：附：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理和污染程度的劃分將微核觀察記錄于表上片號(hào)鏡檢日期鏡檢者各次觀察的細(xì)胞數(shù)與微核數(shù)微核數(shù)/細(xì)胞數(shù)總計(jì)微核千分率（MN%o)平均值1）各測(cè)試樣品（包括對(duì)照組）微核千分率（MN) 的計(jì)算為：MN=某測(cè)試樣點(diǎn)（或?qū)φ眨┯^察到的微核數(shù)/某測(cè)試樣點(diǎn)（或?qū)φ眨?/p>

3、觀察的細(xì)胞數(shù)）MN 在10以下的為基本污染10 - 18 區(qū)間為輕度污染18 - 30 區(qū)間為中度污染30 以上為嚴(yán)重污染注：每個(gè)處理觀察3個(gè)根尖，每個(gè)根尖記數(shù)1000個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)其中含微核的細(xì)胞數(shù)然后平均，即為該處理的微核千分率。2）污染指數(shù)（pollution index)污染指數(shù)（PI)=樣品實(shí)測(cè)MN 平均值/標(biāo)準(zhǔn)水MN 平均值PI在 0- 1.5 區(qū)間為基本無(wú)污染 區(qū)間為輕度污染 區(qū)間為中度污染 以上為嚴(yán)重污染注：1）對(duì)嚴(yán)重污染的水環(huán)境，監(jiān)查處理時(shí)造成根尖死亡，應(yīng)稀釋后再做測(cè)試； 2）如RT 35，MN本底會(huì)增高，但可經(jīng)污染指數(shù)數(shù)據(jù)處理，不會(huì)影響監(jiān)測(cè)結(jié)果。In an individua

4、l heterozygous for a paracentric inversion, the chromosomes form an inversion loop during pairing in prophase I.后期后期染色體橋染色體橋后期后期染色體橋和染色體斷片染色體橋和染色體斷片二分體時(shí)期微核二分體時(shí)期微核倒位的細(xì)胞學(xué)特征：倒位的細(xì)胞學(xué)特征：粗線期倒位圈；后期橋和斷片；微核粗線期倒位圈；后期橋和斷片；微核倒位的遺傳效應(yīng)：倒位的遺傳效應(yīng)：改變重組率；基因重排改變重組率；基因重排 微核試驗(yàn)自70 年代初產(chǎn)生以來(lái)的近30 年的時(shí)間里,在環(huán)境物質(zhì)遺傳毒理檢測(cè)方面發(fā)揮了重要的作用。它以經(jīng)

5、濟(jì)、簡(jiǎn)便、快速、敏感、特異、準(zhǔn)確等特點(diǎn),已成為檢測(cè)染色體損害的致突變劑和環(huán)境污染物的快速初篩試驗(yàn),已廣泛用于篩檢具有染色體損傷作用的致突變劑(Mutagens) 和環(huán)境污染物( Environmental Pollutants) 。 微核(micronucleus ,MN) 是指位于生物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中獨(dú)立于主核,直徑小于主核1/ 201/ 3 ,完全與主核分開(kāi)的圓形或橢圓形的微小核。它可以是整條染色體,也可以是染色體斷片,染色性與主核一致,其中部分微核具有DNA 復(fù)制能力。微核是由于外界損害因素使染色體發(fā)生斷裂,細(xì)胞進(jìn)入下一次分裂時(shí),染色體不能隨有絲分裂進(jìn)入子細(xì)胞,而導(dǎo)致染色體丟失或斷裂, 從

6、而形成一個(gè)或數(shù)個(gè)小核.微核試驗(yàn)的產(chǎn)生與發(fā)展微核試驗(yàn)的產(chǎn)生與發(fā)展 微核試驗(yàn)創(chuàng)建于20 世紀(jì)70 年代初,首先由Heddle 和Schmid 利用嚙齒類(lèi)骨髓細(xì)胞建立了微核測(cè)定方法 。1970 年Schmid 及Heddle 用中國(guó)金黃地鼠觀察了抗腫瘤藥三亞胺醌,觀察骨髓與外周血細(xì)胞學(xué)的變化。并且提出用本來(lái)無(wú)核的外周血嗜多染紅細(xì)胞中MN 發(fā)生率來(lái)作為微核試驗(yàn)的基本指標(biāo),并正式命名為MNT。此后至70 年代中期,該研究小組的工作,全面奠定了MNT 的理論及應(yīng)用基礎(chǔ)。經(jīng)Heddle 等人30 多年的發(fā)展,許多國(guó)家和國(guó)際組織已將其規(guī)定為新藥、食品添加劑、農(nóng)藥、化妝品、環(huán)境化學(xué)物質(zhì)等毒理安全性評(píng)價(jià)必做的實(shí)驗(yàn)

