western-blot條帶分析及解決方法

1、westernwestern- -blotblot 條帶分析及解決 方法 現(xiàn)象 原因 解決 反影（白色條帶，黑色背景） 1 1HRPHRP 過高（背景較高） 至少成倍稀釋一抗/二抗 （可 4 4- -1010 倍）*注 1 1 顯影后膜上條帶處變?yōu)辄S色 2 2HRPHRP 過高（敏感性太高） 至少成倍稀釋一抗/二抗 （可 4 4- -1010 倍）*注 2 2 信號(hào)弱或無 3 3HRPHRP 過高引起底物迅速耗竭 至少成倍稀釋一抗/二抗 （可 4 4- -1010 倍）*注 3 3 4 4 抗體- -抗原系統(tǒng)敏感性過低 提高抗體濃度/蛋白上樣量 *注 4 4 5 5 轉(zhuǎn)膜不充分/過轉(zhuǎn) 優(yōu)化轉(zhuǎn)膜

2、條件*注 5 5 6 6HRPHRP 或底物活性降低 測試活性或選用敏感底物 *注 6 6 高背景 7 7HRPHRP 過高（背景較高） 至少成倍稀釋一抗/二抗 （可 4 4- -1010 倍）*注 7 7 8 8 封閉時(shí)間不足 延長封閉時(shí)間 4 4 度過夜最 好*注 8 8 9 9 抗體與封閉液有父叉 更換封閉液（如 3%BSA3%BSA 的 TBSTTBST）* *注 9 9 1010TBSTTBST 洗脫不足 增加洗脫時(shí)間、次數(shù)、用量 *注 1010 1111 暴光時(shí)間過長 降低暴光時(shí)間*注 1111 1212 抗原-抗體濃度過高 降低抗體濃度或蛋白上樣 量*注 1212 條帶內(nèi)無顯影的

3、白點(diǎn) 1313 轉(zhuǎn)膜不良（如有氣泡在膠-膜之間） 精細(xì)操作*注 1313 1414 膜平衡不均/油脂污染 按說明書平衡膜/戴手套用 平頭鑲子持膜*注 1414 1515 膜與 X X 光片間有氣泡 顯影前去除氣泡*注 1515 非特異性條帶 1616 抗體交叉反應(yīng) 至少成倍稀釋一抗/二抗 （可 4 4- -1010 倍）*注 1616 1717SDSSDS 非特異性結(jié)合蛋白條帶 使用無 SDSSDS 轉(zhuǎn)膜液*注 1717 散在小圓斑 1818 封閉液有雜質(zhì)顆粒 靜置牛奶使大顆粒沉淀， 僅用上層*注 1818 *注 1 1 其具體問題有二：一是背景較高，二是沒有條帶.形成機(jī)制為條帶處 HRPHR

4、P 很快將底物耗竭，則不發(fā)光不使膠片感光而為白色，周圍因背景 HRPHRP 較低而持續(xù)發(fā)光一段時(shí)間使膠片感光為黑色。這種常見于高濃度抗體并且封閉/ / 洗脫不好的情況下。如果沒有背景則就是原因 3 3 的現(xiàn)象。在暗室可以看到條帶周圍熒光而條帶 處 為 暗 。 如 是 則 要 么 通 過 降 低 抗 體 解 決 ， 要 么 動(dòng) 作 迅速早期未耗竭底物時(shí)壓片，否則一旦耗竭通過減少壓片時(shí)間不能解決問題。也可以過一段時(shí)間鼻兀 RPRP 稍減后重加底物迅速壓片。還有另外一種反影現(xiàn)象就是壓出條帶粗大模糊，但條帶中心是空的白色，原因和上面的一樣，主要是條帶中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的熒光帶，但

5、與上面的區(qū)別主要在于特異性要好一些，若繼續(xù)發(fā)展則就是原因 3 3 的 現(xiàn)象。其分析和解決同上。 *注 2 2 其原因主要是 HRPHRP 太高超速催化底物生成的產(chǎn)物使膜發(fā)黃，壓出的片子可以是正常的或和原因 1 1 或原因 3 3 的現(xiàn)象同時(shí)存在，只是一種現(xiàn)象，在壓過的膜可以看出來（只在加底物后一段時(shí)間出現(xiàn)，幾小時(shí)后可能還會(huì)消退，有時(shí)甚至剛加底物 12min12min 就可以看出來，所以要把握時(shí)機(jī)）。如果沒有達(dá)到原因 1 1 和原因 3 3 的程度，那么這種情況一定能夠看到很強(qiáng)的熒光，是一種良好的狀態(tài)，是我們所期盼的。如果壓出正常片子而不出現(xiàn)原因 1 1 和原因 3 3 的現(xiàn)象，可以不予處理。但

