用攜有存活蛋白基因的重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染樹突狀細胞誘導(dǎo)細胞毒T

1、    用攜有存活蛋白基因的重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染樹突狀細胞誘導(dǎo)細胞毒T細胞抗淋巴瘤免疫效應(yīng)(1)    】 本研究探討轉(zhuǎn)染survivin(SVV)基因的樹突狀細胞(DC)體外誘導(dǎo)特異性抗淋巴瘤的免疫效應(yīng)。對人外周血DC進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，以AdSVV轉(zhuǎn)染DC，用Western blot 鑒定Survivin的表達，用乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測細胞毒性T淋巴細胞（CTL）反應(yīng)，用混合淋巴細胞反應(yīng)（MLR）測定DC刺激同種異體淋巴細胞增殖的能力，以ELISA法檢測上清中的細胞因子IL12含量。結(jié)果表明：在MLR中，刺激應(yīng)

2、答比（S/R）為15、110、150和1100時，轉(zhuǎn)染AdSVV的DC有較強刺激同種異體淋巴細胞增殖的能力；轉(zhuǎn)染AdSVV的DC組所誘發(fā)的CTL活性明顯高于對照DC組；轉(zhuǎn)染病毒后第2天，轉(zhuǎn)染AdSVV的DC組的IL12分泌水平高于對照DC組。結(jié)論：含存活蛋白基因的DC能夠在體外誘導(dǎo)特異性CTL效應(yīng)，對CA46細胞有明顯的殺傷作用。 【關(guān)鍵詞】 survivin基因 樹突狀細胞 CA46細胞系 淋巴瘤 細胞毒性T細胞 免疫治療Induction of Antilymphoma Cytotoxic T Cell Effect by Dendritic Cells Transfected with

3、Recombinant Adenovirus Vectors Carrying Survivin Gene    Abstract    This study was purposed to investigate the immunological effects of modified dendritic cells (DCs) in inducing cytotoxic T cells (CTLs) effect against lymphoma cells. The DCs were derived fro

4、m human peripheral blood and transfected with recombined adenovirus vector carrying survivin gene, Western blot was used to detect the expression of survivin, the lactate dehydrogenase (LDH) release test was used to determine the cytotoxicity of CTLs, the mixed lymphocyte reaction (MLR) was used to

5、measure the ability to proleferate allolymphocyte by DCs, ELISA was used to assay IL12 level in supernatant.    The results showed that the expression of survivin in transfected dentritic cells was confirmed by Western blot analysis. In MLR assay, DCs transfected with Adsurvivin

6、could induce higher allogeneic lymphocytes reaction at the ratios of 15,110,150 and 1100. DCs transfected with Adsurvivin had much higher activity of CTL to CA46 cells than control DCs. The levels of IL12 of supernatants containing DCs transfected with Adsurvivin were significantly higher than that

7、in the control group. It is concluded that DCs transfected with Adsurvivin can induce CTL response in vitro against lymphoma cells.    Key words    survivin gene； dendritic cell； CA46 cell line; lymphoma; cytotoxic T cell; immunotherapy    

8、樹突狀細胞(dendritic cell, DC)作為機體內(nèi)功能最強的專職抗原呈遞細胞(APC)，在激活T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵性作用，而survivin（存活蛋白，SVV）基因是腫瘤組織較為特異的基因，其編碼的蛋白survivin成為腫瘤較理想的靶抗原之一。因此，我們以重組腺病毒介導(dǎo)SVV基因修飾DC，觀察誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗淋巴瘤免疫效應(yīng)，為以DC為基礎(chǔ)腫瘤免疫治療提供實驗依據(jù)。    材料和方法    材料    表達survivin蛋白的重組腺病毒（AdSVV）由本

9、所構(gòu)建、包裝1，滴度為： AdSVV 2.65×109pfu/ml；惡性淋巴瘤細胞株CA46為本室保存株。總蛋白裂解酶、蛋白酶抑制劑為美國Pierce公司產(chǎn)品；兔抗人survivin多克隆抗體為北京中杉生物技術(shù)公司產(chǎn)品；辣根標(biāo)記山羊抗兔IgG、Westernblotting lunimol試劑（ECL）為Santa Cruz 公司產(chǎn)品。Cytotox96 NonRadioactive Cytotoxicity Assay試劑盒購自Promega公司。細胞因子IL12檢測試劑盒購自深圳晶美生物公司。    中國實驗血液學(xué)雜志 J Exp Hema

