生物化學(xué)-本科：第一章 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能3ppt課件

1、第五節(jié)第五節(jié)蛋白質(zhì)的分別純化與構(gòu)造分析蛋白質(zhì)的分別純化與構(gòu)造分析The Separation and Purification and Structure Analysis of Protein一、透析及超濾法可去除蛋白質(zhì)溶液中的一、透析及超濾法可去除蛋白質(zhì)溶液中的小分子化合物小分子化合物運(yùn)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一運(yùn)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，到達(dá)濃縮蛋白質(zhì)溶液定截留分子量的超濾膜，到達(dá)濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。的目的。n透析透析(dialysis)n超濾法超濾法利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。物分開的方法

2、。二、丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀是常用二、丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀是常用的蛋白質(zhì)濃縮方法的蛋白質(zhì)濃縮方法運(yùn)用丙酮沉淀時(shí)，必需在運(yùn)用丙酮沉淀時(shí)，必需在04低溫下進(jìn)展，低溫下進(jìn)展，丙酮用量普通丙酮用量普通10倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白質(zhì)倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立刻分別。除了丙酮以外，被丙酮沉淀后，應(yīng)立刻分別。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。也可用乙醇沉淀。 鹽析鹽析(salt precipitation)是將硫酸銨、硫酸鈉或是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等參與蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)外表電荷氯化鈉等參與蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)外表電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。被中和以及水化膜被破壞，

3、導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。 免疫沉淀法：將某一純化蛋白質(zhì)免疫動(dòng)物可獲得免疫沉淀法：將某一純化蛋白質(zhì)免疫動(dòng)物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識(shí)別相應(yīng)的抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識(shí)別相應(yīng)的抗原蛋白，并構(gòu)成抗原抗體復(fù)合物的性質(zhì)，可從抗原蛋白，并構(gòu)成抗原抗體復(fù)合物的性質(zhì)，可從蛋白質(zhì)混合溶液中分別獲得抗原蛋白。蛋白質(zhì)混合溶液中分別獲得抗原蛋白。 三、利用荷電性質(zhì)可電泳分別蛋白質(zhì)三、利用荷電性質(zhì)可電泳分別蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)在高于或低于其蛋白質(zhì)在高于或低于其pIpI的溶液中為帶電的的溶液中為帶電的顆粒，在電場(chǎng)中能向正極或負(fù)極挪動(dòng)。這種經(jīng)過顆粒，在電場(chǎng)中能向正極或負(fù)極挪動(dòng)。這種經(jīng)過蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中泳動(dòng)而到達(dá)分別各種

4、蛋白質(zhì)的技蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中泳動(dòng)而到達(dá)分別各種蛋白質(zhì)的技術(shù)術(shù), , 稱為電泳稱為電泳(elctrophoresis) (elctrophoresis) 。根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。電泳等。 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于蛋白質(zhì)分子聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定。量的測(cè)定。等電聚焦電泳，經(jīng)過蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差別而分等電聚焦電泳，經(jīng)過蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差別而分別蛋白質(zhì)的電泳方法。別蛋白質(zhì)的電泳方法。雙向凝膠電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)研討的重要技術(shù)。雙向凝膠電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)研討的重要技術(shù)。n幾種重要的蛋白質(zhì)電泳幾種重要的蛋白質(zhì)電泳:四、運(yùn)用相分

5、配或親和原理可將蛋白質(zhì)四、運(yùn)用相分配或親和原理可將蛋白質(zhì)進(jìn)展層析分別進(jìn)展層析分別待分別蛋白質(zhì)溶液流動(dòng)相經(jīng)過一個(gè)固待分別蛋白質(zhì)溶液流動(dòng)相經(jīng)過一個(gè)固態(tài)物質(zhì)固定相時(shí)，根據(jù)溶液中待分別的蛋態(tài)物質(zhì)固定相時(shí)，根據(jù)溶液中待分別的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分別的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同別的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而到達(dá)分別蛋白質(zhì)的目的速度流經(jīng)固定相而到達(dá)分別蛋白質(zhì)的目的 。n層析層析(chromatography)分別蛋白質(zhì)的原理分別蛋白質(zhì)的原理離子交換層析：利用各蛋白質(zhì)的電荷量及離子交換層析：利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性

6、質(zhì)不同進(jìn)展分別。性質(zhì)不同進(jìn)展分別。凝膠過濾凝膠過濾(gel filtration)又稱分子篩層析，利又稱分子篩層析，利用各蛋白質(zhì)分子大小不同分別。用各蛋白質(zhì)分子大小不同分別。n蛋白質(zhì)分別常用的層析方法蛋白質(zhì)分別常用的層析方法五、利用蛋白質(zhì)顆粒沉降行為不同五、利用蛋白質(zhì)顆粒沉降行為不同可進(jìn)展超速離心分別可進(jìn)展超速離心分別 超速離心法超速離心法(ultracentrifugation)既可以既可以用來分別純化蛋白質(zhì)也可以用作測(cè)定蛋用來分別純化蛋白質(zhì)也可以用作測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量。白質(zhì)的分子量。 蛋白質(zhì)在離心場(chǎng)中的行為用沉降系數(shù)蛋白質(zhì)在離心場(chǎng)中的行為用沉降系數(shù)(sedimentation coeffi

