實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)realtime PCRPPT課件

1、一、實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)原理1.1 技術(shù)發(fā)展史1993年，日本Higuchi 等人首次采用動(dòng)態(tài)PCR方法和封閉式檢測(cè)方式對(duì)目的核酸數(shù)量進(jìn)行定量分析，首次提出了熒光定量PCR技術(shù)的概念。1995年美國(guó)PE公司成功研制了TaqMan技術(shù)，1996年又推出了首臺(tái)熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)，通過(guò)檢測(cè)每個(gè)循環(huán)的熒光強(qiáng)度，并使用Ct值進(jìn)行分析，熒光定量PCR才很快得到大家的接受，并廣為應(yīng)用。第1頁(yè)/共69頁(yè) 實(shí)時(shí)定量技術(shù)的優(yōu)勢(shì) 污染機(jī)會(huì)少：閉管化學(xué)沒(méi)有后處理：不用雜交、電泳、拍照操作簡(jiǎn)單：高度自動(dòng)化用途廣泛：既能定量又能定性靈活：既可多點(diǎn)測(cè)定，又可單點(diǎn)測(cè)定第2頁(yè)/共69頁(yè) 1.2 什么是PCR第3頁(yè)/共69頁(yè)

2、典型的PCR四階段第4頁(yè)/共69頁(yè) PCR的理論方程第5頁(yè)/共69頁(yè) 理論上PCR是一個(gè)指數(shù)增長(zhǎng)的過(guò)程，但是實(shí)際的PCR擴(kuò)增曲線并不是標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)曲線，而是S形曲線。這是因?yàn)殡S著PCR循環(huán)的增多，擴(kuò)增規(guī)模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各種PCR要素逐漸不敷需求，PCR的效率越來(lái)越低，產(chǎn)物增長(zhǎng)的速度就逐漸減緩。第6頁(yè)/共69頁(yè) 擴(kuò)增曲線第7頁(yè)/共69頁(yè) 1.3 起點(diǎn)定量與終點(diǎn)定量第8頁(yè)/共69頁(yè) 不同的PCR反應(yīng)體系進(jìn)入平臺(tái)期的時(shí)機(jī)和平臺(tái)期的高低都有很大變化，難以精確控制。所以，即使是96次PCR重復(fù)實(shí)驗(yàn)，各種條件基本一致，所得結(jié)果有很大差異。 也可以看出，雖然相同模版在同一

3、臺(tái)PCR儀上進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處檢測(cè)產(chǎn)物量不恒定，但96次PCR擴(kuò)增曲線都有一個(gè)共同的拐點(diǎn)，即熒光定量PCR中Ct值的重現(xiàn)性，恒定的Ct值為熒光定量PCR的分析提供了理論依據(jù)。第9頁(yè)/共69頁(yè) 1.4 基本概念 CT值 C代表Cycle，t代表threshold，所謂Ct值就是在熒光PCR擴(kuò)增過(guò)程中，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。從基線到指數(shù)增長(zhǎng)的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。第10頁(yè)/共69頁(yè) 因?yàn)镃t值即達(dá)到熒光閾值所經(jīng)過(guò)的循環(huán)數(shù)，所以它就與模版的拷貝數(shù)存在著線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，經(jīng)過(guò)的循環(huán)數(shù)就越少，Ct值也就越小，反之亦然。正常的CT值范圍在18-30之間，過(guò)大

4、和過(guò)小都將影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的精度。第11頁(yè)/共69頁(yè) CT值與起始DNA濃度的關(guān)系第12頁(yè)/共69頁(yè)第13頁(yè)/共69頁(yè)閾值熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，熒光域值的缺省設(shè)置是315個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍（機(jī)器自動(dòng)設(shè)置）。熒光本底信號(hào)，我們一般把熒光PCR的前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（baseline，基線期），即樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光值，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋。第14頁(yè)/共69頁(yè)第15頁(yè)/共69頁(yè) 基線調(diào)整規(guī)則 如果CT值18，不需調(diào)整，使用自動(dòng)分析結(jié)果。 如果CT值2 ug，分成幾管第39頁(yè)/共69頁(yè)