10、tol 2007; 15(3)轉(zhuǎn)染存活蛋白基因的樹突狀細胞抗淋巴瘤免疫的研究 DC的分離、培養(yǎng)和病毒感染    人外周血DC的分離和培養(yǎng)參照文獻1，收集培養(yǎng)第7天的DC，按MOI為100加入重組腺病毒，分為3組： 轉(zhuǎn)染AdSVV的DC組(AdSVV DC)、空載體轉(zhuǎn)染DC組（AdCMVDC）和未轉(zhuǎn)染DC組（NDC），并補充生長因子GMCSF、IL4（終濃度均為1 000 U/ml）。于37 5% CO2，培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48小時 (第9天)收集細胞。    Survivin蛋白表達的Western blot鑒定

11、60;   收集第9天轉(zhuǎn)染AdSVV的DC組和空載體轉(zhuǎn)染DC組的DC，進行蛋白質(zhì)抽提，SDSPAGE電泳，Western blot鑒定外源基因SVV蛋白的表達1。    同種混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)測定    取培養(yǎng)第9天的AdSVVDC和NDC，分別加入絲裂霉素C，使其終濃度為50 g/ml，在37，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)45分鐘，作為刺激細胞。分別以2×104/孔、1×104/孔、2×103/孔、1×103/孔將DC加入96孔板中，以T

12、淋巴細胞供者自身的PBMC為對照組，每組設(shè)3個復(fù)孔。每孔均加入1×105的T淋巴細胞，刺激反應(yīng)細胞之比（S/R）分別為15，110，150，和1100，終體積200 l，于37，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96小時。終止培養(yǎng)前4小時加入MTT 20 l（5 mg/ml），培養(yǎng)終止后加DMSO 200 l，充分混勻后靜置。選擇波長為570 nm處測OD570值。計算刺激指數(shù)（SI），結(jié)果以3孔的均值表示。    刺激指數(shù)（SI）=實驗孔OD均值/對照孔OD均值    CTL細胞體外殺傷活性的檢測 &

13、#160;  效應(yīng)細胞的制備 取培養(yǎng)第9天的AdSVVDC組細胞和NDC組細胞各5×105，作為刺激細胞，加入到24孔培養(yǎng)板中，按5×106/孔加入經(jīng)T細胞尼龍毛柱分離的T淋巴細胞（反應(yīng)細胞）；同時以不與DC共孵育的自體淋巴細胞為對照，每組設(shè)3個復(fù)孔。加入IL2（500 U/ml），于37、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。以后隔天半量換液，并補充IL2，繼續(xù)培養(yǎng)至第14天，作為效應(yīng)細胞。    CTL的活性測定 以1×104孔加靶細胞（CA46）到96孔板中，再分別按51、101、201（效應(yīng)細胞靶細胞）加效應(yīng)

14、細胞到各孔中，每組設(shè)3個復(fù)孔。同時設(shè)4個對照:靶細胞最大釋放組、體積校正對照組、背景對照組和自然釋放組。按Cytotox96 NonRadioactive Cytotoxicity Assay試劑盒說明書檢測CTL反應(yīng)，以對靶細胞的殺傷率表示CTL活性。            作者：朱雄鵬，陳志哲，胡建達，李純團，楊婷，許貞書【摘】本研究探討轉(zhuǎn)染survivin(SVV)基因的樹突狀細胞(DC)       

15、;  本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。    細胞殺傷率(%)= （實驗組釋放-效應(yīng)細胞自發(fā)釋放-靶細胞自發(fā)釋放）/（靶細胞最大釋放-靶細胞自發(fā)釋放）×100%    細胞因子的檢測    收集培養(yǎng)AdSVVDC以及NDC的當(dāng)天、第2天、第4天上清，按試劑盒說明書方法進行IL12含量檢測。 &#