6、因?yàn)闊晒馓珡?qiáng)極易導(dǎo)致條帶增粗變大，所以也可以不稀釋抗體而通過調(diào)整壓片時(shí)間來解決，一般壓 10s30s10s30s, , 甚至可以 335s5s, ,即時(shí)根據(jù)結(jié)果在暗室調(diào)整，熒光持續(xù)時(shí)間長的話都可連續(xù)壓十?dāng)?shù)張片子而效果良好。但也有這種情況，就是由于 HRPHRP 過強(qiáng)無論怎 么減少壓片時(shí)間條帶都依然粗大（如果時(shí)間過短如3s3s 則可因感光不足導(dǎo)致條帶太淡，這樣就不可取了，但依然是粗大的、非條帶的本來面目）， 那么如果想獲得漂亮條帶則必須通過降低抗體濃度（減少上樣量很不穩(wěn)定且能力有限，故很少使用）來解決。原因 1 1 和 3 3 若如是則解決也是一樣的。 *注 3 3 這是與 1 1 類似但抗體特

7、異性較好時(shí)的一種表現(xiàn)，經(jīng)常與下面的原因 4 4、5 5、 6 6 混淆，特別需要注意。主要出現(xiàn)在 HRPHRP 極高的情況下，來不及壓片就已耗竭底物，往往伴有原因 2 2 的現(xiàn)象。可通過加入底物后迅速進(jìn)入暗室 觀察熒光確定，也可以根據(jù)原因 2 2 的現(xiàn)象確定，以區(qū)分于原因 4 4、5 5、6 6 除非動(dòng)作迅速早期未耗竭底物時(shí)壓片，否則一旦耗竭通過減少壓片時(shí)間不能解決問題。也可以過一段時(shí)間待 HRPHRP 稍減后 TBSTTBST 簡單洗膜重新加底物壓片。這種情況下一/二抗稀釋可高達(dá) 1010 倍而依然熒光明顯。 * 注 4 4 提高抗體上樣量以及下述的使用敏感底物/ /延長壓片時(shí)間比較簡單，在

8、此不贅述，只提醒一下隨抗體濃度增高背景和非特異性可能會(huì)增加。關(guān)于上樣 量的極限在此發(fā)表我的看法：對(duì)于裂解的混合蛋白以上樣孔底面積（平方 毫米）乘 30ug30ug 作為極限上樣量，而落實(shí)到每一個(gè)具體條帶（同一分子量的所有蛋白或僅做單一蛋白電泳），則以 0.3ug/0.3ug/平方毫米底面積作為極限上樣量。（見抗體技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南的免疫印跡一章），超過此量可能會(huì)導(dǎo)致條帶變形。條帶信號(hào)弱可以通過加大上樣量/提高抗體濃度/使用敏感底物/延長壓片時(shí)間解決。但實(shí)際上樣量的極限并不以我說的極限上樣量為 準(zhǔn)，因?yàn)檫@個(gè)極限上樣量是確保所有分子量的條帶都跑的很漂亮的極限, , 而上樣超量的表現(xiàn)是隨量的加大變形的條帶

9、由低分子量逐漸往高分子量延伸。所以westernwestern極限上樣量的真正操作標(biāo)準(zhǔn)是以目的條帶不變形作為極限。 比如對(duì)于150kd150kd, ,完全可以超出我所說的極限上樣量的 2 2 倍而 不變形（此時(shí)中低分子量條帶早已融合或擠為棒槌形了） * 注 5 5 對(duì)于非小分子量尤其是大分子量（100kd100kd）蛋白而言，一般不會(huì)出現(xiàn)過轉(zhuǎn)情況，轉(zhuǎn)膜不充分是主要原因，增加轉(zhuǎn)膜力度無非是加大電壓/電流，延 長時(shí)間。但對(duì)于小分子蛋白（30kd30kd 就要注意了，15kd15kd 尤其要當(dāng)心）很可能出現(xiàn)過轉(zhuǎn)，麗春紅染膜或觀察 markermarker 有沒有穿膜可以確認(rèn)，沒有麗春紅也可以考染轉(zhuǎn)膜