5、標(biāo)準(zhǔn)品目的：生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立CT值與濃度之間的數(shù)學(xué)關(guān)系不要求：數(shù)學(xué)關(guān)系是抽象的，不要求標(biāo)準(zhǔn)品與目標(biāo)基因使用相同的DNA,可以使用相同的DNA,也可以使用不同的：PCR產(chǎn)物、質(zhì)粒、病毒、人工合成片段要求：5點(diǎn)以上濃度已知PCR效率一致，且接近100%儀器一致反應(yīng)條件一致：循環(huán)參數(shù)、同一次實(shí)驗(yàn)試劑質(zhì)量一致：模板、引物和探針Tm值、酶及緩沖液第40頁(yè)/共69頁(yè) 標(biāo)準(zhǔn)品制作流程第41頁(yè)/共69頁(yè)梯度稀釋選擇目標(biāo)、提取/PCR、純化、測(cè)定濃度、調(diào)整濃度、梯度稀釋CT值在18-30之間，覆蓋全部樣品濃度區(qū)間10倍連續(xù)梯度稀釋方法：1v原液(標(biāo)準(zhǔn)品i) +9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品ii1v標(biāo)準(zhǔn)品ii+9v稀

6、釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iii1v標(biāo)準(zhǔn)品iii +9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iv1v標(biāo)準(zhǔn)品iv +9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品v第42頁(yè)/共69頁(yè) PCR效率對(duì)定量結(jié)果的影響第43頁(yè)/共69頁(yè)第44頁(yè)/共69頁(yè) 管家基因-IPC IPC通常選用管家基因它與目標(biāo)基因在相同的PCR條件下具有相似的擴(kuò)增效率 IPC的作用監(jiān)控PCR抑制物、DNA/RNA提取的損失、操作誤差等對(duì)定量數(shù)據(jù)的影響，并對(duì)以上原因造成的定量誤差進(jìn)行修正。第45頁(yè)/共69頁(yè)在所有待測(cè)樣品中，內(nèi)對(duì)照(Endogenous Control)的表達(dá)量都恒定不變注意所選基因是否是組織依賴的、發(fā)育階段依賴的、或者處理方式依賴的多重定量時(shí)，內(nèi)對(duì)照的表達(dá)

7、量最好比目標(biāo)基因高推薦使用Human Endogenous Control Plate (P/N 4309920)測(cè)試不同管家基因的效果常用的內(nèi)對(duì)照有18S rRNA、-actin、GAPDH等第46頁(yè)/共69頁(yè)校準(zhǔn)熒光ROX ROX以固定的濃度配在Master Mix中ROX不參與PCR擴(kuò)增，信號(hào)強(qiáng)度只與Mix用量有關(guān)。 校準(zhǔn)槍的誤差（如試劑體積）、耗材質(zhì)量（如管蓋厚度、透光性能不一致）所導(dǎo)致的光能損失、儀器穩(wěn)定性（如孔間、批間溫度的波動(dòng)）的誤差等減少孔間差異和批間差異，提高數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性和精度。第47頁(yè)/共69頁(yè)第48頁(yè)/共69頁(yè) 樣品重復(fù) 重復(fù)次數(shù)請(qǐng)遵循統(tǒng)計(jì)學(xué)的要求 小樣本統(tǒng)計(jì)，n6（n3

8、） 未知樣品和標(biāo)準(zhǔn)品都要重復(fù) 所有復(fù)管在同樣條件下完成PCR第49頁(yè)/共69頁(yè) 2.2 技術(shù)方法及數(shù)據(jù)第50頁(yè)/共69頁(yè) 絕對(duì)定量與相對(duì)定量第51頁(yè)/共69頁(yè) 絕對(duì)定量：絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法第52頁(yè)/共69頁(yè) 標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的計(jì)算 待測(cè)樣本濃度（ng/ul）OD26040稀釋倍數(shù) 樣本分子量=堿基數(shù)324 待測(cè)樣本拷貝數(shù)（copies/ul）=待測(cè)樣本濃度/樣本分子量61014第53頁(yè)/共69頁(yè)相對(duì)定量管家基因校準(zhǔn)(Normalization Gene)得出每個(gè)細(xì)胞中的目的基因目標(biāo)基因vs. 管家基因?qū)φ諛悠沸?zhǔn)(Calibrator Sample)得出相對(duì)于某個(gè)樣品的基因表達(dá)量, 1X sample

9、.處理的vs. 未處理的，6hr vs. 0 hr, 病理vs. 正常.第54頁(yè)/共69頁(yè)示例第55頁(yè)/共69頁(yè) 對(duì)于不同的實(shí)驗(yàn)需求，我們可以采用不同的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，一般常用的方法有雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法、Ct、2-Ct、用參照基因的Ct法和Pfaffi法，應(yīng)用每種方法都有適應(yīng)條件。第56頁(yè)/共69頁(yè) 目前相對(duì)定量普遍采用操作簡(jiǎn)便的2-Ct分析方法第57頁(yè)/共69頁(yè)第58頁(yè)/共69頁(yè)CT法計(jì)算示例第59頁(yè)/共69頁(yè) 基于產(chǎn)物長(zhǎng)度和G/C含量的不同，擴(kuò)增產(chǎn)物會(huì)在不同的溫度點(diǎn)解鏈。隨著產(chǎn)物的解鏈，可以看到熒光值的降低并被儀器所測(cè)量。對(duì)溶解曲線進(jìn)行微分可以計(jì)算出溶解峰。溶解峰反映了反應(yīng)中擴(kuò)增到的