7、 。 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展和不斷滲透到微核研究中,使微核試驗(yàn)的檢測(cè)應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大,現(xiàn)已發(fā)展成為能同時(shí)檢測(cè)染色體斷裂、染色體丟失、分裂延遲、不分離、DNA 損傷修復(fù)障礙、Hprt 基因突變、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分裂不平衡等多種遺傳損害終點(diǎn) 。 自20 世紀(jì)70 年代Heddle 和Schmid 利用嚙齒類(lèi)骨髓細(xì)胞建立了微核試驗(yàn)檢測(cè)方法以來(lái),各國(guó)都在不斷研究探索微核試驗(yàn)技術(shù)。主要從三個(gè)方面來(lái)進(jìn)行:一是探索微核試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù),即研究材料、實(shí)驗(yàn)方法、給藥方式、染毒途徑、制片方法、染色方法等;二是利用微核試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)各種致突變物質(zhì);三是通過(guò)微核試驗(yàn)來(lái)預(yù)測(cè)疾病。微核形成機(jī)理化學(xué)毒性物質(zhì)化學(xué)毒性物質(zhì)染色體

8、斷裂劑可誘發(fā)染色體發(fā)生斷裂的遺傳毒性物質(zhì)。細(xì)胞核的主要成分是染色體,在正常的情況下細(xì)胞分裂時(shí)染色體被紡錘絲牽引平均分向細(xì)胞的二極,形成二個(gè)正常的核,被平均分配給二個(gè)細(xì)胞。在染色體斷裂劑如絲裂霉素存在下,染色體發(fā)生斷裂,并不發(fā)生重接或不在原處重接,則形成了無(wú)著絲粒的段片,在細(xì)胞分裂后期不能向兩極移動(dòng),而殘留在細(xì)胞中央的赤道板附近,當(dāng)子細(xì)胞形成時(shí)則游離于細(xì)胞質(zhì)中形成不含著絲粒的微核 。非整倍體劑可以使染色體和紡錘體聯(lián)結(jié)發(fā)生障礙或紡錘體功能受損。在細(xì)胞分裂時(shí),染色體不發(fā)生分離而產(chǎn)生非整倍體子細(xì)胞,同時(shí)在赤道板中央殘留一條或多條染色體,它們?cè)谧蛹?xì)胞形成時(shí)不能被包在子核中,而游離于細(xì)胞質(zhì)中形成含著絲粒的

9、微核。一般的遺傳毒性物質(zhì)兼有染色體斷裂劑和非整倍體劑兩方面的作用。核體出芽核體出芽間期的細(xì)胞核向外形成瘤狀突起,形成芽體最后脫離開(kāi)主核而形成微核。 放射線放射線放射線可以引起DNA 損傷,產(chǎn)生錯(cuò)誤修復(fù)的雙鏈斷裂,導(dǎo)致微核出現(xiàn)。 自發(fā)在正常情況下生物也會(huì)自然出現(xiàn)較低頻率的微核,在人類(lèi)一般隨年齡增大而增加,往往女性高于男性。主要由于自身的免疫力低下和超氧化物、自由基、易氧化物等因素較多有關(guān)。 化學(xué)誘變劑即染色體斷裂劑和非整倍體劑。 細(xì)胞組成成份VB12 、葉酸缺乏可引起微核。 抗氧化劑谷胱甘肽、VC 、VE、硒等具有降低微核產(chǎn)生的能力,主要是可以清除體內(nèi)的超氧化物等物質(zhì)有關(guān)。 其他因素微核也是細(xì)胞

10、凋亡的產(chǎn)物,當(dāng)程序性死亡基因激活,隨之Ca + + 依賴性內(nèi)切酶激活,切割DNA ,形成細(xì)胞核碎片,形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為核深染,染色質(zhì)邊緣分布的帽形核,最后導(dǎo)致微核形成 。影響微核產(chǎn)生的因素影響微核產(chǎn)生的因素常規(guī)微核試驗(yàn)常規(guī)微核試驗(yàn)是利用細(xì)胞生物學(xué)方法經(jīng)顯微制片后在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)待測(cè)材料微核率的方法。這是普遍采用的基本方法,可以分為兩類(lèi): 將微核試驗(yàn)材料,在加入待測(cè)物質(zhì)的環(huán)境中培養(yǎng)一段時(shí)間,染色制片,顯微觀察計(jì)算微核率。1) 直接將受遺傳毒理?yè)p害生物的相應(yīng)材料制片,顯微觀察計(jì)算微核率。細(xì)胞分裂阻滯微核分析法細(xì)胞分裂阻滯微核分析法1985 年Fenech 等人建立的方法,用胞質(zhì)分裂阻滯劑阻斷胞質(zhì)分裂,

