嗜熱淀粉芽孢桿菌對白云石沉淀的影響

1、 . . . 本科畢業(yè)論文（設(shè)計）題目:嗜熱淀粉芽孢桿菌對白云石沉淀的影響姓名： 熊 鐸 班號： 011073-18 院 （系）：地球科學學院 專業(yè)： 地 質(zhì) 學 指導老師： 嶸 職稱： 副 教 授 評閱人： 王國慶 職稱： 副 教 授 2011 年 6 月本科生畢業(yè)論文（設(shè)計）原創(chuàng)性聲明本人以信譽聲明：所呈交的畢業(yè)論文（設(shè)計）是在導師指導下進行的研究工作與取得的研究成果，論文中引用他人的文獻、數(shù)據(jù)、圖件、資料均已明確標注出，論文中的結(jié)論和結(jié)果為本人獨立完成，不包含他人成果與為獲得中國地質(zhì)大學或其他教育機構(gòu)的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確

2、的說明并表示了意。 畢業(yè)論文作者（簽字）： 簽字日期： 年 月 日摘 要就目前沉積學和巖石學的研究，對于寒武紀大規(guī)模出現(xiàn)的白云巖目前還是沒有合適的解釋。學者們最新的研究認為，微生物的氧化還原反應(yīng)以與其他一些生物化學反應(yīng)，在早期成巖階段的白云石沉淀過程中能夠起到催化劑的作用。本文擬以在Mnica等人的實驗基礎(chǔ)上進行進一步的拓展，探究高溫環(huán)境下嗜熱淀粉芽孢桿菌對白云石沉淀的作用。我們在40、45、50，3個不同的溫度進行了Mg/Ca=3、Mg/Ca=5、Mg/Ca=7、Mg/Ca=8，4個不同的Mg/Ca比例下嗜熱淀粉芽孢桿菌的培養(yǎng)實驗。為了區(qū)別微生物體和微生物分泌物對白云石沉淀的影響，又分了帶菌

3、體和不帶菌體的A、B兩組。所有的實驗組都產(chǎn)生了沉淀。對沉淀物進行的XRD和SEM分析結(jié)果表示，嗜熱淀粉芽孢桿菌增加了細菌周圍的微環(huán)境中的反應(yīng)物濃度,提高了微環(huán)境中的PH，并提供了沉淀的場所，促進碳酸鹽礦物的沉淀。確認了細菌在碳酸鹽礦物的沉淀過程中并不僅僅是扮演了一個成核核心的角色。同時，對SEM結(jié)果的半定量分析得出了結(jié)論：嗜熱淀粉芽孢桿菌的新代活動對碳酸鹽礦物沉淀中Mg和Ca比例有一定的控制作用。關(guān)鍵詞：白云巖 微生物成因 Mg/Ca 嗜熱菌 ABSTRACTCurrently sedimentology and petrologic studies for the Cambrian larg

4、e-scale dolostone appear, still do not have the appropriate explanation. Scholars latest research thinks, microbial REDOX reaction and some other biological chemical reaction, in early diagenetic stage of precipitation process of dolomite can have the role of catalysts. This paper basis for experime

5、ntal Monica,etc, We do bacillus cultivation experiment in 40, 45 in 40, 50 , three different temperature and Mg/Ca = 3, Mg/Ca = 5, Mg/Ca = 7, Mg/Ca = 8,4 different Mg/Ca ratios. In order to find difference of microorganisms and microbial secretion in influence of dolomite precipitation, we set A gro

6、up with cell body and B group with out cell body. Experimental results suggest, microbial can promote carbonate mineral precipitation, and has some control function of Mg and Ca ions ratio in carbonate minerals.Key words： Dolomite，microbial factor，Mg/Ca ratio,thermophile bacteria目 錄前言1第一章研究目的與背景31.1

7、.白云巖問題的化學動力學壁障31.2.白云巖微生物成因前人的工作41.2.1.硫酸鹽還原菌（SRB）的作用41.2.2.普通需氧細菌的作用6第二章實驗方法與過程92.1實驗設(shè)計92.2實驗流程102.2.1菌種的選擇與獲取102.2.2實驗儀器與試劑122.2.3生長曲線的測定132.2.4Ca2+、Mg2+、CO32-溶液的配制142.2.5沉淀實驗15第三章實驗結(jié)果193.1.實驗過程中測得的PH和吸光度數(shù)據(jù)如下193.2.沉淀成分233.2.1XRD分析結(jié)果233.2.2SEM分析結(jié)果23第四章討論與結(jié)論334.1.嗜熱淀粉芽孢桿菌對白云石沉淀的促進作用334.2.嗜熱淀粉芽孢桿菌對碳酸

