基于納米復(fù)合物的適體與免疫傳感器的制備與表征

1、. . . . 本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）題 目基于納米復(fù)合物的適體與免疫傳 感器的制備與表征學(xué) 院 _化學(xué)化工學(xué)院_ _專 業(yè) _ 化學(xué)（師） _年 級(jí) _2008級(jí)_學(xué) 號(hào) 1227姓 名 _ 康_指 導(dǎo) 教 師 _ 許文菊_ 成 績 _良_2012年 4月9日目 錄摘要1關(guān)鍵詞1Abstract1Key words11 引言11.1 基于新穎的氧化石墨烯納米復(fù)合材料非標(biāo)記免疫傳感器21.2 論文研究背景22 實(shí)驗(yàn)部分32.1 儀器與試劑32.2 凝血酶適體傳感器32.3 免疫傳感器的制備和表征52.3.1 免疫傳感器的制備52.3.2 免疫傳感器的電化學(xué)測量63 結(jié)果與討論63.1 凝血酶適體

2、傳感器的特性63.2 免疫傳感器的特性73.2.1 銀氧化石墨烯納米復(fù)合材料的特性73.2.2 電化學(xué)免疫傳感器的特性73.2.3 孵育時(shí)間優(yōu)化83.2.4 免疫傳感器的循環(huán)伏安響應(yīng)和校準(zhǔn)曲線93.2.5 免疫傳感器的選擇性、再現(xiàn)性和穩(wěn)定性104 結(jié)論10參考文獻(xiàn)1112 / 14基于納米復(fù)合物的適體與免疫傳感器的制備與表征康西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, , 400715摘要：本文主要報(bào)道了基于氧化石墨烯與Hemin以與納米Ag形成的納米復(fù)合物的凝血酶適體傳感器以與非標(biāo)記免疫傳感器。通過對各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，制備的以銀-氧化石墨烯復(fù)合物修飾的非標(biāo)記免疫傳感器能較好地利用于甲胎蛋白（AFP）的電化學(xué)檢

3、測。該傳感器具有較為快速靈敏和檢測圍較寬的特點(diǎn)。關(guān)鍵詞：適體傳感器；免疫傳感器；納米復(fù)合材料；甲胎蛋白The preparation and characterization of aptamer and immunosensor based on nanocompositesLI KangSchool of Chemistry and Chemical Engineering, SouthwestChinaUniversity, Chongqing 400715, ChinaAbstract:In this paper, thrombin aptasensor and label-free

4、immunosensor based on hemin-graphene oxide and silver- graphene oxide, respectively, was reported. Under the optimal detection condition, label-free immunosensor based on silver- graphene oxide was more suitable for electrochemical determination of -1-fetoprotein (AFP). The proposed sensor exhibited

5、 unique properties such as a rapid speed and wide linear range when used to detect AFP.Keywords:aptasensor; immunosensor; nanocomposite; -1-fetoprotein 1引言適體（aptamer）是用配體指數(shù)富集法系統(tǒng)演化（SELEX）技術(shù)從人工體外合成的隨機(jī)寡核苷酸序列庫中反復(fù)篩選得到的能以極高的親和力和特異性與靶分子結(jié)合的一段寡核苷酸序列。通過SELEX技術(shù)篩選得到的適體不僅具有類似抗體對目標(biāo)分子高親和力和高特異性，分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、易合成和可進(jìn)行連接性

6、修飾等優(yōu)點(diǎn)，而且具有反應(yīng)速度快、可反復(fù)使用和長期保存等優(yōu)點(diǎn)1。與抗體相比，適體作為生物傳感器的敏感元件具有一定的優(yōu)勢，適體的出現(xiàn)為生物分析方法和傳感器的設(shè)計(jì)開辟了新思路2。電化學(xué)傳感器具有選擇性好、靈敏度高、響應(yīng)時(shí)間快、操作簡單、價(jià)格低廉等等許多優(yōu)點(diǎn)，再與適體的高特異性和選擇性結(jié)合后，受到了研究者的廣泛關(guān)注3。國外有很多人員和小組都在此領(lǐng)域展開了創(chuàng)新性的工作4。適體電化學(xué)傳感器根據(jù)是否標(biāo)記可分為標(biāo)記型和非標(biāo)記型，都是通過檢測電極表面電活性識(shí)別元素的電信號(hào)達(dá)到識(shí)別和鑒定靶物質(zhì)的目的。免疫傳感器是基于抗體和抗原能夠發(fā)生特異性結(jié)合形成穩(wěn)定的免疫復(fù)合物，并將特異性免疫反應(yīng)與高靈敏的傳感技術(shù)結(jié)合起來，用