11、但不影響細(xì)胞核分裂,有絲分裂細(xì)胞呈特殊形態(tài)的雙核細(xì)胞,未發(fā)生核分裂的細(xì)胞則維持單核細(xì)胞形態(tài)。檢測(cè)致突變因素作用后的雙核細(xì)胞率和雙核細(xì)胞微核率,可同時(shí)獲得致突變因素對(duì)細(xì)胞的遺傳毒性損害和對(duì)細(xì)胞周期影響的信息 。微核試驗(yàn)技術(shù)的種類(lèi)微核試驗(yàn)技術(shù)的種類(lèi)熒光原位雜交試驗(yàn)與熒光原位雜交試驗(yàn)與DNA 探針探針熒光原位雜交( Fluorescence in situ hybridization ,FISH) 技術(shù)是近年來(lái)開(kāi)展起來(lái)的分子生物學(xué)新技術(shù)。它是使用生物熒光素標(biāo)記的各類(lèi)DNA和RNA 探針與細(xì)胞或組織在玻片上進(jìn)行原位雜交,被觀察的特定DNA 片段(或序列) 在熒光顯微鏡下固定在細(xì)胞核或染色體的原有部位顯

12、示熒光。利用熒光原位雜交試驗(yàn)可以檢測(cè)是染色體斷裂還是染色體丟失,以及可以判斷是哪一條染色體,那一段所產(chǎn)生的微核。目前已成功用于MN 實(shí)驗(yàn)的DNA 探針主要有兩類(lèi):第一類(lèi):是含DNA 重復(fù)序列的探針,主要用于檢測(cè)染色體著絲粒的DNA。第二類(lèi):是含染色體端粒DNA 序列的探針,它主要顯示染色體臂的存在?？怪z?？贵w染色抗著絲?？贵w染色(CREST 染色染色) 抗著絲?？贵w(Anti - kinetochore antibodies) 是美國(guó)學(xué)者M(jìn)oroi 及其同事于1980年在硬皮病病人血清中發(fā)現(xiàn)的一種自動(dòng)抗體,這些自動(dòng)抗體可以通過(guò)免疫熒光技術(shù)檢測(cè)到。他們與染色體著絲粒蛋白(抗原) 成份相結(jié)合。具

13、有較強(qiáng)的特異性。但并不所有硬皮病病人的血清中都含有該自動(dòng)抗體,含該抗體的病人皮膚損害往往并不嚴(yán)重和廣泛。但卻有顯著的CREST 征。所以將用該種病人的血清對(duì)染色體著絲粒的染色直接稱為CREST 染色(CREST staining) 。CREST 染色用來(lái)區(qū)分MN來(lái)源(染色體段片還是整條染色體) ,了解誘導(dǎo)MN 的化合物性質(zhì)(斷裂劑還是整倍體劑) 。自動(dòng)化檢測(cè)法自動(dòng)化檢測(cè)法流式細(xì)胞儀檢測(cè)方法流式細(xì)胞儀檢測(cè)方法流式細(xì)胞儀(Flow cytometry) 檢測(cè)方法是20 世紀(jì)70 年代發(fā)展起來(lái)的定量測(cè)定細(xì)胞和亞細(xì)胞成份的方法。流式細(xì)胞儀是利用激光束為光源,將待測(cè)樣品進(jìn)行熒光染色,然后在液體載體里以單個(gè)細(xì)胞通過(guò)激光束,產(chǎn)生熒光信號(hào)并轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)通過(guò)儀表顯示來(lái)達(dá)到定量測(cè)定的目的。流式細(xì)胞儀檢測(cè)MN 有很多優(yōu)點(diǎn): 檢測(cè)速度至少比人工讀片快40100 倍。 減少了人為的主觀因素。1) 新型流式細(xì)胞儀具有分選功能,對(duì)判定為含MN 的細(xì)胞,可以分類(lèi)檢出并收集在玻片上或試管里,在顯微鏡下檢查驗(yàn)證,以證實(shí)其真實(shí)性并計(jì)算其可置信度。微核試驗(yàn)的應(yīng)用微核試驗(yàn)的應(yīng)用 微核試驗(yàn)廣泛應(yīng)用于藥品、食品添加劑、農(nóng)藥、化妝品、工業(yè)化學(xué)品、環(huán)境污染物等遺傳毒性的檢測(cè)、安全