8、鹽礦物中Mg和Ca比例的控制作用334.3.實驗的不足與改進34致3535 / 42前 言前寒武的古老地層中普遍出現(xiàn)分布廣泛的大量厚層狀的白云巖。如店地區(qū)西南店、孤山口一帶大面積分布的霧迷山組（Pt2w）灰色中厚層硅質(zhì)條帶白云巖、泥質(zhì)白云巖夾褐黃色藻層泥質(zhì)白云巖；店、八角寨一帶的組（Pt3t）中-厚層結(jié)晶白云巖（圖0-1）。但目前的白云巖成因研究成果很難解釋為何有如此大量的白云巖形成。圖0-1 組上段疊層石目前公認的白云巖形成的機制有濃縮海水（薩勃哈）模式、混合水模式、和交代形成白云巖三種。1）薩勃哈模式：在高溫條氣候背景中，潮上帶表層CaCO3沉積物，因急劇蒸發(fā)而脫水，緊鄰的海水通過松散的沉

9、積物的毛細作用不斷向這里運移補充，并在這被壓縮。文石和石膏先后晶出，Ca2+被大量消耗，剩余孔隙水的Mg/Ca比增高，結(jié)果就使表層沉積物被白云石化。2此種白云巖形成模式的環(huán)境下，孔隙水平均溫度常在30以上，鹽度是正常海水的58倍，Mg/Ca常大于10，PH則在9以上。2）混合水模式：Badiozamani用實驗方法證明5%30%左右海水的海淡混合水對白云石過飽和，而對方解石不飽和，所以當這種海水作用于方解石時就會引起白云石化。2此種白云巖形成模式的環(huán)境下溫度和PH會和正常海水相近，鹽度比正常海水低。3）回流滲透白云巖化模式：潮上帶形成的高鎂粒間鹽水，再其對表層沉積物白云化的同時，由于其密度較大

10、，在重力作用下下滲回流。在下滲回流的過程中穿過下覆的灰?guī)r時，必然會發(fā)生白云巖化。184）埋藏白云巖化模式：有些古代白云巖是在深埋條件下形成的，即后生白云巖。深埋白云石化對交代水溶液Mg/Ca的要求會隨著溫度的升高而降低，如在90時只需Mg/Ca=1/4；如在190時只需Mg/Ca=1/10。深部的地下水、壓實水等帶來的Mg2+進入到深埋的灰?guī)r中，交代形成白云巖。2除上述4中模式以外，還提出了其他一些機理，例如調(diào)整白云化，玄武巖淋濾白云化，熱液白云化等。但這些模式明顯都是圍和規(guī)模比較小的，似乎都很難解釋為什么中、新元古代形成如此大規(guī)模和大面積的白云巖。廣大學者嘗試尋找一種能解釋大圍白云巖形成或者

11、白云巖化的機理模式。第一章 研究目的與背景1.1. 白云巖問題的化學動力學壁障白云巖的起源在沉積地質(zhì)學中仍然是一個長期存在的難題，主要是因為在前寒武的古老地層中普遍出現(xiàn)大量的白云巖，但在現(xiàn)代條件中卻很少出現(xiàn)。現(xiàn)代實驗室中白云石無機物的沉淀需要高溫或高壓，pH值等的特殊條件。顯然這些條件在現(xiàn)代沉積環(huán)境中并不存在。自從白云巖這個概念提出以來，人們對其成因進行了超過一個半世紀的探索。通過對現(xiàn)代白云巖和地質(zhì)歷史中白云巖的研究，得出了多種白云巖成因模式，如薩勃哈模式、鹵水回流模式、毛細管濃縮模式、混合水模式、熱液白云巖模式等。雖然這些模式能解決局部地區(qū)白云巖的成因，但是它們都存在這很大的環(huán)境局限性，無法

12、用來解釋前寒武地層中形成的大規(guī)模白云巖。就目前的研究成果來看，白云巖形成的化學反應(yīng)主要有2種：Ca2+(溶液)+Mg2+(溶液)+2CO2-3(溶液)CaMg(CO3)2(固態(tài))；（1）2CaCO3(固態(tài))+Mg2+(溶液)CaMg(CO3)2(固態(tài))+Ca2+(溶液)，（2）這兩個方程式代表白云巖形成的兩種方式。前一方程式表示白云石直接從水溶液中沉淀，可形成原生白云巖；后一方程式表示的是方解石或文石被白云石交代的過程，即白云巖化作用，形成的是成巖白云巖。式（1）為原生沉淀白云石的化學反應(yīng)式，平衡系數(shù)K=aCaMg(CO3)2/(aCa2+aMg2+(aCO32-)2)。其中ax是離子活度,固

13、體和純液體為1?，F(xiàn)代海水中Ca2+、Mg2+和CO32-的離子活度積為10-15.01，而Moore等根據(jù)孔隙水中離子活度計算的K值大約為10-16.110-16.4，比海水中實際K值小一個數(shù)量級，所以理論上現(xiàn)代海水對白云石是過飽和的。而式(2)為交代成因白云石的化學反應(yīng)式，平衡系數(shù)KaCa2+/aMg2+=0.67?，F(xiàn)代海水的Mg/Ca摩爾比為5.2，遠大于0.67，說明現(xiàn)代海水中白云石是能夠形成的7。然而無論是原生白云石還是交代白云石，在現(xiàn)代海水中卻很少沉淀，說明應(yīng)該是反應(yīng)速率的問題，即主要受化學動力學的控制。眾所周知，影響反應(yīng)速率的因素主要是反應(yīng)物的濃度、溫度和催化劑的存在?，F(xiàn)代海水環(huán)境

