免疫組化在血液腫瘤病理診斷中的應(yīng)用及意義一

1、免疫組化在血液腫瘤病理診斷中的應(yīng)用及意義（一） IHC方法相對簡單，但從取材到發(fā)報告之間環(huán)節(jié)較多，任何環(huán)節(jié)的疏忽都可能造成檢測結(jié)果偏差，甚至導(dǎo)致漏診、誤診。除IHC染色常規(guī)注意事項外，血液腫瘤標(biāo)本的檢測還有其特殊性。1.標(biāo)本的前期處理 血液系統(tǒng)疾病病理診斷標(biāo)本，主要是淋巴結(jié)、脾臟和骨髓組織。與其它組織相似，造血細胞表面抗原不同其穩(wěn)定性會有差異，從而對固定劑的耐受性不同。 組織固定的原則， 是采用10%中性福爾馬林作為固定劑，固定時間最好不超過 24小時。 （1）淋巴結(jié)：取材后迅速固定，待組織表面變硬即可修塊。以淋巴結(jié)大小為直徑，厚度不超過3mm,以使組織得到充分的固定。如淋巴結(jié)中有淤血、壞死成

2、分，應(yīng)盡量除去。組織制片中的每個步驟都應(yīng)嚴(yán)格掌握，以免破壞組織的抗原活性。（2）脾臟：脾臟組織較大，應(yīng)注意多點取材；脾臟又 是貯血器官， 含血量多， 取材時應(yīng)盡量除去積血； 取材大小以2X2X7.5px為宜，取材后盡快固定。在多塊標(biāo)本中，病理醫(yī)師應(yīng)根據(jù)HE切片，挑由病變明顯的12塊作IHC染色。（3）骨髓組織：特點為組織小，主要為骨質(zhì)，造血細 胞充斥于骨小梁之間。在組織制片的每個步驟都應(yīng)相應(yīng)縮短時間。骨髓組織制片需要脫鈣，酸性脫鈣液對抗原活性有影 響，常規(guī)采用的2%硝酸，脫鈣不應(yīng)超過3小時。EDTA脫鈣 液偏堿性，比較溫和，效果較好，只是時間長，約需2448 小時。（4）骨髓涂片：莫些情況下當(dāng)

3、骨髓組織取材不好，如太小或組織為骨皮質(zhì)、血凝塊等不能進行石蠟包埋制片時，可用骨髓涂片代替。但注意骨髓涂片不能太厚， 最好不混血。 涂片稍干后用甲醇： 丙酮（1:1）固定90秒后染色。涂片不能在室溫下久存。（5）外周血涂片：奧些特殊情況不 能采用穿刺骨髓取材時，可用外周血涂片代替。前提是外周血有核細胞總數(shù)必須較多，結(jié)果才相對可靠，固定同骨髓涂片。（6）組織印片：當(dāng)疾病診斷和分型必需的標(biāo)記物不能 用于石蠟切片時，可用組織印片來補救。將新鮮軟組織取材后，按取材大小平放于干凈的載玻片上，輕壓，然后垂直取下標(biāo)本，組織表面的細胞印印在玻片上，風(fēng)干，固定同骨髓涂片。組織印片與冰凍切片相似，由于形態(tài)不好，除特

4、殊情況外，臨床上盡量不用。2.IHC所采用的檢測系統(tǒng) IHC染色方法很多，如免疫熒光、免疫酶標(biāo)、免疫金標(biāo)。免疫酶標(biāo)是以酶標(biāo)記的抗體與組織或細胞作用后，加入酶的底物生成有色產(chǎn)物，通過光鏡對細胞表面或細胞內(nèi)抗原進行定位。免疫酶標(biāo)以其標(biāo)記酶不同又分為標(biāo)記過氧化物酶（HRP） 法，如ABC、SP及相應(yīng)二步法；標(biāo)記堿性磷酸酶（AP）法，如SAP及相應(yīng)的二步法。葡萄糖氧化酶（GOD）分子量較大，具有較多的氨基酸，在標(biāo)記時易形成廣泛的聚合，影響酶活 性，現(xiàn)已較少使用。目前最常用的是SP、SAP及二步法。脾臟、淋巴結(jié)切片IHC染色可采用SP及相應(yīng)的二步法，DAB顯色。此法敏感性高，陽性定位準(zhǔn)，保存時間長。而骨