7、以檢測抗體和抗原反應(yīng)的生物傳感器。目前的研究領(lǐng)域廣泛存在于臨床診斷，環(huán)境分析，藥物分析和食品安全等諸多方面，免疫傳感器相對于其他分析儀器具有分析速度快、靈敏度高、選擇性高、操作簡便與成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，具有很廣闊的發(fā)展前景。由于產(chǎn)生的信號(hào)不同，免疫傳感器可分為質(zhì)量檢測免疫傳感器、熱量檢測免疫傳感器、光學(xué)免疫傳感器和電化學(xué)免疫傳感器4種類型。電化學(xué)免疫傳感器是免疫傳感器中研究得最多、最早并且最成熟的一個(gè)種類，具有選擇性好、靈敏度高、檢測速度快，成本低等優(yōu)點(diǎn)。我們通過循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn)測定實(shí)驗(yàn)中不同時(shí)間點(diǎn)的峰電流值來檢測待測物的量。根據(jù)檢測信號(hào)的產(chǎn)生來源是否自來標(biāo)記物，電化學(xué)免疫傳感器又可以分為無標(biāo)記型（直

8、接測定）和標(biāo)記型（間接測定）兩種類型5。1.1 基于新穎的氧化石墨烯納米復(fù)合材料非標(biāo)記免疫傳感器石墨烯是一個(gè)二維碳板，由于它的在特性已成為材料科學(xué)領(lǐng)域一顆璀璨的新星，如高導(dǎo)電性、表面積大、機(jī)械強(qiáng)度大和良好的生物相容性?；谶@些優(yōu)點(diǎn)，石墨烯納米復(fù)合材料極吸引了研究人員的注意力，因此，近些年來用于發(fā)展電化學(xué)生物傳感器。然而，在水溶液石墨烯的不可逆聚集限制它的實(shí)際應(yīng)用。氧化石墨烯，一種石墨烯的衍生物，基底平面與邊緣含有大量含氧基團(tuán)，使氧化石墨烯獲得了親水性，形成穩(wěn)定均勻的氧化石墨烯懸浮液。而且，氧化石墨烯中含氧團(tuán)體的一部分可以作為對接極性和無機(jī)納米粒子的錨。合起來，氧化石墨烯是石墨烯復(fù)合材料最好的基

9、底。近些年，又由于用不同的納米粒子填裝氧化石墨烯納米片的研究有很大進(jìn)展，比如三氧化二鐵、鉛、氧化鋅和金等等。其中，存儲(chǔ)在氧化石墨烯上納米片的金屬納米粒子由于良好的電導(dǎo)率和化學(xué)穩(wěn)定性吸引了研究人員的關(guān)注。銀納米粒子不僅具有上述優(yōu)點(diǎn)而且它獨(dú)特的產(chǎn)品具有較高的催化活性和表面增強(qiáng)拉曼散射。針對這些優(yōu)異的性能，銀納米粒子被廣泛應(yīng)用于電化學(xué)傳感器和生物傳感器等6。1.2 論文研究背景在這個(gè)人民生活水平日益增長的年代，健康已成為一個(gè)不容忽視的社會(huì)問題。凝血酶適用于結(jié)扎止血困難的小血管、毛細(xì)血管以與實(shí)質(zhì)性臟器出血的止血。用于外傷、手術(shù)、口腔、耳鼻喉、泌尿、燒傷、骨科、等出血的止血。凝血酶能使纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成纖

