實時定量PCR技術(shù)realtime PCRPPT課件

1、一、實時定量PCR技術(shù)原理1.1 技術(shù)發(fā)展史1993年，日本Higuchi 等人首次采用動態(tài)PCR方法和封閉式檢測方式對目的核酸數(shù)量進行定量分析，首次提出了熒光定量PCR技術(shù)的概念。1995年美國PE公司成功研制了TaqMan技術(shù)，1996年又推出了首臺熒光定量PCR檢測系統(tǒng)，通過檢測每個循環(huán)的熒光強度，并使用Ct值進行分析，熒光定量PCR才很快得到大家的接受，并廣為應(yīng)用。第1頁/共69頁 實時定量技術(shù)的優(yōu)勢 污染機會少：閉管化學(xué)沒有后處理：不用雜交、電泳、拍照操作簡單：高度自動化用途廣泛：既能定量又能定性靈活：既可多點測定，又可單點測定第2頁/共69頁 1.2 什么是PCR第3頁/共69頁

2、典型的PCR四階段第4頁/共69頁 PCR的理論方程第5頁/共69頁 理論上PCR是一個指數(shù)增長的過程，但是實際的PCR擴增曲線并不是標準的指數(shù)曲線，而是S形曲線。這是因為隨著PCR循環(huán)的增多，擴增規(guī)模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各種PCR要素逐漸不敷需求，PCR的效率越來越低，產(chǎn)物增長的速度就逐漸減緩。第6頁/共69頁 擴增曲線第7頁/共69頁 1.3 起點定量與終點定量第8頁/共69頁 不同的PCR反應(yīng)體系進入平臺期的時機和平臺期的高低都有很大變化，難以精確控制。所以，即使是96次PCR重復(fù)實驗，各種條件基本一致，所得結(jié)果有很大差異。 也可以看出，雖然相同模版在同一

3、臺PCR儀上進行96次擴增，終點處檢測產(chǎn)物量不恒定，但96次PCR擴增曲線都有一個共同的拐點，即熒光定量PCR中Ct值的重現(xiàn)性，恒定的Ct值為熒光定量PCR的分析提供了理論依據(jù)。第9頁/共69頁 1.4 基本概念 CT值 C代表Cycle，t代表threshold，所謂Ct值就是在熒光PCR擴增過程中，當擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)。從基線到指數(shù)增長的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。第10頁/共69頁 因為Ct值即達到熒光閾值所經(jīng)過的循環(huán)數(shù)，所以它就與模版的拷貝數(shù)存在著線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，經(jīng)過的循環(huán)數(shù)就越少，Ct值也就越小，反之亦然。正常的CT值范圍在18-30之間，過大

4、和過小都將影響實驗數(shù)據(jù)的精度。第11頁/共69頁 CT值與起始DNA濃度的關(guān)系第12頁/共69頁第13頁/共69頁閾值熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，熒光域值的缺省設(shè)置是315個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍（機器自動設(shè)置）。熒光本底信號，我們一般把熒光PCR的前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline，基線期），即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋。第14頁/共69頁第15頁/共69頁 基線調(diào)整規(guī)則 如果CT值18，不需調(diào)整，使用自動分析結(jié)果。 如果CT值2 ug，分成幾管第39頁/共69頁

5、標準品目的：生成標準曲線，建立CT值與濃度之間的數(shù)學(xué)關(guān)系不要求：數(shù)學(xué)關(guān)系是抽象的，不要求標準品與目標基因使用相同的DNA,可以使用相同的DNA,也可以使用不同的：PCR產(chǎn)物、質(zhì)粒、病毒、人工合成片段要求：5點以上濃度已知PCR效率一致，且接近100%儀器一致反應(yīng)條件一致：循環(huán)參數(shù)、同一次實驗試劑質(zhì)量一致：模板、引物和探針Tm值、酶及緩沖液第40頁/共69頁 標準品制作流程第41頁/共69頁梯度稀釋選擇目標、提取/PCR、純化、測定濃度、調(diào)整濃度、梯度稀釋CT值在18-30之間，覆蓋全部樣品濃度區(qū)間10倍連續(xù)梯度稀釋方法：1v原液(標準品i) +9v稀釋緩沖液，得標準品ii1v標準品ii+9v稀

6、釋緩沖液，得標準品iii1v標準品iii +9v稀釋緩沖液，得標準品iv1v標準品iv +9v稀釋緩沖液，得標準品v第42頁/共69頁 PCR效率對定量結(jié)果的影響第43頁/共69頁第44頁/共69頁 管家基因-IPC IPC通常選用管家基因它與目標基因在相同的PCR條件下具有相似的擴增效率 IPC的作用監(jiān)控PCR抑制物、DNA/RNA提取的損失、操作誤差等對定量數(shù)據(jù)的影響，并對以上原因造成的定量誤差進行修正。第45頁/共69頁在所有待測樣品中，內(nèi)對照(Endogenous Control)的表達量都恒定不變注意所選基因是否是組織依賴的、發(fā)育階段依賴的、或者處理方式依賴的多重定量時，內(nèi)對照的表達

7、量最好比目標基因高推薦使用Human Endogenous Control Plate (P/N 4309920)測試不同管家基因的效果常用的內(nèi)對照有18S rRNA、-actin、GAPDH等第46頁/共69頁校準熒光ROX ROX以固定的濃度配在Master Mix中ROX不參與PCR擴增，信號強度只與Mix用量有關(guān)。 校準槍的誤差（如試劑體積）、耗材質(zhì)量（如管蓋厚度、透光性能不一致）所導(dǎo)致的光能損失、儀器穩(wěn)定性（如孔間、批間溫度的波動）的誤差等減少孔間差異和批間差異，提高數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性和精度。第47頁/共69頁第48頁/共69頁 樣品重復(fù) 重復(fù)次數(shù)請遵循統(tǒng)計學(xué)的要求 小樣本統(tǒng)計，n6（n3