5、髓中的紅細胞、粒細胞、單核組織細胞含有豐富的內(nèi)源性HRP、 H2O2處理效果不理想，可造成非特異著色而影響結(jié)果的分析。故在做骨髓切片、骨髓涂片、外周血涂片染色時，我們常選擇AP標(biāo)記的SAP及相應(yīng)的二步法，核固紅或BcLP/NBT顯色。此系統(tǒng)敏感性尚好，但定位不及SP法，保存時間較 短。3.抗體的選擇 抗體的正確選擇是舊C染色的關(guān)鍵。血液系統(tǒng)腫瘤免疫分型主要用CD系列的白血病分化抗原?？紤]到患者對檢測費用的承受能力，在病理診斷中，主要采用認真而全面的HE形態(tài)學(xué)觀察提由初步診斷與鑒別診斷意見，再據(jù)此選擇適應(yīng)的抗體。這就需要病理醫(yī)師準(zhǔn)確掌握各種抗體的作用，適應(yīng)范圍和可能發(fā)生的交叉反應(yīng)。選擇抗體的原則

6、是： （1）當(dāng)造血系統(tǒng)腫瘤（主要是淋巴瘤）與其它非造血系統(tǒng)未分化小細胞腫瘤難以區(qū)分時，首先選用LCA、NSE、CK等 抗體組合，以確定腫瘤的組織來源。（2）病理診斷需作 IHC來輔助診斷與鑒別診斷時，要根據(jù)組織形態(tài)學(xué)，考慮首選的抗體與鑒別診斷的抗體，首選抗體中至少應(yīng)用兩個以上的抗體聯(lián)合檢測。鑒別診斷的抗體應(yīng)選敏感性強及廣譜的抗體。（3）抗體的敏感性、特異性有很大差別，在選擇抗體 時，要兼顧到這兩個方面。如T細胞淋巴瘤，選擇敏感性好的CD45R0與特異性強的CD3組合。同時，由于現(xiàn)有檢測抗體并非白血病細胞特異性試劑，而是針對不同人血細胞分化抗原的單抗，因此進行分型時，需要配套抗體聯(lián)合使用、綜合分

7、析、統(tǒng)一判斷。4.檢測結(jié)果的分析 IHC染色理想的結(jié)果是：陽性反應(yīng)部位明確、色澤鮮艷、背景清晰、對比度好。但由于諸如石蠟制片質(zhì)量、不同組織內(nèi)源性因素、不同廠家、不同批號抗體質(zhì)量的差異、抗原修復(fù)方式等因素的影響，染色結(jié)果并不一定理想。所以病理醫(yī)師在分析結(jié)果時，首先要分清陽性細胞是反應(yīng)性細胞，殘留細胞還是腫瘤性細胞，在確定陽性腫瘤細胞后，一般根據(jù)以下幾方面綜合分析，得由正確的診斷。 (1)陽性定位： 陽性細胞的定位是舊C診斷的重要依據(jù)。不同抗原陽性表達可分別定位于細胞膜、細胞質(zhì)、細胞核或膜/質(zhì)、核/質(zhì)等不同部位，不在特定部位表達應(yīng)視為陰性。(2)陽性強 度和陽性率： 依據(jù)歐洲EGIL免疫分型建議，

8、如果正常細胞成分在骨髓和外周血中只占極少部分時，具有莫些分化相關(guān)抗原的髓系細胞20%、淋系細胞30%則考慮白血病細胞。但也不能僅依靠陽性率的高低作為分型的唯一依據(jù)。奧一種標(biāo)記只要是瘤細胞，即使數(shù)量不多亦可作為分型依據(jù)。陽性強度 取決于細胞中抗原含量的多少，也與腫瘤細胞分化的不一致 性有關(guān)，致使陽性表達有強弱之分。（3）陽性細胞的分布： 骨髓及外周血涂片、骨髓組織切片，在多數(shù)情況下，陽性標(biāo)記瘤細胞呈彌漫性或散在性均勻分布，偶見小灶性分布，如轉(zhuǎn)移癌、淋巴瘤累及骨髓的部分類型。故陽性結(jié)果常以計數(shù)陽性率來表示。如陽性標(biāo)記細胞有形態(tài)上的異常再加以注明。而脾臟、淋巴結(jié)細胞密度大，正常情況下T、B淋 巴細胞