14、下，影響白云石沉淀的濃度因素包括以下個方面：(1)鎂離子。海水中部分Mg2+、Ca2+是以水化合物或絡(luò)合物的形式存在。水分子作為極性分子，又有氫鍵的存在，對溶液中的離子有較強的靜電引力。而Mg和Ca同屬第二主族，Mg為第三周期，Ca為第四周期，Mg2+半徑比Ca2+半徑要小。所以Mg2+與水之間的靜電引力比Ca2+與水之間和Mg2+與CO32- 之間的靜電引力都要大。因此，在常溫常壓環(huán)境中Mg2+不易進入到白云石晶格中，Mg2+的水合作用阻止了過飽和溶液中白云石的沉淀；（2）碳酸根離子?，F(xiàn)代海水中CO32-的濃度不高?，F(xiàn)代海水中HCO3- 與CO32-的濃度加起來才2.2710-3mol/L，

15、沉淀白云石所能利用的CO32-十分少，所以白云石難以沉淀。（3）硫酸根離子。溶液中Mg2+常與SO42-結(jié)合形成中性強離子對MgSO40，使得溶液中可利用的Mg2+濃度再次降低；同時MgSO40吸附到正在生長的晶體表面，進一步阻礙白云石的生長。因此前人研究認為，溶液中的SO42-是限制低溫白云石形成的主要動力學因素，即使SO42-濃度非常低，也會抑制白云石的形成。正如大多數(shù)人工合成白云石實驗所證明的那樣，在地表溫壓條件下，若沒有催化劑的存在，白云石只能在高溫下形成。71.2. 白云巖微生物成因前人的工作近20年的研究發(fā)現(xiàn)，微生物的氧化還原反應(yīng),即呼吸作用，以與微生物的其他一些生物化學反應(yīng)，在早

16、期成巖階段的白云石沉淀過程中能夠起到“催化劑” 的作用：它增加了孔隙水中的反應(yīng)物濃度，增加了細菌周圍的微環(huán)境的PH值，使得細菌周圍的微環(huán)境更適合于白云石的沉淀，或許釋放出的胞外分泌物也能夠?qū)Π自剖某恋碓斐捎绊?，同時，菌體也作為沉淀的核心為白云石的沉淀提供了場所。從而增大了白云石沉淀的反應(yīng)速率，有利于白云石的沉淀。在寒武紀生物物種大爆發(fā)之前，地球上的生物幾乎全部為微生物，海洋很可能是藻類和菌類的世界。因此如果白云巖的微生物成因模式成立，則可以很完美地解釋前寒武紀的白云巖的原生成因。1.2.1. 硫酸鹽還原菌（SRB）的作用如上文所述，溶液中Mg2+與SO42- 結(jié)合形成MgSO40，所以SO4

17、2-的存在會抑制白云石的沉淀。因此，降低溶液中的SO42-濃度顯然有利于白云石的沉淀。如深海缺氧、富含有機質(zhì)的沉積物中，普遍發(fā)生的硫酸鹽還原反應(yīng)就可以降低孔隙水中的SO42-濃度：2CH2O（碳水化合物）SO42-H2S2HCO3-這個過程需要硫酸鹽還原菌（SRB）的參與。Vasconcelos等也發(fā)現(xiàn)在硫酸鹽還原細菌（SRB）參與的實驗條件下可沉淀出鐵白云石。于是，他們提出這些厭氧微生物的調(diào)節(jié)作用可能在鐵白云石在自然環(huán)境沉淀過程中起關(guān)鍵作用。Crisgono Vasconcelos, Rolf Warthmann等人在巴西Lagoa Vermelha海岸的一個瀉湖中直接發(fā)現(xiàn)了現(xiàn)代與微生物有關(guān)

18、的含白云石的沉積，并統(tǒng)計出含白云石的沉積物中白天和夜間氧氣和硫化物含量在垂向上的變化，并對硫氧化細菌和硫還原細菌與白云石形成有關(guān)的新代進行了詳細的闡述4。他們認為這里的白云石沉積可能是在硫氧化細菌和硫還原細菌作用下形成的。之后Warthmann等進行了模擬巴西的Lagoa Vermelha瀉湖缺氧沉積環(huán)境下白云石的沉淀實驗，發(fā)現(xiàn)硫酸鹽還原細菌確實可以獲得白云石沉淀。他們將硫酸鹽還原細菌置于30C的人工配置的溶液中讓其繁殖30天，溶液中產(chǎn)生了白云石沉淀。沉淀物晶體形態(tài)與巴西Lagoa Vermelha沉積物中的白云石非常相似。實驗結(jié)果表明硫酸鹽還原細菌在低溫缺氧條件下可促使白云石沉淀。4他們認為