10、后的膠，如果是一片空白，則要小心了，可適當(dāng)降低轉(zhuǎn)膜力度。對(duì)于低分子量一般轉(zhuǎn)膜液不要加 SDSSDS 以防過轉(zhuǎn)，抗體技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南提供的針對(duì)中低分子量的濕轉(zhuǎn)緩與高分子量的相比也是不含 SDSSDS 的。 * 注 6 6 測試 HRPHRP 或底物活性：于暗室 EPEP 管加底物 A A、B B 液各 500ul500ul，加入 1ulHRP1ulHRP 偶聯(lián)二抗，若底物立即發(fā)出藍(lán)光并于隨后數(shù)分鐘內(nèi)消失說明 HRPHRP 和底物 尚好。此外試劑公司還開發(fā)一些超級(jí)底物，其敏感度可達(dá)到 pgpg 級(jí)，但價(jià) 格昂貴，對(duì)某些表達(dá)較低的蛋白效果會(huì)好些，而且也超級(jí)省抗體（其推薦抗體稀釋比高達(dá) 1:10,0001

11、:10,000 以上）。我用的是敏感度為 ngng 級(jí)的底物，大部分 westernwestern 都還可以，pgpg 級(jí)的還放在手里，沒舍得用。 * 注 7 7 高背景原因是因?yàn)?HRPHRP 偶聯(lián)二抗結(jié)合到膜上，其原因包過直接結(jié)合、通過膜上蛋白間接結(jié)合、通過一抗（主要指多抗中的雜抗體）間接結(jié)合、通過封閉物（與封閉物交叉反應(yīng)）間接結(jié)合、洗脫不徹底等原因造成的。在稀釋抗體降低背景的同時(shí)也會(huì)降低對(duì)目的蛋白的結(jié)合效率，意即以犧牲信號(hào) 強(qiáng)度為代價(jià)。不過在此提出另外一種和稀釋抗體恰相反的做法一一提高抗體濃度。這種辦法適用于 HRPHRP 結(jié)合到膜上較多而且底物相對(duì)極其敏感（如 pgpg 級(jí)底物，因極其

12、敏感可把結(jié)合到膜上的極其微量抗體產(chǎn)生的背景也顯示出來， 而這種背景在 ngng 級(jí)底物即使壓片過夜也沒有顯示），無論如何稀釋抗體和加強(qiáng)洗膜都不能消除背景或者條帶和背景隨稀釋呈等比例遞減甚至條帶遞減速度比背景還快，如果稀釋抗體則壓片時(shí)間需延長而背景反而因此更加明顯。這種情況下認(rèn)為需要提高抗體含量以提高條帶顯示程度，而背景隨抗體濃度提高并不加強(qiáng)的很厲害，如是則可以通過減少壓片時(shí)間而達(dá)到突出條帶降低背景的目的（我最近帶一個(gè)研究生使用 pgpg 級(jí)超級(jí)底物時(shí)發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象并使用此方法解決背景高的難題，當(dāng)時(shí)一抗稀釋為原 來的 4 4 倍，二抗稀釋為原來的 1010 倍，即總稀釋為原來的 4040 倍仍然可以

13、看到背景的熒光但條帶的熒光卻減了許多導(dǎo)致條帶和背景都無法區(qū)分了，后來回復(fù)原來濃度并稍微延長孵育時(shí)間則條帶熒光明顯蓋過背景并減少 壓片時(shí)間至 5s5s 解決）。 * 注 8 8 這一點(diǎn)似乎多數(shù)人都不重視，所以有時(shí)候會(huì)有些意外。我一般室溫 2 24h4h, , 但 4 4 度過夜確實(shí)是最好的。另外在平皿中搖似乎比封口膜更容易掌握并獲得較好的效果，對(duì)新手似乎更好。 * 注 9 9 實(shí)際上牛奶對(duì)于多數(shù)抗體來說還是很好的，但所有二抗也都寫著：與牛奶可能有交叉反應(yīng)。BSABSA 蛋白單一，可降低因牛奶其他成分引起的背景。單用 TBSTTBST 也可以，此法雖然減少了交叉，但單就封閉能力而言卻也因此而降低

14、* 注 1010 一般 10min*310min*3 次就足夠了，如果不放心可按自己意志加強(qiáng)時(shí)間、次數(shù)、洗脫液用量。 * 注 1111 以犧牲敏感度為代價(jià)其最低標(biāo)準(zhǔn)是使目的條帶能夠正常顯影，對(duì)一切原因 有效，但效果局限。 * 注 1212 以犧牲敏感度為代價(jià)其最低標(biāo)準(zhǔn)是使目的條帶能夠正常顯影，僅對(duì)膜上蛋 白和一抗引起的有效。 * 注 1313 主要是氣泡在膠- -膜之間引起的絕緣區(qū)使蛋白無法通過而不能到達(dá)膜上， 這一步在操作時(shí)尤其要小心，我自己犯過，也看到其他人犯過。我的辦法是把膠鋪到膜上，先使其一邊接觸膜的一邊，這樣就會(huì)在膠和膜交界的地方形成一個(gè)水相前緣，然后慢慢落下凝膠，這樣這個(gè)水相前緣就

