流動相的調(diào)節(jié)

1、流動相的調(diào)節(jié)是搞液相分析最重要的環(huán)節(jié)， 也是液相水平高低的度量， 每一 種液相都有影響它的主要因素， 抓住主要因素， 問題就容易解決。歡迎大家討論。 一則可以為新手傳播知識，二則大家相互學(xué)習(xí)共同提高！先開個頭： 常用的是化學(xué)鍵合相色譜， 分離中性化合較簡單， 主要是調(diào)節(jié)溶 劑強(qiáng)度，可從有機(jī)相的比例合種類兩個方面入手，例如：有機(jī)相占的比例大，出 峰就早。 分離酸堿化合物就就復(fù)雜一點，增加了添加劑，明白了添加劑的 作用，然后從溶劑，酸堿性，添加劑等方面入手，問題就容易解決。液相色譜采用鍵合硅膠可以分離絕大多數(shù)的分析物質(zhì)， 針對不同化學(xué)性質(zhì)的 單體采用不同的鍵合硅膠，現(xiàn)在有什么十八烷 、氨基柱、氰基

2、、苯基太多了， 再加上不同流動相也就是加入不同的抑制劑可以測許多成分， 比如：酸性的可以 用十八烷加入酸， 加緩沖鹽； 堿性物質(zhì)可以加緩沖鹽。 以個人來講用離子對的形 式較多，并且效果也很好?，F(xiàn)在分析生物堿是比較難做的。如用反相色譜柱時， 一般先改變有機(jī)相與水相的比例；再考慮改變 pH 值，酸性物質(zhì)將 pH 值調(diào)低， 堿性物質(zhì)將 pH 值調(diào)高；如兩者都無效，可考慮加入離子對試劑，如庚烷磺酸鈉 用于（堿性藥物）一 反相 HPLC 中的溶劑優(yōu)化：1.首先應(yīng)調(diào)整k'值：強(qiáng)溶劑-20%遞減一選擇合適的溶液強(qiáng)度，使得 k'在 120（tR: 335min）。一種方法是首先試用一種可能過強(qiáng)

3、的流動相，在后面 的試驗中逐漸減小溶劑強(qiáng)度以增大 k'當(dāng)所有譜峰符合1v k'v 20的范圍時， 從溶劑強(qiáng)度的觀點來說，其流動相已接近最佳了。（觀察待分離組分的分離度 ）。（反相色譜一一溶劑極性弱洗脫能力強(qiáng)，組分k '減小）。另一種方法是首次用梯度洗脫試驗。通過這一實驗，有可能估計出使樣品的k'值符合1v k 'v 20范圍的大概溶劑成分。2.改變選擇性（Q：根據(jù)分子間作用力將溶劑分組。不同組的溶劑選擇性不同， 根據(jù)溶劑分組改變?nèi)軇┓N類即可改變選擇性。二 離子對 HPLC 中的溶劑優(yōu)化 : 離子對色譜法是分離離子，或可電離的分 子的一種色譜技術(shù)。 關(guān)于離

4、子對色譜的機(jī)理， 至今仍不十分明確， 但己提出三種 機(jī)理：離子對形成機(jī)理，離子交換機(jī)理，離子相互作用機(jī)理。在以下討論中，采 用離子對形成機(jī)理。 基本原理：有一色譜體系，固定相為非極性，如 C18 型鍵合相，流動相為水 溶液，并在其中加入一種電荷與組分離子相反的離子 B+ , B+離子由于靜電引力， 與帶負(fù)電的組分離子生成離子對， 故稱它為平衡離子或成對離子。 由于離子對具 有疏水性，因而被非極性固定相 （即有機(jī)相 ）提取。組分離子的性質(zhì)不同，它與平 衡離子形成離子對的能力大小不同， 以及離子對的極性不同， 導(dǎo)致各組分離子在 固定相中滯留的時間不同， 因而各離子先后離開色譜柱， 這就是離子對色譜

5、法的 基本原理。 以上這類色譜法稱反相離子對色譜法。 能用離子對色譜法分離的樣品 種類很多。它可以用于極性樣品，如堿類、酸類、離子、以及帶有可離解的多種 官能團(tuán)化合物的分離。 可用于生理體液的分析， 如甾族化合物以及體液中藥物的 分析。反相離子對色譜中流動相的影響小結(jié) ：1.改變選擇性：a改變?nèi)軇┓N類：改 變?nèi)軇┻x擇性的方法， 類似于鍵合相色譜所介紹的原則。 選用不同選擇性組別的 溶劑，可使流動相的選擇性得到明顯改進(jìn)。b.改變pH:組分離子與平衡離子的生 成，離子對的形成，都與流動相的 pH 值密切相關(guān)。改變流動相的 pH 可以改變 體系的選擇性。流動相的 pH 值應(yīng)調(diào)節(jié)到能使不同組分有合適的