19、之所以微生物能夠促進白云石的沉淀，主要是因為硫酸鹽還原細菌（SRB）的活動降低了環(huán)境中的SO42-離子濃度，從而從MgSO40絡(luò)合物中釋放出更多自由的的Mg2+離子，促進白云石的沉淀。圖1-1 Crisgono Vasconcelos等人在巴西Lagoa Vermelha的沉積物（microbial mats）中發(fā)現(xiàn)的高鎂方解石掃描電鏡照片，比例尺5mm4圖1-2 Crisgono Vasconcelos等人在巴西Lagoa Vermelha測得的沉積物（microbial mats）白天和夜間氧氣和硫化物含量在垂向上的變化41.2.2. 普通需氧細菌的作用2009年Mnica Snchez-

20、Romn, Judith A. McKenzie等人在地球與行星科學快報發(fā)表一篇題為Presence of sulfate does not inhibit low-temperature dolomite precipitation的文章，在這篇文章中他們提出了一種與前人工作結(jié)果大不一樣的白云巖微生物成因的可能性3。他們認為，在類似于現(xiàn)代自然海水的環(huán)境下，微生物的作用可能使得微環(huán)境發(fā)生改變，使白云石從海水中析出。他們用兩種十分普通的嗜鹽菌與桿菌，在25與35利用瓊脂培養(yǎng)基，初始pH為7.27.4，Mg/Ca為7.5的條件下成功的得到了球狀的白云石結(jié)晶。表1-1 Mnica等人的實驗結(jié)果3圖1

21、-3. Mnica等人實驗中獲取的球狀白云石結(jié)晶3圖1-4 Mnica等人實驗中獲取的礦物結(jié)晶3，D-小的球狀礦物-白云石， HM-較大的球狀礦物-菱鎂礦，S-鳥糞石我們在Mnica等人的實驗基礎(chǔ)上進行一些改進，探索其他種類的細菌能否促進白云石的沉淀，同時調(diào)整實驗環(huán)境使之更加接近前寒武的環(huán)境。第二章 實驗方法與過程2.1 實驗設(shè)計Mnica等人的實驗中采用的是固體培養(yǎng)基，只能對白云石的沉淀進行定性的分析，同時很多參數(shù)沒有辦法控制。我們采用液體培養(yǎng)基，對實驗環(huán)境和參數(shù)進行比較精確的控制，試圖對之進行半定量的分析。實驗中所涉與的變量有溫度和Ca2+/Mg2+離子比例兩項。1)溫度設(shè)定：寒武紀以前地

22、質(zhì)和構(gòu)造運動頻發(fā)，海水溫度較更新世海水溫度高出許多，查閱資料可知，對中國南方燈影峽期地層的13C和18O同位素分析，此期海洋海水溫度為406010。因此我們需要利用嗜熱菌，但一般現(xiàn)代的嗜熱菌的生長極限溫度都不會太高，一般都在55左右，為減少獲得菌種的難度，我們把上限設(shè)定為50。綜上，我們設(shè)置3個溫度梯度：40、45、50。2)Ca2+、Mg2+離子濃度設(shè)定：Mnica等人的實驗中在Mg/Ca為7.5實驗環(huán)境下成功的生成了白云石沉淀，不妨把Mg/Ca值的上限略調(diào)高點，設(shè)為8。而現(xiàn)代海水的Mg/Ca值為5.5左右，不妨把下限調(diào)低點，設(shè)為3，綜上，我們設(shè)置4個Ca2+/Mg2+梯度。現(xiàn)代海水的Ca2

23、+濃度為11mMol/L，設(shè)定離子濃度時不改變Ca2+濃度，于是獲得各實驗組Ca2+、Mg2+離子濃度：表2-1 實驗中Ca2+、Mg2+離子濃度Mg/CacCa2+(mMol/L)cMg2+(mMol/L)3 11335 11557 11778 1188另外，為了區(qū)別細菌細胞體和細菌分泌物對白云石沉淀的影響，我們把實驗分作A、B兩組。A組沉淀過程中有細菌菌體，B組沉淀過程中有細菌菌體。2.2 實驗流程2.2.1 菌種的選擇與獲取我們首先在高校微生物資源數(shù)據(jù)庫平臺上搜尋所需的菌種，目標以嗜熱的異養(yǎng)需氧型細菌為主。我們發(fā)現(xiàn)Bacillus thermoamylovoians這株菌可以滿足我們的需

24、求。屬名：Bacillus，種名：thermoamylovoians,中文名：嗜熱淀粉芽孢桿菌，平臺編號1512C34。這株菌是由南開大學馬挺等人從油田的油田污水中分離出來的，適宜培養(yǎng)溫度為3855，需氧異養(yǎng)菌，革蘭氏陽性，總鹽度為7%時可完全抑制其生長，培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基。高校微生物資源數(shù)據(jù)庫平臺上顯示這株菌保藏在南開大學微生物資源保藏中心，在幾經(jīng)周折之下我們打聽到這株菌種保存在國強老師那里。聯(lián)系到了南開大學的國強老師之后，老師十分熱情的向我們提供了這株菌種。表2-2 嗜熱淀粉芽孢桿菌的基本信息（高校微生物資源數(shù)據(jù)庫平臺）：2.2.2 實驗儀器與試劑一、 實驗所需器具50ml離心管40個，1