15、會(huì)逐漸推進(jìn)直至膠膜重合，如是則不會(huì)有氣泡產(chǎn)生。把膠鋪到膜上而非相反是因?yàn)槟z是透明的，可以看到水相前緣以及有無氣泡產(chǎn)生。 * 注 1414 膜平衡不均或有油脂污染的表現(xiàn)是膜上有疏水的通明色和蛋白幾無（麗春 紅染），這點(diǎn)并不多見。 * 注 1515 這一點(diǎn)我是抄 piercepierce 的說明書的，我沒遇到過，膜與 X X 光片間有氣泡也不影響熒光通過，這個(gè)我可以肯定。似乎不透明的東西才會(huì)導(dǎo)致。 * 注 1616 非特異性條帶在普通多抗比較多見，純化多抗會(huì)好的多，但單抗也不是絕對(duì)沒有，我也遇到過。關(guān)于 weternwetern 的抗體選擇在此提出我的觀點(diǎn)：最理想的是混合單抗，其次是純化多抗，單抗

16、和多抗各有局限和特點(diǎn)，根據(jù)個(gè)人對(duì)特異性需求和蛋白的穩(wěn)定性而定?？紤]的參數(shù)主要是抗原表位和特異性兩個(gè)因素，不包含每個(gè)抗體價(jià)格?；旌蠁慰闺m然針對(duì)多個(gè)表位但代價(jià)太高，需購置多個(gè)單抗然后混合，很少有人這么做。純化多抗基本具有混合多抗的性質(zhì)和優(yōu)點(diǎn)，表位多，穩(wěn)定性好，特異性也不差，我覺得是實(shí)際中的首選。單抗雖然特異性好，但如果其針對(duì)的表位在提取蛋白時(shí)被破壞則其敏感度為會(huì)下降甚至為 0,0,故不穩(wěn)定。 普通多抗雖然表位多， 但因含其他抗體，特異性差了好多，會(huì)有很多雜帶乃至背景。實(shí)際我做的抗體多數(shù)都是普通多抗，只要封閉的好，效果還是很不錯(cuò)的；單抗雖說不穩(wěn)定，但實(shí)際中我都能做出來，尤其是內(nèi)參，強(qiáng)烈推薦只選單抗。

17、 * 注 1717 此點(diǎn)我根本不知道，完全是拷貝 piercepierce 說明書的 * 注 1818 主要原因是牛奶里面會(huì)有一些不懸浮的大顆粒，這些東西對(duì)封閉無益。我所有的牛奶全是配好后在 4 4 度靜置（最好放在尖底的管子內(nèi)），這樣那些大顆粒就會(huì)沉淀到底部，吸取時(shí)不要擔(dān)心牛奶不均而特意混勻，我只吸上面的，下面的顆粒則不要取。如是則在也沒有遇到這種現(xiàn)象。不推薦過濾 牛奶，因?yàn)楹臅r(shí)極長且得率極低。我用過幾次但后來廢棄了這種做法注 1 1 另外一種反影現(xiàn)象就是壓出條帶粗大模糊，但條帶中心是空的白色 DXY.C 注 2 2 但因?yàn)闊晒馓珡?qiáng)極易導(dǎo)致條帶增粗變大 注 7 7 高背景 注 1616 非特

18、異性條帶 注 1818 散在小圓斑 因?yàn)榉忾]不充分，這 3 3 者很容易聯(lián)合出現(xiàn)，下面是一張典型圖，3 3 者均含 注 1616 非特異性條帶 下面是一張非特異性較高的圖，雖有背景但相對(duì)較低 注 1313主要是氣泡在膠-膜之間引起的絕緣區(qū)使蛋白無法通過而不能到達(dá)膜上 氣泡主要是中間一條帶的上緣的半圓形缺失.我實(shí)際的片子上可以隱約看出是一個(gè)圓形的氣泡，周圍一圈還有個(gè)很形象的邊界 再提供一個(gè)如何在 westernwestern 顯影圖上判斷蛋白降解的例子. . 如下圖，與最右邊一條帶相比，左邊 3 3 條帶顯影分子量散落下移（不能有上移，因分子量變?。?，拖拉一片，即為降解。在考染膠上判斷有無降解一是大分子量是否完全，二是背景是否清晰，三是小分子量區(qū)是否模