10、維蛋白。局部應(yīng)用后作用于病灶表面的血液很快形成穩(wěn)定的凝血塊，用于控制毛細(xì)血管、靜脈出血，或作為皮膚、組織移植物的黏合、固定劑。當(dāng)藥品中凝血酶的含量在標(biāo)示量的80%以上時(shí)，才是有效的，因此測定凝血酶的含量是很關(guān)鍵的。可將凝血酶與適體傳感器結(jié)合，通過測定電信號(hào)的強(qiáng)度而知凝血酶的含量。肝細(xì)胞癌是一個(gè)與肝臟有關(guān)聯(lián)的癌癥，是世界上癌癥死亡最普遍的原因和致命的惡性腫瘤。然而,據(jù)報(bào)道,AFP在肝細(xì)胞癌患者的血清中含量較高，但是在健康人血清中的含量可相對忽略。所以AFP可作為診斷和預(yù)測處于早期階段肝細(xì)胞癌的一個(gè)指標(biāo)?；趭A心型免疫傳感器的一些策略，如電化學(xué)和發(fā)光化學(xué)免疫分析法，還有酶連接免疫吸附測定，都可應(yīng)用

11、于AFP的測定。但是，二次抗體的制備在這些方法中出現(xiàn)了一些問題，比如說，耗時(shí)間、操作復(fù)雜和高費(fèi)用。與上述夾心型免疫傳感器相比，非標(biāo)記免疫傳感器，就顯得簡單，而且容易操作，成本低。尤其是，沒有必要合成二次抗體。2實(shí)驗(yàn)部分2.1儀器與試劑CHI660C電化學(xué)工作站（辰華儀器公司），BRANSONIC 200 超聲清洗儀(德國BRANSON ULTRASCHALL 公司)，CS 501-SP 型超級(jí)數(shù)顯恒溫器(四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器廠)，三電極體系。凝血酶、氯鉑酸、氯金酸均購于 Sigma 公司(美國)，氨基凝血酶適體互補(bǔ)鏈，氨基凝血酶適體鏈，HRP，氨基化二氧化硅，Hemin，PBS緩沖液(NaCl 137

12、 mmolL1，KCl 2.7 mmolL1，Na2HPO4 10 mmolL1，KH2PO4 2 mmolL1)，0.5%戊二醛、葡萄糖，牛血清蛋白（96-99 %），硝酸銀，氧化石墨烯，磷酸鹽緩沖液。實(shí)驗(yàn)用水均為二次去離子水。2.2凝血酶適體傳感器首先合成二次抗體，取0.8 mL氨基化二氧化硅，離心取下層，加入pH=7.0的PBS緩沖液稀釋至1 mL，加入500 L 0.5%戊二醛離心攪拌20 min后取其下層，用1 mL PBS洗滌一次后取下層用1 mL PBS緩沖液稀釋，去0.5 mL溶液加入10 L 100 M氨基凝血酶適體鏈，其余保持放置于冰箱中，將混合物離心攪拌20 min后傾去

13、多余的戊二醛，滴入少量PBS緩沖液分散，即可得到所需的二次抗體。凝血酶適體傳感器的構(gòu)建過程如圖1所示，先用0.05的氧化鋁粉末打磨裸金電極，在放置超聲儀中清洗，清洗完畢后取出晾干待用。首先，在預(yù)處理好的裸金電極表面滴6 L Hemin/GO，然后晾干形成Hemin/GO修飾的金電極。再將該電極插入濃度為2 ngmL-1的鉑金酸溶液中，在電壓為-0.2 V的條件下進(jìn)行電沉積，電極表面得到一層納米鉑膜。接著，將20 L氨基凝血酶適體互補(bǔ)鏈AptamerI通過巰基與Pt的作用固載到電極表面，室溫下放置16 h得到AptamerI/Pt/Hemin/GO修飾的金電極。然后AptamerII(20 L)