10、產(chǎn)物。這些峰與凝膠電泳中條帶類似。第60頁(yè)/共69頁(yè) 熔解曲線的設(shè)置是在整個(gè)PCR完成后進(jìn)行，從60升至95，每升高1儀器會(huì)自動(dòng)收集熒光信號(hào)，得到的熔解曲線是逐漸下降的過(guò)程，且在Tm值下降最快，為方便分析，我們將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)，即得到單峰的熔解曲線，這樣我們就可以證明引物的特異性良好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不受非特異性擴(kuò)增和引物二聚體的干擾。第61頁(yè)/共69頁(yè)三、實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)的應(yīng)用基因突變分析單基因遺傳病診斷，如血友病、地貧SNP掃描疾病相關(guān)基因鑒定，如牛皮癬、哮喘相關(guān)基因SNP的鑒定SNP檢測(cè)與臨床表現(xiàn)的相關(guān)性，如抗高血壓藥物療效的個(gè)體差異藥物副反應(yīng)的預(yù)防，如麻醉意外物種鑒定、菌株鑒定各種

11、病毒，細(xì)菌，病毒病原體檢測(cè)，如炭疽菌，E coli. O157第62頁(yè)/共69頁(yè)四、常見(jiàn)問(wèn)題4.1無(wú) Ct 值（信號(hào)）出現(xiàn) 1、反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠：一般都要在 35 個(gè)循環(huán)以上，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況增加循環(huán)，但高于45個(gè)循環(huán)會(huì)增加過(guò)多的背景信號(hào)。2、檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤：一般采用 72延伸時(shí)采集熒光，Taqman 方法則一 般在退火結(jié)束或延伸結(jié)束采集信號(hào)； 3、引物或探針降解：可通過(guò)PAGE電泳檢測(cè)其完整性。4、探針設(shè)計(jì)不佳：設(shè)計(jì)探針溫度低于引物，造成探針未雜交上而產(chǎn)物已延伸。5、模板量少：對(duì)未知嘗試的樣品應(yīng)從系列稀釋樣品的最高濃度做起。6、模板降解：避免樣品制備中雜質(zhì)的引入以及模板反復(fù)凍融的情況發(fā)生

12、。第63頁(yè)/共69頁(yè)4.2 CT值出現(xiàn)過(guò)晚1、反應(yīng)條件不佳：重新設(shè)計(jì)引物或探針，適當(dāng)降低退火溫度，增加Mg離子濃度等。2、PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量不夠。3、擴(kuò)增產(chǎn)物片段過(guò)長(zhǎng)：一般采用100-200bp的擴(kuò)增長(zhǎng)度。4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系不佳1、加樣誤差，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋不呈梯度。2、標(biāo)準(zhǔn)品降解：避免反復(fù)凍融。3、引物或探針不佳，重新設(shè)計(jì)。4、模板中存在抑制物，或模板濃度過(guò)高。第64頁(yè)/共69頁(yè)4.4 陰性對(duì)照也出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增1、熒光PCR mix或水被污染。2、引物二聚體的出現(xiàn)：在35循環(huán)后陰性對(duì)照出現(xiàn)擴(kuò)增屬正常情況，可配合熔解曲線進(jìn)行分析。3、反應(yīng)過(guò)程中探針降解：用PAGE電泳對(duì)探針進(jìn)行檢測(cè)。4.5 熔解曲線不止一個(gè)主峰1、引物設(shè)計(jì)不佳：二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)。2、引物濃度不佳。3、退火溫度過(guò)低。4、Mg離子濃度過(guò)高。5、模板中有基因組的污染。第65頁(yè)/共69頁(yè)4.6 擴(kuò)增效率低1、反應(yīng)試劑中部分成分特別是染料降解。2、反應(yīng)條件不佳：降低退火溫度或三步法。3、反應(yīng)體系有抑制物：大多為模板中引入，應(yīng)先適當(dāng)稀釋模板，再加入到體系中，減少抑制物的影響。4.7 重復(fù)性不好1、加樣不準(zhǔn)確。2、儀器的溫度均一性不好。3、模板濃度低：樣品初始濃度越低，重復(fù)性越差，應(yīng)減少樣品的稀釋倍數(shù)。第66頁(yè)/共69頁(yè)