7、cient, S)表示，沉表示，沉降系數(shù)與蛋白質(zhì)的密度和外形相關(guān)降系數(shù)與蛋白質(zhì)的密度和外形相關(guān) 。由于沉降系數(shù)由于沉降系數(shù)S大體上和分子量成正比大體上和分子量成正比關(guān)系，故可運(yùn)用超速離心法測(cè)定蛋白質(zhì)分子關(guān)系，故可運(yùn)用超速離心法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量，但對(duì)分子外形的高度不對(duì)稱的大多數(shù)纖量，但對(duì)分子外形的高度不對(duì)稱的大多數(shù)纖維狀蛋白質(zhì)不適用。維狀蛋白質(zhì)不適用。六、運(yùn)用化學(xué)或反向遺傳學(xué)方法可分析六、運(yùn)用化學(xué)或反向遺傳學(xué)方法可分析多肽鏈的氨基酸序列多肽鏈的氨基酸序列分析已純化蛋白質(zhì)的氨基酸殘基組成分析已純化蛋白質(zhì)的氨基酸殘基組成測(cè)定多肽鏈的氨基末端與羧基末端為何種氨基酸殘基測(cè)定多肽鏈的氨基末端與羧基末端為何

8、種氨基酸殘基把肽鏈水解成片段，分別進(jìn)展分析把肽鏈水解成片段，分別進(jìn)展分析測(cè)定各肽段的氨基酸陳列順序，普通采用測(cè)定各肽段的氨基酸陳列順序，普通采用Edman降解法降解法普通需用數(shù)種水解法，并分析出各肽段中的氨基酸普通需用數(shù)種水解法，并分析出各肽段中的氨基酸順序，然后經(jīng)過組合陳列對(duì)比，最終得出完好肽鏈中氨順序，然后經(jīng)過組合陳列對(duì)比，最終得出完好肽鏈中氨基酸順序的結(jié)果?；犴樞虻慕Y(jié)果。n經(jīng)過核酸來推演蛋白質(zhì)中的氨基酸序列經(jīng)過核酸來推演蛋白質(zhì)中的氨基酸序列按照三聯(lián)密碼的原那么推上演氨基酸的序列按照三聯(lián)密碼的原那么推上演氨基酸的序列分別編碼蛋白質(zhì)的基因分別編碼蛋白質(zhì)的基因測(cè)定測(cè)定DNA序列序列陳列出陳列

9、出mRNA序列序列離子交換層析分析蛋白質(zhì)的氨基酸組分離子交換層析分析蛋白質(zhì)的氨基酸組分 人血紅蛋白雙向肽圖人血紅蛋白雙向肽圖 肽的氨基酸末端測(cè)定法肽的氨基酸末端測(cè)定法 七、運(yùn)用物理學(xué)、生物信息學(xué)原理七、運(yùn)用物理學(xué)、生物信息學(xué)原理可進(jìn)展蛋白質(zhì)空間構(gòu)造測(cè)定可進(jìn)展蛋白質(zhì)空間構(gòu)造測(cè)定n二級(jí)構(gòu)造測(cè)定二級(jí)構(gòu)造測(cè)定n通常采用圓二色光譜通常采用圓二色光譜(circular dichroism，CD)測(cè)定溶液形狀下的蛋白質(zhì)二級(jí)構(gòu)造含量。測(cè)定溶液形狀下的蛋白質(zhì)二級(jí)構(gòu)造含量。 -螺旋的螺旋的CD峰有峰有222nm處的負(fù)峰、處的負(fù)峰、208nm處的負(fù)處的負(fù)峰和峰和198 nm處的正峰三個(gè)成分；而處的正峰三個(gè)成分；而-

10、折疊的折疊的CD譜不很固定。譜不很固定。 n三級(jí)構(gòu)造測(cè)定三級(jí)構(gòu)造測(cè)定nX射線衍射法射線衍射法(X-ray diffraction)和核磁共振技和核磁共振技術(shù)術(shù)(nuclear magnetic resonance, NMR)是研討蛋是研討蛋白質(zhì)三維空間構(gòu)造最準(zhǔn)確的方法。白質(zhì)三維空間構(gòu)造最準(zhǔn)確的方法。 同源模建：將待研討的序列與知構(gòu)造的同源蛋白質(zhì)同源模建：將待研討的序列與知構(gòu)造的同源蛋白質(zhì)序列對(duì)齊序列對(duì)齊補(bǔ)償氨基酸替補(bǔ)、插入和缺失補(bǔ)償氨基酸替補(bǔ)、插入和缺失經(jīng)經(jīng)過模建和能量?jī)?yōu)化計(jì)算，產(chǎn)生目的序列三維構(gòu)造。過模建和能量?jī)?yōu)化計(jì)算，產(chǎn)生目的序列三維構(gòu)造。序列類似性越高，預(yù)測(cè)的模型也越準(zhǔn)確。序列類似性越高，預(yù)測(cè)的模型也越準(zhǔn)確。折疊識(shí)別：經(jīng)過預(yù)測(cè)二級(jí)構(gòu)造、預(yù)測(cè)折疊方式和參折疊識(shí)別：經(jīng)過預(yù)測(cè)二級(jí)構(gòu)造、預(yù)測(cè)折疊方式和參考其它蛋白的空間構(gòu)造，從而產(chǎn)生目的序列的三維考其它蛋