14、 通過與AptamerI的堿基互補(bǔ)配對被組裝到電極表面，之后用10 L 2 mg·mL-1 HRP滴涂于電極表面進(jìn)行封閉，冰箱放置6 h，即制得目標(biāo)適體傳感器。電極在不使用時(shí)放于4 的冰箱中保存。圖 1 凝血酶適體傳感器的組裝過程示意圖Fig. 1 The assembling process ofthrombinaptasensor循環(huán)伏安法是測定修飾電極性質(zhì)的一種常用的有效方法，實(shí)驗(yàn)測量以目標(biāo)電極為工作電極，鉑絲電極為對電極，飽和甘汞電極作為參比電極。本文中的循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn)是在室溫下pH=7.0 的0.1 molmL-1 PBS緩沖液里，-0.60 V （對飽和甘汞電極）電位區(qū)間，

15、掃速為 0.1 Vs-1 條件下進(jìn)行的。如圖2所示，Hemin/GO修飾的金電極展現(xiàn)出一對明顯的氧化還原峰(曲線B), Pt層的形成使得峰電流突然變大(曲線C)，而當(dāng)AptamerI、AptamerII相繼被組裝到電極上時(shí)，峰電流逐步減小(曲線D、曲線E)，此外封閉劑HRP的作用使得峰電流幾乎沒有變化(曲線F)，這說明兩條適體鏈靠非特異性吸附作用而結(jié)合在一起的可能性很小，最后，當(dāng)目標(biāo)適體傳感器孵育0.5 nmol·L-1凝血酶之后，峰電流反而下降了(曲線G)。這種測定方法是根據(jù)適體鏈與靶物質(zhì)結(jié)合前后改變了電子傳輸阻礙力的大小，進(jìn)而引起電流值的變化來對靶物質(zhì)進(jìn)行定量分析的，因?yàn)楫?dāng)靶物質(zhì)

16、與適體鏈的結(jié)合使得適體鏈從電極表面脫落下來，減小了電子傳輸過程中的阻力，進(jìn)而使電流值增加。當(dāng)傳感器在靶物質(zhì)中放置一段時(shí)間過后，其峰電流值將增大，且變化值會(huì)隨著靶物質(zhì)濃度的增加而增大。圖2 凝血酶適體傳感器表征曲線Fig.2CVs of modified thrombin aptasensor2.3免疫傳感器的制備和表征2.3.1免疫傳感器的制備在氧化石墨烯基質(zhì)上原位還原二銨合銀離子制得了銀-氧化石墨烯納米復(fù)合物。將 0.5 g葡萄糖加人到10 mL 1 mg·mL-1氧化石墨烯中溫和攪拌分散。然后，將氨水和氫氧化銀合成的新鮮的氫氧化二氨合銀溶液混合加入到上述溶液中。攪拌幾分鐘后，混合

17、溶液持續(xù)靜置1.5 h。最后，離心、洗滌凈化合成的懸浮液。合成的銀-氧化石墨烯納米復(fù)合物分散在0.4 %萘酚的酒精溶液中。用0.3 和0.05µm的氧化鋁粉末依次磨光4 mm的金電極，然后，在乙醇和雙重蒸餾水中先后用超聲波洗滌，作為化學(xué)修飾電極，裸露的金電極使用前在空氣中晾干。首先，將分散在萘酚酒精溶液中的銀-氧化石墨烯懸浮液取出4L滴入到裸的金電極表面以形成銀-氧化石墨烯修飾的金電極。其次，為了有效地捕獲抗體，將上述修飾電極浸入2 mL 1 %的氯金酸中-0.2 V恒電勢沉積15 s，則金納米粒子被裝載到銀-氧化石墨烯修飾的電極上，同時(shí)金納米粒子還可防止氧化還原活性物質(zhì)泄漏。隨后，