9、有一定的分布區(qū)域，一般B淋巴細胞占整個淋巴細胞群體的2550%,T淋巴細胞約占5075%。不同類型淋巴瘤細胞分布也不同，所以計數(shù)百分率不完全準(zhǔn)確。 確定單克隆性增生：大多數(shù)情況下，T或B陽性瘤細胞 占絕對優(yōu)勢，在正常應(yīng)該分布較少的區(qū)域也廣泛增生；有時T、B兩系均有不同程度表達，可能是由于交叉反應(yīng)或雙標(biāo)記所致，應(yīng)選擇更特異的抗體檢測；個別情況下T、B標(biāo)記 均不滿意，則以HE瘤細胞形態(tài)特點來確定類型。陽性細胞數(shù)量只是諸多判定因素之一，陽性瘤細胞的分布和形態(tài)是淋巴瘤分型的重要依據(jù),如濾泡性淋巴瘤生發(fā)中心BcL-2陽性;彌漫大B細胞淋巴瘤腫瘤性大細胞CD20陽性及生發(fā)中心BcL-6陽性； 霍奇金淋巴瘤

10、H/RS細胞CD30陽性均具有診斷意義。（書如何區(qū)別特異性與非特異性反應(yīng)： IHC染色結(jié)果有時并不理想。如何區(qū)別特異性與非特異性結(jié)果，得由科學(xué)的結(jié)論呢？一般來說，特異性反應(yīng)產(chǎn)物常 分布于特定部位，多定位于單個細胞的細胞膜、細胞質(zhì)或細胞核，且與陰性細胞相互交雜分布，由于細胞內(nèi)含抗原量不同，表現(xiàn)在同一切片上由現(xiàn)不同強度的陽性染色結(jié)果。非特異性反應(yīng)常表現(xiàn)為：無一定的分布規(guī)律，陽性不限于單個細胞，而在莫一部位成片均勻著色；細胞和周圍結(jié)締組織無區(qū)別；組織邊緣及皺折處呈現(xiàn)很強的染色。二、IHC在腫 瘤組織細胞來源鑒別中的應(yīng)用 腫瘤組織來源的鑒別僅適用于靠形態(tài)學(xué)不能確定來源的異常細胞。最常見為惡性未分化小細

11、胞腫瘤的鑒別。 波形蛋白Vimentin在很多腫瘤中都可表達，特異性較差，必要時加做肌源性標(biāo)記物如myosin、Desmin等。值得 注意的是：并不是所有血液系統(tǒng)腫瘤LCA均為陽性。樹突 狀細胞肉瘤、淋巴母細胞淋巴瘤常不表達；少數(shù)間變性大細胞淋巴瘤、NK/T細胞淋巴瘤LCA也可陰性；霍奇金淋巴瘤亦不表達。故不能因為LCA陰性而完全排除淋巴瘤的可 能。在排除了其它組織來源的基礎(chǔ)上，可考慮增加其它抗體檢測。三、IHC在血液系統(tǒng)良惡性疾病鑒別中的應(yīng)用 組織形態(tài)學(xué)診斷中最易誤診的血液系統(tǒng)良惡性疾病主 要是淋巴組織反應(yīng)性增生與惡性淋巴瘤，誤診率可高達10 30%;如淋巴濾泡反應(yīng)性增生與濾泡性淋巴瘤。利用

12、特異性 單抗IHC染色，往往能達到較理想的鑒別效果。 B淋巴細胞在分化的大多數(shù)階段存在細胞表面免疫球蛋 白（SIg） ,每個B細胞可表達一種以上Ig重鏈，但只表達一種Ig輕鏈，K或入。 正常B細胞群體分泌的Ig輕鏈K和入比例為2:1o淋巴組織反應(yīng)性增生為良性多克隆性增生，B 淋巴細胞同時表達K和入。當(dāng)淋巴組織發(fā)生腫瘤性增生時，起自單個克隆的B淋巴細胞則單一性表達K或入，兩者比例可達1:10以上。因此，Ig不僅能證實B細胞來源，而且限制性輕鏈表達又是鑒別B細胞腫瘤的重要依據(jù)之一。 但實踐中Kappa、Lambda這兩種標(biāo)記物并不理想，正常漿細胞可陽性，B細胞腫瘤有時陽性檢生率較低。因此，該標(biāo)記物

