實(shí)驗(yàn)技術(shù)膠體金

1、實(shí)驗(yàn)一：TEM包埋塊的制備一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)掌握常規(guī)生物樣品前處理技術(shù)及樣品包埋塊的制備技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)材料小鼠肝臟細(xì)胞三、實(shí)驗(yàn)試劑2.5戊二醛、PBS、1鋨酸、30丙酮、100丙酮、Epon812包埋液、蠟油四、實(shí)驗(yàn)器材離心管、玻璃棒、滴管、移液槍、刀片、鑷子、牙簽、烘箱、切片機(jī)五、溶液配置1、磷酸緩沖液（Phosphate Buffer Saline, PBS）0.2molL-1 PBS 配制A液：Na2HPO4 .2H2O 35.61g 加DDW 至 1000mlB液：NaH2PO4 .H2O 27.6g 加DDW 至 1000ml2、不同pH磷酸緩沖液的配制pH 6.6 6.8 7.0 7

2、.2 7.4 7.6A液 (ml)18.8 24.5 30.5 36.0 40.5 43.5B液 (ml)31.2 25.5 19.5 14.0 9.5 6.53、Epon812包埋液的配制 Epon812樹(shù)脂 20ml DDSA 4.6ml MNA 15.3ml DMP-30 0.8ml六、實(shí)驗(yàn)步驟1、切取1mm3左右大小的組織塊，立即放入PBS（pH7.2)配制的2.5%戊二醛中固定10-15分鐘。2、用0.1molPBS緩沖液沖洗三次（每次35分鐘）。3、1鋨酸固定30分鐘，然后用緩沖液沖洗三次（每次35分鐘）。4、丙酮脫水：3050708090100100，每級(jí)35分鐘5、浸透與包埋：

3、 脫水劑：包埋劑=1：2，過(guò)夜6、第二天任意時(shí)間進(jìn)行包7、標(biāo)簽用硫酸紙內(nèi)8、聚合：45 12h 60 24h樣品標(biāo)簽學(xué)號(hào) 七、注意事項(xiàng)1、取材的時(shí)候動(dòng)作要迅速，組織離體后應(yīng)將其快速放入固定液中。并且要盡量減少損傷，減少牽拉或擠壓組織。組織塊的大小一般為1mm3。2、用固定液固定的樣品若漂浮在溶液表面，應(yīng)通過(guò)抽真空的方法讓樣品沉入溶液中。3、餓酸為劇毒、極易揮發(fā)的試劑，使用時(shí)要注意安全。4、脫水時(shí)要逐級(jí)脫水，而不能急劇脫水，更換液體時(shí)動(dòng)作要快，不要讓組織離開(kāi)溶液，否則會(huì)在組織內(nèi)外產(chǎn)生氣泡。5、在制備支持膜的時(shí)候手一定要穩(wěn)，不能抖動(dòng)，這樣制出的膜才會(huì)厚薄均一。在將載玻片浸水的時(shí)候要緩慢入水，這樣才

4、會(huì)使膜利用水的張力慢慢的離開(kāi)載玻片，漂浮在水面上。實(shí)驗(yàn)二、支持膜和膠體金的制備一、實(shí)驗(yàn)原理氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金顆粒由一個(gè)基礎(chǔ)金核（原子金Au）及包圍在外的雙離子層構(gòu)成，緊連在金核表面的是內(nèi)層負(fù)離子（AuC12），外層離子層H+則分散在膠體間溶液中，以維持膠體金游離于溶膠間的懸液狀態(tài)。膠體金標(biāo)記，實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過(guò)程。吸附機(jī)理可能是膠體金顆粒表面負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)因靜電吸附而形成牢固結(jié)合。用還原法可以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑、也

5、就是不同顏色的膠體金顆粒。免疫金標(biāo)記技術(shù)(Immunogold labelling techique) 主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標(biāo)蛋白結(jié)合處，在顯微鏡下可見(jiàn)黑褐色顆粒，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí)，肉眼可見(jiàn)紅色或粉紅色斑點(diǎn)，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測(cè)方法中，這一反應(yīng)也可以通過(guò)銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色。檸檬酸三鈉法0.01%氯金酸（HAuCl4)水溶液100ml加熱至沸騰，加4ml 1%檸檬酸三鈉水溶液，出現(xiàn)酒紅色。金顆粒大小與檸檬酸三鈉的關(guān)系檸檬酸三鈉（ml) 4 1.5 1.0 0.75金顆粒的直徑（nm) 15 30 50 60二、實(shí)驗(yàn)步驟1