18、金納米粒子/銀-氧化石墨烯修飾的電極層沉浸在AFP抗體溶液中12 h，保持4 ºC。最后，0.25 wt.% BSA作為封閉劑，在30 min消除非特異性結(jié)合。免疫傳感器的制備過程示意圖見圖3。圖3 免疫傳感器的組裝過程Fig.3The assembling process of immunosensor2.3.2免疫傳感器的電化學(xué)測量通過三電極體系的CHI 660C電化學(xué)工作站進(jìn)行電化學(xué)測量，以飽和甘汞電極作對比從-0.08V 到 0.26V以50 mV·s-1的速率在pH=7.4的磷酸鹽緩沖中進(jìn)行電位掃描，直到得到一個(gè)穩(wěn)定的信號(hào)。所有的電極測試實(shí)驗(yàn)都在室溫下進(jìn)行。3結(jié)果

19、與討論3.1凝血酶適體傳感器的特性圖2展示了凝血酶適體傳感器逐步修飾的CV曲線圖，在電極上沉積鉑之后，曲線上出現(xiàn)了一個(gè)明顯的氧化還原電流峰，但在之后的每次修飾后峰電流值會(huì)減小，直到孵育凝血酶之后，峰電流值會(huì)再次增大，說明凝血酶適體傳感器對凝血酶的識(shí)別使峰電流值增強(qiáng)。3.2免疫傳感器的特性3.2.1銀氧化石墨烯納米復(fù)合材料的特性對氧化石墨烯和銀-氧化石墨烯納米復(fù)合物做紫外可見光譜分析。氧化石墨烯在波長300 800 nm圍沒有特征吸收峰。相反，銀-氧化石墨烯納米復(fù)合物在紫外吸收光譜中410 nm波長附近有一個(gè)獨(dú)特的吸收峰，說明吸收峰是由于銀納米粒子的存在而形成的。此外，采用電鏡掃描對氧化石墨烯納

20、米片上銀納米粒子的存在和形態(tài)進(jìn)行了深入研究，結(jié)果表明氧化石墨烯納米片看起來就像是一個(gè)起皺的薄海綿。有大量銀納米粒子作為球形粒子裝飾在氧化石墨烯納米片上。3.2.2電化學(xué)免疫傳感器的特性圖4 展示了逐步修飾電極的循環(huán)伏安圖。如圖4 所示，由于缺少氧化-還原探針，裸露的金電極上沒有探測信號(hào)，在裸金電極上使用銀-氧化石墨烯納米材料，一對清楚的氧化還原峰（曲線B）出現(xiàn)在循環(huán)伏安圖中。這樣的結(jié)果歸因于銀-氧化石墨烯納米復(fù)合物作為一個(gè)氧化還原探針的參與。當(dāng)金納米粒子分散在銀-氧化石墨烯修飾的電極上之后，一對峰值電流（曲線C）顯著增加。這是因?yàn)榻鸺{米粒子不僅提供大的表面積，而且還擁有高的導(dǎo)電性進(jìn)而加速電子轉(zhuǎn)

21、移。AFP抗體和BSA被連續(xù)地固定在金納米粒子銀-氧化石墨烯修飾的金電極上之后，均出現(xiàn)了降低信號(hào)（曲線D和E）。結(jié)果表明, AFP抗體和BSA作為蛋白質(zhì)生物大分子在電子轉(zhuǎn)移過程中具有阻礙電子傳輸?shù)哪芰?。此外，孵? ng·mL-1 AFP抗原之后又獲得一個(gè)降低信號(hào)（曲線F），說明抗體成功地識(shí)別并結(jié)合了抗原。圖4 電化學(xué)免疫傳感器電極修飾圖Fig.4 CVs of modified electrochemical immunosensor此外，循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn)在0.1 M PBS (pH=7.4)緩沖液中以不同的掃描速率進(jìn)行測定，從圖5我們可以知道，掃速在20-250 mV·s-

22、1之間的陽極峰流值會(huì)有一個(gè)線性關(guān)系，陰極峰流值同樣如此。圖5 免疫傳感器在0.1 M PBS (pH =7.4)緩沖液中掃速與陽極峰電流值的線性圖Fig.5 The linear figure of different scan rate and the anode peak current in 0.1 M PBS (pH =7.4)3.2.3孵育時(shí)間優(yōu)化免疫反應(yīng)時(shí)間很大程度上影響了免疫傳感器的靈敏度，因此優(yōu)化孵育時(shí)間具有重要意義。實(shí)驗(yàn)如下：裸金電極按前面所描述的那樣逐步被修飾，于5 ng·mL-1 AFP溶液中孵育不同的時(shí)間，記錄不同時(shí)間點(diǎn)下的循環(huán)伏安曲線。如圖6所示，隨孵育時(shí)間