6、離解度，而使提 供平衡離子的化合物能完全離解。 要符合這一要求， 只有使提供平衡離子的化合 物在一個很寬的 pH 范圍內(nèi)保持完全離解， 因此，只有強(qiáng)酸鹽 （高氯酸鹽或烷基磺 酸鹽）和強(qiáng)堿鹽（季銨鹽）才滿足此要求。C.系統(tǒng)選擇:使用一種有機(jī)溶劑（甲醇）；流 動相的其它三種成分為pH=2.5 , pH=7.5的緩沖液以及另一種pH=5.5、其中含有 最大濃度（例如：200mM）的離子對試劑的緩沖液（D）。以組合不一的緩沖液（B D）進(jìn)行七次實驗，并變化甲醇（A）量以保持每次實驗的k'值范圍大致恒定。三 正相 HPLC 中的溶劑優(yōu)化 溶劑非極性溶劑：正己烷或 FC-113（ 1,1,2三氟-

7、1,1,2三氯乙烷）極性溶劑：非定位、堿性定位和非堿性定位按正相 HPLC 中譜峰間距效應(yīng)分類的溶劑取代和定位是正相 HPLC 流動相選擇性的主要來源 溶劑強(qiáng)度調(diào)節(jié) 選擇性影響四、梯度洗脫梯度洗脫給色譜分離帶來很大的方使， 已成為高效液相色譜法不可缺少的部 分。所謂梯度洗脫，就是有兩種 （或兩種以上 ）不同極性的溶劑，在分離過程中按 一定程序連續(xù)地改變，以改變流動相的配比和極性。通常用的流動相為二元的。 梯度期間，強(qiáng)溶劑B（如反相HPLC中的甲醇）的濃度增大。在下述討論中，我們將這種溶劑的濃度寫作 B梯度洗脫對分離一定種類的樣品很理想。 可提高分離度、 縮短分離時間、 降 低最小檢測量和提高分

8、離精度。 梯度洗脫對于復(fù)雜混合物、 特別是保留值相差較 大的混合物的分離是極為重要的手段。因為這些樣品的k '范圍寬，不能用等度方法簡單地處置。1梯度洗脫期間的平均k'值tR=tm(1+k ' )VR=Vm(1+k ' )=Vm+kVs針對做生物堿的朋友：1. 用常規(guī)的 ODS 柱會出現(xiàn)一個最普遍的問題是：峰很寬，拖尾很嚴(yán)重 原因：ODS柱有很多未鍵合的硅羥基，與 N締合造成。解決方案：使用 BDS 柱，它是用堿鈍化殘余的硅羥基，很好的避免了拖尾 現(xiàn)象！2. 用常規(guī)的 SCX 離子交換柱會出現(xiàn)一個普遍的問題是：重現(xiàn)性差，隨流動 相的 pH 值大小， Rt 變化大

9、！原因：所謂離子交換柱， 就是陰陽正負(fù)離子的交換， 由于流動相的離子濃度 的變化，勢必會影響交換平衡！解決方案：流動相用 Buffer 緩沖液！實際上用冰醋酸、三氟乙酸、檸檬酸的也不少酸的作用就是根據(jù)pKa調(diào)節(jié)pH值，一定程度上抑制樣品組分的解離 反相色譜法分離弱酸(3< pKaW 7)或弱堿(7< pKa< 8)樣品時，通過調(diào) 節(jié)流動相的 pH 值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，并改善峰形的技術(shù)稱為反相離子抑制技術(shù)。對于弱酸，流動相的 pH 值越小，組分的 k 值越大，當(dāng) pH 值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于弱酸 的 pKa 值時，弱酸主要以分子形式存在；對弱堿，情況相反。分