25、5ml離心管50個，5ml離心管3個，10ml小燒杯30個，250ml燒杯，1L燒杯，250ml錐形瓶3個，500ml錐形瓶9個，1L錐形瓶1個，100ml容量瓶，試劑瓶，量筒，玻棒，稱量紙，100L、200L、1000L、5mL移液槍與配套槍頭若干，0.22m孔徑濾膜若干，一次性注射器若干等。二、 實驗所用主要儀器電子天平（百分之一精度），精密電子天平（萬分之一精度），pH計，紫外-可見分光光度計，高壓滅菌鍋，電熱恒溫振蕩培養(yǎng)箱，偏光顯微鏡，生物顯微鏡，Bruker D8-Focus X射線衍射儀，電子顯微鏡等。三、 實驗所需試劑胰蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(Yeast extr

26、act)、氯化鈉(NaCl)、蒸餾水（H2O）、五水氯化鎂（MgCl25H2O）、碳酸鈉（Na2CO3）、碳酸鈣（CaCO3）、濃鹽酸（HCl）、0.1mol/L稀鹽酸（HCl）、0.1mol/L稀氫氧化鈉（NaOH）等。2.2.3 生長曲線的測定微生物的生長曲線是表示微生物體生長時細胞數(shù)量增加與生長時間關(guān)系的曲線。以裂殖方式增殖的細菌，當接種到液體培養(yǎng)基中后，在適宜的生長條件下，以細菌細胞數(shù)的對數(shù)為縱坐標，生長時間為橫坐標所繪成的生長曲線，可分為四個主要部分，反映了細菌生長的四個主要階段：延遲期、對數(shù)生長期、靜止期和衰亡期。測取嗜熱淀粉芽孢桿菌的生長曲線是為了方便確定實驗中培養(yǎng)時間。因為微生

27、物的生長是一個不斷變化的過程，測得的生長曲線可以作為實驗中某一時刻菌液物化條件（如PH、CO32-離子濃度等）以與其中菌體密度的參考。由于我們是新拿到這個菌種，沒有與之相關(guān)的生長曲線的信息，我們不得不自己做實驗測定生長曲線。由于細菌懸液的濃度與吸光度（OD值）成正比，因此可利用分光光度計測定菌懸液的吸光度來推知菌液的濃度即細菌密度。在實驗中每隔2小時取樣，用TU-1800/S型紫外可見分光光度計測量菌液在600nm波長下的吸光度，用PHS-3C型Denver PH計測量菌液的PH值。最后將所測的吸光度值和PH值與其對應(yīng)的培養(yǎng)時間作圖，即可繪出該菌在一定條件下的生長曲線。實驗過程：1)一次活化：

28、取5ml離心管3只，裝入已滅菌的LB培養(yǎng)基4ml，將初步活化的菌液以1:100接種于其中兩支，作為平行，即4ml培養(yǎng)基接種40ml菌液，剩余一只作為空白對照，隔夜培養(yǎng)。2)二次活化：取250ml錐形瓶3只，裝入配好的LB培養(yǎng)基100ml，封口滅菌，將一次活化的菌液以1:1000的比例接種于其中兩個，作為平行，即100m培養(yǎng)基接種100ul菌液，剩余一只作為空白對照，隔夜培養(yǎng)。3)生長曲線與pH值的測定：取500ml錐形瓶3只，裝入配好的LB培養(yǎng)基300ml，封口滅菌，將兒次活化的菌液以1:1000的比例接種于其中兩個，作為平行。接種后立即用5ml移液槍從兩個平行和一個空白對照中各取10ml于小

29、燒杯中。用紫外分光光度計測定其吸光度，吸收波長600nm，測取兩次取平均。剩余用PH計測得PH。第一次取樣結(jié)束后將3只錐形瓶放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，設(shè)置溫度為50，轉(zhuǎn)速為250rpm。然后在之后的12小時每隔兩小時取樣并測取吸光度和PH，共取樣7次。若已達到穩(wěn)定期，則每隔12小時取樣，否則繼續(xù)每隔兩小時取樣，視細菌的生長情況而定。圖2-1 實驗測定的嗜熱淀粉芽孢桿菌生長曲線（50）實驗結(jié)果顯示：在前2個小時細菌屬于延遲期，此期中細菌體積增大，代活躍，為細菌的分裂增殖合成、儲備充足的酶、能量與中間代產(chǎn)物，因此菌液PH變化不大，在原培養(yǎng)基的PH7.0左右。之后的2小時至4小時這兩個小時，細菌處于對數(shù)