6、、膠體金pH的調(diào)節(jié)：用0.1mol K2CO3調(diào)到pH9.02、取7支2ml離心管分別加入1ml膠體金3、再向每支管中加入1ml不同濃度的牛血清白蛋白4、混合均勻后分別加入0.1ml10%NaCl膠體金與標(biāo)記蛋白的配比：蛋白含量ug（牛血清白蛋白）5、混合均勻后按照下圖觀察顏色的變化6、確定出包裹膠體金蛋白的量三、注意事項(xiàng)1、配制膠體金溶液的pH以中性（pH7.2）較好。2、氯金酸的質(zhì)量要求上乘，雜質(zhì)少。最好是進(jìn)口的。3、玻璃器皿必須徹底清洗，最好是經(jīng)過(guò)硅化處理的玻璃器皿，或用第一次配制的膠體金穩(wěn)定的玻璃器皿，再用雙餾水沖洗后使用。否則影響生物大分子與金顆粒結(jié)合和活化后金顆粒的穩(wěn)定性，不能獲得

7、預(yù)期大小的金顆粒。實(shí)驗(yàn)三、制片及超薄切片演示TEM、SEM觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握透射電子顯微鏡的成像基本原理及其應(yīng)用2、掌握掃描電子顯微鏡的成像基本原理及其應(yīng)用二、實(shí)驗(yàn)原理1、透射電子顯微鏡的成像基本原理在真空條件下，電子束經(jīng)高壓加速后，穿透樣品時(shí)形成散射電子和透射電子，它們?cè)陔姶磐哥R的作用下在熒光屏上成像。2、掃描電子顯微鏡的成像基本原理利用二次電子信號(hào)成像來(lái)觀察樣品的表面形態(tài)。電子“探針”掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，探測(cè)器收集二次電子成像。三、主要電鏡制樣技術(shù)1、超薄切片技術(shù) 用于電鏡觀察的樣本制備2、負(fù)染色技術(shù) 染色背景，襯托出樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)3、冰凍蝕刻技術(shù) 冰凍斷裂與蝕刻復(fù)型：主

8、要用來(lái)觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜表面結(jié)構(gòu)。4、電鏡三維重構(gòu)技術(shù)電子顯微術(shù)、電子衍射與計(jì)算機(jī)圖象處理相結(jié)合而形成的具有重要應(yīng)用前景的一門新技術(shù)。電鏡三維重構(gòu)技術(shù)與X-射線晶體衍射技術(shù)及核磁共振分析技術(shù)相結(jié)合，是當(dāng)前結(jié)構(gòu)生物學(xué)（主要研究生物大分子空間結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系）的主要實(shí)驗(yàn)手段。四、實(shí)驗(yàn)步驟1、制刀：刀的種類：玻璃刀，鉆石刀2、玻璃刀的制作:玻璃要求:硬,含硅高（7275%),h=48mm，寬25mm、38mm，長(zhǎng)30cm；步驟：洗滌玻璃條，并晾干；制成小方塊，對(duì)角折斷；檢查刀刃； 檢查的標(biāo)準(zhǔn)：中左端平直無(wú)缺損；右端稍上翹；顯微鏡下刀刃有明亮的應(yīng)力線。 制刀的手段：手工制刀、專用制刀機(jī)制刀。觀察上面有圖可以發(fā)現(xiàn)連續(xù)的切片3、裝水槽方法： 裝塑料模具水槽； 自制膠帶水槽槽液的要求： 不與材料發(fā)生化學(xué)反應(yīng)； 干凈無(wú)雜質(zhì)； 液面與刀口基本平行； 低粘度,蒸發(fā)量??； 有一定的表面張力,有利于漂浮切片常用的槽液：雙蒸水、二甲基亞砜（DMSO）、甘油水溶液等。4、修塊 除去組織周圍多余的包埋介質(zhì)和不感興趣的部分，以提供較大的有效觀察面積。 含組織塊的區(qū)域和不含組織塊的區(qū)