8、） 未知樣品和標準品都要重復(fù) 所有復(fù)管在同樣條件下完成PCR第49頁/共69頁 2.2 技術(shù)方法及數(shù)據(jù)第50頁/共69頁 絕對定量與相對定量第51頁/共69頁 絕對定量：絕對標準曲線法第52頁/共69頁 標準品拷貝數(shù)的計算 待測樣本濃度（ng/ul）OD26040稀釋倍數(shù) 樣本分子量=堿基數(shù)324 待測樣本拷貝數(shù)（copies/ul）=待測樣本濃度/樣本分子量61014第53頁/共69頁相對定量管家基因校準(Normalization Gene)得出每個細胞中的目的基因目標基因vs. 管家基因?qū)φ諛悠沸?Calibrator Sample)得出相對于某個樣品的基因表達量, 1X sample

9、.處理的vs. 未處理的，6hr vs. 0 hr, 病理vs. 正常.第54頁/共69頁示例第55頁/共69頁 對于不同的實驗需求，我們可以采用不同的方法進行實驗設(shè)計和數(shù)據(jù)分析，一般常用的方法有雙標準曲線法、Ct、2-Ct、用參照基因的Ct法和Pfaffi法，應(yīng)用每種方法都有適應(yīng)條件。第56頁/共69頁 目前相對定量普遍采用操作簡便的2-Ct分析方法第57頁/共69頁第58頁/共69頁CT法計算示例第59頁/共69頁 基于產(chǎn)物長度和G/C含量的不同，擴增產(chǎn)物會在不同的溫度點解鏈。隨著產(chǎn)物的解鏈，可以看到熒光值的降低并被儀器所測量。對溶解曲線進行微分可以計算出溶解峰。溶解峰反映了反應(yīng)中擴增到的

10、產(chǎn)物。這些峰與凝膠電泳中條帶類似。第60頁/共69頁 熔解曲線的設(shè)置是在整個PCR完成后進行，從60升至95，每升高1儀器會自動收集熒光信號，得到的熔解曲線是逐漸下降的過程，且在Tm值下降最快，為方便分析，我們將溫度與熒光強度的變化求導(dǎo)，即得到單峰的熔解曲線，這樣我們就可以證明引物的特異性良好，實驗結(jié)果不受非特異性擴增和引物二聚體的干擾。第61頁/共69頁三、實時定量PCR技術(shù)的應(yīng)用基因突變分析單基因遺傳病診斷，如血友病、地貧SNP掃描疾病相關(guān)基因鑒定，如牛皮癬、哮喘相關(guān)基因SNP的鑒定SNP檢測與臨床表現(xiàn)的相關(guān)性，如抗高血壓藥物療效的個體差異藥物副反應(yīng)的預(yù)防，如麻醉意外物種鑒定、菌株鑒定各種

11、病毒，細菌，病毒病原體檢測，如炭疽菌，E coli. O157第62頁/共69頁四、常見問題4.1無 Ct 值（信號）出現(xiàn) 1、反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠：一般都要在 35 個循環(huán)以上，可根據(jù)實驗情況增加循環(huán)，但高于45個循環(huán)會增加過多的背景信號。2、檢測熒光信號的步驟有誤：一般采用 72延伸時采集熒光，Taqman 方法則一 般在退火結(jié)束或延伸結(jié)束采集信號； 3、引物或探針降解：可通過PAGE電泳檢測其完整性。4、探針設(shè)計不佳：設(shè)計探針溫度低于引物，造成探針未雜交上而產(chǎn)物已延伸。5、模板量少：對未知嘗試的樣品應(yīng)從系列稀釋樣品的最高濃度做起。6、模板降解：避免樣品制備中雜質(zhì)的引入以及模板反復(fù)凍融的情況發(fā)生

12、。第63頁/共69頁4.2 CT值出現(xiàn)過晚1、反應(yīng)條件不佳：重新設(shè)計引物或探針，適當降低退火溫度，增加Mg離子濃度等。2、PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量不夠。3、擴增產(chǎn)物片段過長：一般采用100-200bp的擴增長度。4.3 標準曲線的線性關(guān)系不佳1、加樣誤差，標準品稀釋不呈梯度。2、標準品降解：避免反復(fù)凍融。3、引物或探針不佳，重新設(shè)計。4、模板中存在抑制物，或模板濃度過高。第64頁/共69頁4.4 陰性對照也出現(xiàn)明顯的擴增1、熒光PCR mix或水被污染。2、引物二聚體的出現(xiàn)：在35循環(huán)后陰性對照出現(xiàn)擴增屬正常情況，可配合熔解曲線進行分析。3、反應(yīng)過程中探針降解：用PAGE電泳對探針進行檢測。4.5 熔解曲線不止一個主峰1、引物設(shè)計不佳：二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)。2、引物濃度不佳。3、退火溫度過低。4、Mg離子濃度過高。5、模板中有基因組的污染。第65頁/共69頁4.6 擴增效率低1、反應(yīng)試劑中部分成分特別是染料降解。2、反應(yīng)條件不佳：降低退火溫度或三步法。3、反應(yīng)體系有抑制物：大多為模板中引入，應(yīng)先適當稀釋模板，再加入到體系中，減少抑制物的影響。4.7 重復(fù)性不好1、加樣不準確。2、儀器的溫度均一性不好。3、模板濃度低：樣品初始濃度越低，重復(fù)性越差，應(yīng)減少樣品的稀釋倍數(shù)。第66頁/共69頁