16、160;  統(tǒng)計學(xué)處理    本實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 11.5 統(tǒng)計軟件進行方差分析。        結(jié)    果    存活蛋白的表達    經(jīng) Western blot檢測，轉(zhuǎn)染AdSVV的DC在16.5 kD處可見一陽性條帶（附圖），提示經(jīng)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC可有效表達SVV蛋白，而未轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的DC未檢出SVV蛋白表達。 

17、60;  Figure . Expression of SVV protein detected by Western blot. M: marker. Lane 1: AdCMVtransfected DC. Lane 2: AdSVVtransfected DC.    刺激同種異體淋巴細胞增殖的能力    在不同的S/R（刺激細胞/應(yīng)答細胞為15、110、150、1100）比值時，轉(zhuǎn)染AdSVV的DC與未轉(zhuǎn)染的DC比較，具有更強刺激同種異體淋巴細胞增殖的能力（P<0.01）。

18、0;   CTL殺傷活性的檢測    在效靶比（E/T）為51、101和201時，轉(zhuǎn)染AdSVV的DC（AdSVVDC）所誘發(fā)的CTL活性均值分別為23.48、38.24和46.76%，未轉(zhuǎn)染的DC（NDC組）誘發(fā)的CTL活性為7.32%、8.83%、14.72%，兩組間的CTL活性有顯著性差異（P<0.05）。對照組在E/T為51、101和201時未檢測到CTL活性。    細胞因子的檢測    在轉(zhuǎn)染病毒后第2天、第4天，AdSVVDC

19、組和NDC組的IL12分泌水平分別為50.7±3.2 pg/ml和56.4±2.7 pg/ml及36.5±1.8 pg/ml和42.3±2.6 pg/ml。AdSVVDC組的IL12分泌水平高于NDC（P<0.05）。對照組上清中未能檢測到IL12。    討    論    非霍奇金淋巴瘤（NHL）的發(fā)病率及死亡率均有上升趨勢，傳統(tǒng)治療難以徹底消滅腫瘤細胞，因此如何進一步提高療效并最終根治本病，已成為目前研究的熱點和難點。近年來

20、，對樹突狀細胞在腫瘤抗原呈遞和腫瘤免疫中重作用的揭示, 開拓了腫瘤免疫治療的又一新領(lǐng)域。腫瘤疫苗即腫瘤的特異性主動免疫治療，近年來取得了可喜進展，其中尤以DC疫苗的進展最為矚目2,3。    Survivin基因是一個抗凋亡基因,它在大多數(shù)腫瘤組織中表達，而在正常成人組織中不表達。業(yè)已證明，HL60、K562、CA46、U266等血液腫瘤細胞系均高表達survivin4，5。因此，應(yīng)用靶向survivin的免疫治療有望成為一種重的抗腫瘤療法。Schemitz 等6將自身DC與可溶性重組survivin共培育，誘導(dǎo)出survivin特異性的CD8 CTL，

21、首次證實了survivin可作為一種潛在應(yīng)用價值的腫瘤疫苗抗原。    本實驗用重組腺病毒介導(dǎo)SVV基因轉(zhuǎn)染DC，通過檢測證實DC能夠表達SVV抗原蛋白，轉(zhuǎn)染后成熟DC仍具有較強刺激同種異體T淋巴細胞增殖和分泌細胞因子的能力。此研究結(jié)果說明Ad能夠高效介導(dǎo)目的基因感染DC，重組腺病毒不影響DC的成熟及其功能，是目前基因治療研究中較為理想的載體。    在研究靶細胞毒性實驗中，我們應(yīng)用CytoTox 96 非放射試劑盒測量乳酸脫氫酶（LDH）在細胞裂解后的釋放量，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染survivin基因的DC在體外能誘導(dǎo)特異性CTL，殺傷淋巴瘤細胞。這提示用重組腺病毒載體介導(dǎo)survivin基因的DC疫苗可能是抗淋巴瘤治療中有效的方法?！緟⒖嘉墨I】1朱雄鵬，陳志哲，林旭等. 存活蛋白重組腺病毒載體的構(gòu)建及其在樹突狀細胞的表達. 中國實驗血液學(xué)雜志，2006； 14：791-7942Steinman RM, Cohn ZA. Identification of a novel cell type