10、析弱酸樣品時， 通常在流動相中加入少量弱酸， 常用磷酸 （或乙酸、三氯乙酸、 1%的甲酸、硫酸、 50mmol/L 磷酸鹽緩沖液和 1%醋酸溶液） 作用 可以抑制溶質(zhì)的離子化 ,獲對稱的 色譜峰； 分析弱堿樣品時，通常在流動相中加入少量弱堿，常用 50mmol/L 磷酸 鹽緩沖液和或 30mmol/L 三乙胺溶液。注：流動相中加入有機(jī)胺可以減弱堿性溶質(zhì)與殘余硅醇基的強(qiáng)相互作用， 減 輕或消除峰拖尾現(xiàn)象。 所以在這種情況下有機(jī)胺 （如三乙胺） 又稱為減尾劑或除 尾劑。3建立方法時，應(yīng)考慮下列事項：流動相首選甲醇 -水系統(tǒng)，應(yīng)盡可能少用含有緩沖液的流動相，如為堿性藥 物，流動相的 pH 值應(yīng)為 7

11、8；如為酸性藥物，流動相的 pH 值應(yīng)為 34。你是可以通過多種辦法測定流動相和樣品溶液的 pH 值。隨著柱填料的快速 發(fā)展，反相色譜法的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大， 現(xiàn)已應(yīng)用于某些無機(jī)樣品或易解離樣品 的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動相的 pH 值。但需 要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.57.5 （28）,太高的pH值會使 硅膠溶解，太低的 pH 值會使鍵合的烷基脫落。有報告新商品柱可在 pH 1.510 范圍操作。分離方式是按固定相的分離機(jī)理分類的， 選定了固定相 （色譜柱） 基本上就確定了分離方式。當(dāng)然，即使同一根色譜柱，如果所用流動相和其它色譜條件不 同，也可

12、能成為不同的分離方式。選擇分離方式大體上可以參照下圖:高的緩沖鹽濃度有較高的緩沖容量， 但是在有機(jī)相多的情況下容易析出，高溶解 度的鉀鹽要比鈉鹽有優(yōu)勢。一般的鉀鹽溶解度要比鈉鹽大的，但是鉀鹽要貴一點。 磷酸二氫銨嘛就是2個緩沖鹽放一起了。緩沖能力、范圍更好了，不過銨不穩(wěn)定。 這種體系的流動相不易長時間放置。最好一天一換。加緩沖鹽的目的究竟是什么，在反相液相色譜分析中，流動相的 PH值一般在2-7之間，當(dāng)被分析物在反相 條件下可離解，或樣品的PH值在2-7之外時，就需要緩沖液。在反相條件下 可離解的化合物一般都有氨基和羧基， 他們的Pka在1- 11之間，選擇正確的緩 沖液PH值可保證可離解的官

13、能團(tuán)以一種形式存在，離子形式或中性化合物的形 式。如果樣品的PH值對柱子有傷害，則緩沖溶液可使其變溫和從而減小其危害。 選擇緩沖溶液在反相液相色譜方法中對于優(yōu)化尖峰， 撿出限，以及獲得穩(wěn)定的保 留時間十分重要。PH 值一般在 2-7的范圍，還是要固定的調(diào)到某個值？ PH 值是一個固定值！1、變化 PH 值可以影響出峰保留時間2、影響方法的重現(xiàn)性3、在選擇緩沖液PH值之前，應(yīng)先了解被分析物的 Pka,高于或低于Pka兩 個PH值單位的，有助于獲得好的、尖銳的峰。溶液 PH值高于或低于Pka兩個 單位，化合物中 99以一種形式存在，而一種形式存在的化合物才能獲得好的 尖銳的峰 .因此最好是固定 P

14、H 值新買的柱子要老化一下才能用的色譜柱老化： 在開始分析工作以前， 柱子必須經(jīng)過正確的老化。 一個沒有正確老化的柱子 可能會帶來問題，諸如很差的柱效或者分離情況發(fā)生變化等等。A 在反相條件下老化要老化這類柱子， 首先要使用乙腈或者甲醇淋洗， 然后你選用的洗脫液進(jìn)行 平衡。在發(fā)貨以前， 每根柱子都已經(jīng)測試過并進(jìn)行了老化。 因此沒有必要在第一次 使用時用水沖洗。如果流動相中使用了添加物（例如緩沖液或離子對試劑） ，建 議使用正確比例的但不含此添加物的流動相進(jìn)行緩沖沖洗。 緩沖沖洗應(yīng)當(dāng)首先以 低流速進(jìn)行，最后再使用正常流速。B 在正相條件下老化柱效可能會受水與固定相的鍵合的嚴(yán)重影響。 柱子的干燥（激活