30、期，開始分裂生殖，因此細菌數(shù)目以穩(wěn)定的幾何級數(shù)極快增長；而因為細菌數(shù)目增加，呼吸作用加強放出大量的CO2，這些CO2溶于水中會使得菌液的PH略微降低。4小時之后細菌繁殖的速度減慢，開始進入穩(wěn)定期。穩(wěn)定期的細菌總數(shù)處于平坦階段，但細菌群體活力變化較大。由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)消耗、毒性產(chǎn)物積累等不利因素的影響，細菌繁殖速度漸趨下降，相對細菌死亡數(shù)開始逐漸增加，此期細菌增殖數(shù)與死亡數(shù)漸趨平衡。細菌的代產(chǎn)物尤其是產(chǎn)生的NH3等物質(zhì)的逐漸累積導致菌液PH逐漸上升。2.2.4 Ca2+、Mg2+、CO32-溶液的配制實驗過程中的Ca2+、Mg2+、CO32-以CaCl2、MgCl2和Na2CO3溶液的形式加

31、入。CaCl2溶液濃度為1Mol/L，MgCl2溶液濃度為2Mol/L，Na2CO3溶液濃度為1Mol/L。三種溶液均配制100ml。因為無水CaCl2在空氣中的吸水性很強，所以配制CaCl2溶液時選擇用CaCO3和濃HCl溶液反應(yīng)。表2-3所需稱取溶質(zhì)的質(zhì)量溶質(zhì)摩爾質(zhì)量（g/mol）物質(zhì)的量(mol)質(zhì)量（g）CaCO3100.090.110.009MgCl25H2O203.310.240.662Na2CO3105.990.110.599CaCl2溶液的配制：先用電子天平稱取純CaCO3 10.009g放在燒杯中，緩慢滴加1:1稀釋的濃鹽酸，直至溶液變澄清。用1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)P

32、H至7.0。將燒杯中的溶液轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶中，之后用少量純水潤洗3次，也轉(zhuǎn)移到容量瓶中，保證溶質(zhì)全部轉(zhuǎn)移到容量瓶中。轉(zhuǎn)移時用玻棒引流，沿著玻棒緩慢加入，玻棒下端在容量瓶刻度線以下。然后向容量瓶中加入純水，直到液面與刻度線相切。液面與刻度線即將相切時用滴管小心滴加。蓋緊瓶塞，用手指抵住瓶塞反復倒轉(zhuǎn)多次使瓶的液體混合均勻。MgCl2溶液的配制：用電子天平稱取純MgCl22H2O 26.248g置于燒杯中，加少量純水（約40ml）使之完全溶解。將燒杯中的溶液轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶中，之后用少量純水潤洗3次，也轉(zhuǎn)移到容量瓶中。之后操作與CaCl2溶液的配制一樣。Na2CO3溶液的配制與MgCl2

33、溶液的配制方法一樣，不再贅述。2.2.5 沉淀實驗實驗分為40、45、50三個溫度，每個溫度的實驗方法是一樣的，僅培養(yǎng)箱溫度設(shè)置不同，因此在此只闡述50下的實驗過程，其他溫度下的實驗過程與此一樣，不再贅述。1）液體LB培養(yǎng)基的配制LB培養(yǎng)基的配方如下:表2-4 LB培養(yǎng)基的配方成分含量胰蛋白胨(Tryptone)10g/L酵母提取物(Yeast extract)5g/L氯化鈉(NaCl)10g/L蒸餾水（H2O）1L配制LB液體培養(yǎng)基2L：取2000ml燒杯一只，用電子天平稱取胰蛋白胨20g，酵母提取物10g、氯化鈉20g，置于燒杯中。加入2L純水攪拌均勻，用0.1mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)P

34、H到7.0。取100ml裝于250ml錐形瓶做活化用，剩余分裝于3只500ml錐形瓶中，每個400ml，剩余培養(yǎng)基用裝于1L錐形瓶中。所有錐形瓶封口后用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌備用。2） 菌株活化：在無菌操作臺中接種0.5ml菌液于100ml培養(yǎng)基中（接種比例1:200）。置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中。設(shè)定溫度50、轉(zhuǎn)數(shù)250rpm，培養(yǎng)24小時。3） 接種：在無菌操作臺中分別在兩瓶400ml培養(yǎng)基中接種活化好的菌液400ml（接種比例1:1000）作為平行實驗組，標記為S-1、S-2，剩余一瓶不接種標記為Blank，做空白對照。置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中。設(shè)定溫度50、轉(zhuǎn)數(shù)250rpm。4） 分裝：培養(yǎng)48小時

35、后將菌液取出。取事先滅好菌的50ml離心管20只，從S-1和S-2的菌液中分別取8個40ml菌液分裝于16只50ml離心管中備用。從S-1、S-2和空白對照組（Blank）中分別取5個10ml菌液分裝于小燒杯中，每組5個中一個用作測菌液（空白對照）的PH和吸光度，另外四個按照實驗設(shè)計濃度添加Ca2+、Mg2+離子用以測得添加Ca2+、Mg2+離子后菌液的PH。從空白對照組中取出170ml置于已滅菌的燒杯中，加入事先配好的1mol/L Na2CO3溶液8.9474ml使溶液cCO32-=50mm/L。然后從中取4個40ml分裝于4只50ml離心管中備用。B組所有的菌液用冷凍離心機以20、6000