23、的增加，峰值電流逐漸減小直到20 min后出現(xiàn)一個(gè)平臺(tái)，標(biāo)志著達(dá)圖6 免疫傳感器在AFP中孵育時(shí)間的優(yōu)化Fig.6 Optimization of incubation time for the immunosensor in 5 ng·mL-1 AFP到了飽和狀態(tài)。因此，20 min被確定為最佳孵育時(shí)間。3.2.4免疫傳感器的循環(huán)伏安響應(yīng)和校準(zhǔn)曲線在最優(yōu)測定條件下，免疫傳感器用于測量不同濃度的AFP。如圖7所示，由于電子遷移過程阻礙的增加，陽極峰電流值隨著AFP濃度的增加而減小。因此，電信號(hào)的變化可以作為測定AFP含量的一個(gè)指標(biāo)，其校準(zhǔn)曲線繪制在圖7中，在3 pg·mL-

24、1檢出限下陽極峰電流值與AFP濃度的對數(shù)成線性關(guān)系，AFP的濃度圍為0.01 ng·mL-1到100 ng·mL-1。相應(yīng)的回歸方程為y26.0761x 58.035，相關(guān)系數(shù)為0.9894。圖7 不同濃度AFP與陽極峰電流值的線性圖Fig.7 Calibration plot for the immunosensor in various AFP concentrations3.2.5免疫傳感器的選擇性、再現(xiàn)性和穩(wěn)定性我們選擇了3種潛在的干擾物質(zhì)對免疫傳感器的選擇性進(jìn)行了研究，分別是20 ng·mL-1 BSA、20 ng·mL-1 CEA、20 ng

25、·mL-1半胱氨酸。結(jié)果表明，當(dāng)我們與僅有5 ng·mL-1 AFP存在下的結(jié)果相比，每一種干擾物質(zhì)的電化學(xué)響應(yīng)可以被忽略。除此之外，三種干擾物質(zhì)與AFP混合物的電化學(xué)響應(yīng)幾乎與單獨(dú)的AFP是一樣的?；诳乖贵w的特異性免疫反應(yīng)的目標(biāo)傳感器，在AFP測定中具有良好的選擇性。用5個(gè)準(zhǔn)備好的免疫傳感器在一樣濃度的AFP中測定免疫傳感器的再現(xiàn)性。結(jié)果表明，5個(gè)免疫傳感器的電化學(xué)響應(yīng)具有相似性，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.7 %，達(dá)到了很好的再現(xiàn)性。為了檢測免疫傳感器的穩(wěn)定性，用一樣的免疫傳感器在PBS緩沖液進(jìn)行50個(gè)周期連續(xù)的循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn)測量，得到的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差是4.28 %。當(dāng)免疫傳感器存儲(chǔ)在4 ºC溫度下，七天之后再次測量沒有明顯的變化。4結(jié)論本實(shí)驗(yàn)中免疫傳感器使用的銀-氧化石墨烯納米復(fù)合物是在氫氧化二氨合銀溶液中原位還原合成的，它不僅具有了良好的分散性和生物相容性，而且還有很好的氧化還原電化學(xué)活性。因此，我們通過使用活性氧化還原銀-氧化石墨烯納米復(fù)合物作為探針和平臺(tái)得到了一個(gè)新穎的非標(biāo)記AFP檢測免疫傳感器。實(shí)驗(yàn)表明，將納米技術(shù)應(yīng)用于免疫傳感器可以大大提高傳感器的性能，具有一定的實(shí)用價(jià)值。參考文獻(xiàn):1 漆紅蘭，延，曉霞，成孝.適體傳感器