13、陰性者不能完全排除B細胞惡性淋巴瘤，應(yīng)結(jié)合其它 B細胞標(biāo)記。還有3040%的彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤不表達Ig輕鏈。 當(dāng)缺乏Ig輕鏈而全B標(biāo)記陽性時， ?？紤]腫瘤的可能。診斷確有困難時，輔以Ig重鏈（IgH）基因重排檢測，可以有助于診斷。T-淋巴瘤缺乏克隆性標(biāo)記抗 體，可選用全T細胞標(biāo)記物來鑒別。T淋巴細胞絕大部分表達CD2、CD3、CD5、CD7,同時CD4與CD8之比約15:1,極少有CD4-/CD8-或CD4+/CD8+的情況。 當(dāng)增生的T細胞CD4/CD8比例增大或縮小， 或由現(xiàn)雙陰性， 雙陽性， 或丟失一個或多個全T細胞抗原時，應(yīng)高度懷疑T細胞淋巴瘤。必要時，TCR受體基因

14、重排有助于診斷。3040%的濾泡性 淋巴瘤（FL）不表達Ig輕鏈，與淋巴濾泡反應(yīng)性增生的鑒別，主要靠BcL-2來實現(xiàn)。正常淋巴組織中。套區(qū)小B細胞，T 區(qū)大部分細胞表達BcL-2而濾泡中心細胞不表達。FL時， 腫瘤性淋巴濾泡生發(fā)中心細胞則BcL-2陽性。CD10強陽性 表達也有助于兩者的鑒別。診斷仍有困難時，BcL-2/JH融合基因重排陽性有助于FL的診斷。四、IHC在髓系腫瘤 病理診斷中的應(yīng)用 髓系白血病的免疫分型，是基于正常血細胞從多能干細胞分化、發(fā)育、成熟為功能細胞的過程中，細胞中抗原的生現(xiàn)、表達增多與減少甚至消失與血細胞的分化發(fā)育階段密切相關(guān)。 這些抗原的表達與否可作為鑒別和分類血細胞

15、的基礎(chǔ)。 白血病細胞仍能表達正常血細胞所具有的抗原，因而仍可依據(jù)其抗原的表達譜對白血病進行分型。 1.急性髓系白血病 是髓系惡性腫瘤的主要類型。目前，商品化的髓系抗體針對髓細胞分化的階段性不十分明顯， 加上一些抗體不能用于石蠟切片或效果不好，使髓系白血病免疫分型在病理學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用受到一定限制，BM石蠟包埋組織IHC染色對鑒別AML各亞型雖有一定幫助， 但目前還不能用抗體鑒別AMLMOM5各亞型，須結(jié)合其它檢查綜合分析，才能作由正確的診斷。詳見流式細胞術(shù)在血液腫瘤診斷中的應(yīng)用相關(guān)章節(jié)。2.組織細胞腫瘤 組織細胞腫瘤是軟組織中由起源于骨髓原始單核細胞轉(zhuǎn)化的巨噬細胞異常增生所形成的腫瘤，臨床上常見的幾種 類型有: 性組織細胞增生癥（惡組）： 惡組是全身性單核一巨噬細胞的惡性增生性疾病，表達CD68、Lysozyme等組織細胞標(biāo)記物。 隨著對本病細胞起源的認識， 目前認為：惡組實際上一部分是T細胞淋巴瘤，一 部分是同時表達T細胞抗原的間變性大細胞淋巴瘤，真正起 源于單核巨噬細胞系統(tǒng)是極少的， 所以，此種疾病基本上已歸入T細胞淋巴瘤的范疇。組織細胞肉瘤：瘤細胞強 表達組織細胞抗原CD68、Lysozyme,同時還表達CD11C、 CD14、CD45,而MPO、CD33常陰性。B細胞標(biāo)記和CD3也常陰性，但CD4可表達。朗格漢斯細胞