36、rpm離心之后取35ml上清液，用孔徑0.22mm的濾膜過濾，以除去上清液中殘余的菌體。所有分裝好的離心管按如下方式標記：以短橫線分割，短橫線前標示S1與S2兩個平行，短橫線后接Ca2+、Mg2+離子比例數(shù)值，最后標示A、B區(qū)分A、B兩組表2-5 實驗組標記方式Mg/Ca35781號平行帶菌體S1-3AS1-5AS1-7AS1-8A不帶菌體S1-3BS1-5BS1-7BS1-8B2號平行帶菌體S2-3AS2-5AS2-7AS2-8A不帶菌體S2-3BS2-5BS2-7BS2-8B空白對照組中取出的菌液按照Ca2+、Mg2+離子比例標記為：B-3、B-5、B-7、B-85） Ca2+、Mg2+離

37、子加入：若要使溶液中Ca2+、Mg2+離子濃度滿足實驗設(shè)計要求，各組各比例所需加入的1mol/L CaCl2溶液和2mol/L MgCl2溶液體積的計算如下（以40ml，Ca2+/Mg2+=3為例）：設(shè)加入的1mol/L CaCl2溶液體積為X，2mol/L MgCl2溶液體積為Y，有如下物質(zhì)的量守恒關(guān)系：c0CaCl2X=(v1+X)c1CaCl2c0MgCl2Y=(v1+Y)c1MgCl2帶入數(shù)值：1mol/LX=(4010-3L+X)1110-3mol/L1mol/LY=(4010-3L+Y)3310-3mol/L解方程組得：X=0.4524ml，Y=0.6787ml。經(jīng)計算，各組以與小

38、燒杯各比例所需加入的1mol/L CaCl2溶液和2mol/L MgCl2溶液體積如下表：表2-6 所需加入CaCl2和 MgCl2溶液體積c1CaCl2(mMol/L)c1MgCl2(mMol/L)Ca2+/Mg2+加入1mol/L CaCl2溶液體積（ml）加入2mol/L MgCl2溶液體積（ml）小燒杯中10ml菌液113330.11310.1697115550.11440.2860117770.11570.4051118880.11640.4656B組35ml上清液113330.39590.5938115550.40041.0010117770.40501.4177118880.40

39、741.6296A組、空白組40ml菌液113330.45240.6787115550.45761.1440117770.46291.6202118880.46561.8624在無菌操作臺中如上表將Ca2+Mg2+離子加入完畢之后，測取各小燒杯中菌液的PH值并記錄。6） 沉淀與其處理：將分裝完畢的20個50ml離心管放入50，250rpm的恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時，使之充分沉淀。取出離心管，用冷凍離心機以20、6000rpm離心之后取35ml上清液，用孔徑0.22mm的濾膜過濾。保留15ml上清液于15ml離心管，留樣待測。離心管中的沉淀物冷凍干燥后，離心管連同沉淀一起稱取質(zhì)量，然后將沉淀物

40、刮凈用鋁箔紙包起來。離心管洗凈烘干后再稱重。兩次質(zhì)量之差就是沉淀物產(chǎn)量。沉淀物送X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）分析。第三章 實驗結(jié)果3.1. 實驗過程中測得的PH和吸光度數(shù)據(jù)如下表3-1 接種后48小時菌液生長情況組別404550PH析光度PH析光度PH析光度Blank7.030.0616.970.06506.940.062S-18.372.22008.241.67508.491.444S-28.452.28408.241.81308.441.426隨著MgCl2和CaCl2溶液加入量的逐漸增加，PH呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。這是因為MgCl2和CaCl2都是強酸弱堿鹽，溶

41、于水后發(fā)生水解：MgCl2+2H2OMg(OH)2+2H+2CL-CaCl2+2H2OCa(OH)2+2H+2CL-使溶液呈弱酸性。MgCl2和CaCl2溶液加入量越多，酸性越強。表3-2 分裝后分別加入不同量的MgCl2、CaCl2后菌液PH情況溫度Mg/Ca404550blankS-1S-2blankS-1S-2blankS-1S-236.908.158.186.848.278.326.828.228.1856.878.118.146.788.238.266.778.218.1476.858.098.116.758.188.216.758.088.0986.848.088.026.768.

42、168.176.708.128.10表3-3 沉淀結(jié)束后，菌液PH情況 溫度Mg/Ca404550blankS-1S-2blankS-1S-2blankS-1S-2帶菌體不帶菌體帶菌體不帶菌體帶菌體不帶菌體帶菌體不帶菌體帶菌體不帶菌體帶菌體不帶菌體37.797.857.888.029.288.288.198.258.219.128.168.368.598.3257.737.887.867.899.168.138.178.189.028.158.148.408.0879.257.747.907.857.889.098.408.168.138.048.988.118.008.058.0389.25

43、7.807.927.827.839.058.288.128.118.118.908.078.148.018.34隨著MgCl2和CaCl2溶液加入量的逐漸增加，PH呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。這是因為MgCl2和CaCl2都是強酸弱堿鹽，溶于水后發(fā)生水解：MgCl2+2H2OMg(OH)2+2H+2CL-CaCl2+2H2OCa(OH)2+2H+2CL-使溶液呈弱酸性。MgCl2和CaCl2溶液加入量越多，酸性越強。實驗中所獲得沉淀物質(zhì)量數(shù)據(jù)如下表所示：表3-4 實驗組沉淀物質(zhì)量溫度組別細胞干重沉淀物A，有細胞組沉淀物B，無細胞組清洗前m1/g清洗后m2/gm/g清洗前m1/g清洗后m2/gm/g清洗

44、前m1/g清洗后m2/gm/g40S1-313.405513.32460.08113.376213.29940.07713.434613.37460.060S1-513.514713.43450.08013.488313.40870.08013.523713.45240.071S1-713.238013.2502-0.012*13.419813.33080.08913.373013.30440.069S1-813.437513.35120.08613.340413.27790.06313.420913.36250.058S2-313.497713.43280.06513.212713.1881

45、0.02513.346413.31680.030S2-513.359713.29050.06913.340913.33290.00813.318113.30660.012S2-713.396013.31450.08213.446613.42660.02013.411513.37140.040S2-813.349813.28060.06913.274713.25850.01613.375513.35280.02345S1-313.314213.29540.01913.529613.50940.02013.328813.30810.021S1-513.347213.30940.03813.3601

46、13.32780.03213.247013.24290.004S1-713.276613.27030.00616.407416.34450.06313.285613.28320.002S1-813.407413.35090.05720.172719.89400.27913.290213.28870.002S2-313.324013.30060.02313.450613.43470.01613.343713.33880.005S2-513.350913.32440.02713.317813.26690.05113.497713.47930.018S2-713.390113.37260.01813

47、.431313.36750.06413.238413.23070.008S2-813.390613.35720.03313.358713.34250.01613.351113.20500.146（下接）（續(xù)上）50S1-313.314213.29540.01913.362613.31300.05013.208513.17980.029S1-513.347213.30940.03813.319213.26660.05313.257313.23730.020S1-713.276613.27030.00613.398213.34900.04913.470113.46560.005S1-813.407

48、413.35090.05713.293113.28260.01113.430613.39310.038S2-313.324013.30060.02313.376213.31530.06113.326413.29640.030S2-513.350913.32440.02713.490813.44840.04213.325413.31520.010S2-713.390113.37260.01813.421313.35570.06613.216013.20040.016S2-813.390613.35720.03313.373813.31900.05513.280513.24160.039*因為干燥

49、過程中可能殘留部分水滴，造成測量結(jié)果誤差很大表3-5 空白組沉淀質(zhì)量溫度Mg/Ca清洗前m1/g清洗后m2/gm/g4035713.386613.27950.1071813.441913.31950.122445313.456613.39740.0592513.409813.35130.0585713.515213.40050.1147813.632713.37000.262750313.296113.19940.0967513.546913.44250.1044713.292513.19570.0968813.560413.53570.02473.2. 沉淀成分沉淀物在偏光顯微鏡下觀察。沉淀

50、物在單偏光下白色透明，沒有晶型，呈現(xiàn)棱角狀。正交偏光鏡下沉淀物不顯光性。為進一步確認沉淀物成分，對沉淀物做X射線衍射分析和掃描電鏡分析。3.2.1 XRD分析結(jié)果實驗中生成的沉淀在中國地質(zhì)大學（）材料與化學學院，利用Bruker D8-Focus X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）儀進行XRD分析。我們在對結(jié)果進行分析后發(fā)現(xiàn)沉淀物中的晶體可能是NaCl、白云石、高鎂方解石三者之一。經(jīng)估算沉淀物中NaCl的質(zhì)量應(yīng)該會在10mg左右，小于沉淀物的質(zhì)量。而沉淀物的譜峰跟其他兩種礦物的譜峰匹配度又不高，很難說明有白云石或者高鎂白云石的形成。例如：Mg/Ca=3，溫度45的實驗組1

51、號平行的菌液（無菌體）沉淀物XRD分析結(jié)果如下：圖3-1 Mg/Ca=3，451號平行B組沉淀物XRD分析結(jié)果沉淀中的晶體可能為石鹽（halite）晶體，也有可能是白云石（Dolomite）或者高鎂白云石（Huntite），應(yīng)該有少量方解石（Calcite）晶體，另外有幾個小峰很難檢出晶體。3.2.2 SEM分析結(jié)果為了進一步查明這種混相沉淀物中的其它物質(zhì)成份，我們在中國地質(zhì)大學（）地質(zhì)過程與礦產(chǎn)資源國家重點實驗室利用Quanta200型環(huán)境掃描電子顯微鏡進行了環(huán)境掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）分析。希望借助沉淀物的形態(tài)和成份反映其物質(zhì)組成。圖3-2