慢病毒載體相關(guān)知識

1、慢病毒載體相關(guān)知識問答Q:什么是慢病毒？A: 慢病毒載體 （Lenti vector） 是用于感染細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定導(dǎo)入基因或 siRNA 的病毒載體系統(tǒng)，其感染效率可 以達(dá)到 100%。慢病毒和細(xì)胞結(jié)合后通過包裝蛋白將含有目的基因或者干擾序列釋放到細(xì)胞內(nèi)。慢病毒 RNA通過逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄為 DNA 。 DNA 整合前復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核并整合到靶細(xì)胞的染色體DNA 。由于靶基因或基因干擾序列整合到染色體上并且伴隨著細(xì)胞分裂時 DNA 的復(fù)制一起復(fù)制，基因的導(dǎo)入能夠獲得穩(wěn)定的表 達(dá)。慢病毒的顯著優(yōu)勢在于其可以整合到非分裂細(xì)胞，而其他載體（如非病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān) 病毒載體）不具備整合到靶細(xì)胞染色

2、體的特性， 或者只能整合到分裂細(xì)胞的染色體 （如常規(guī)的逆轉(zhuǎn)錄病毒） 。 目前我們使用的慢病毒載體是基于 HIV-1 改造而來，該載體使用最為廣泛，經(jīng)過科學(xué)家的多次改造在包裝 滴度和使用安全性等方面都非常理想。在實(shí)際的使用中我們可以用來表達(dá)目的基因或目的基因加上報(bào)告基 因，近年來隨著 RNAi 研究的深入，越來越多的科學(xué)家用慢病毒載體來表達(dá)干擾序列 .Q：慢病毒用于 RNAi研究A：目前慢病毒也被廣泛地應(yīng)用于表達(dá)RNAi的研究中。由于有些類型細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效果差，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的 siRNA 半衰期短，體外合成 siRNA 對基因表達(dá)的抑制作用通常是短暫的， 因而使其應(yīng)用受到較大的限 制。采用事先

3、在體外構(gòu)建能夠表達(dá) siRNA 的載體 , 然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄 siRNA 的策略，不但使脂質(zhì)體有 效轉(zhuǎn)染的細(xì)胞種類增加，而且對基因表達(dá)抑制效果也不遜色于體外合成siRNA，在長期穩(wěn)定表達(dá)載體的細(xì)胞中，甚至可以發(fā)揮長期阻斷基因表達(dá)的作用。在所構(gòu)建的siRNA表達(dá)載體中，是由 RNA聚合酶川啟動子來指導(dǎo)RNA合成的，這是因?yàn)镽NA聚合酶川有明確的起始和終止序列，而且合成的RNA不會帶poly A尾。當(dāng)RNA聚合酶川遇到連續(xù) 4個或5個T時，它指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄就會停止，在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3端形成14個U。U6和H1 RNA啟動子是兩種 RNA聚合酶川依賴的啟動子， 其特點(diǎn)是啟動子自身元素均位于轉(zhuǎn)錄區(qū)的上游，

4、適合于表達(dá)21ntRNA和50ntRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)（stem loop）。在siRNA表達(dá)載體中，構(gòu)成 siRNA的正義與 反義鏈，可由各自的啟動子分別轉(zhuǎn)錄，然后兩條鏈互補(bǔ)結(jié)合形成siRNA ;也可由載體直接表達(dá)小發(fā)卡狀RNA（small hairpin RNA, shRNA）, 載體包含位于 RNA聚合酶川啟動子和 45T轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)之間的莖環(huán)結(jié) 構(gòu)序列，轉(zhuǎn)錄后即可折疊成具有14個U 3 突出端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步加工成siRNA。構(gòu)建載體前通常要通過合成 siRNA 的方法，尋找高效的 siRNA ，然后從中挑選符合載體要求的序列，將其引入 siRNA 表達(dá)載體。Q：如何生產(chǎn)病毒？A:

5、載體質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 293細(xì)胞后收獲病毒上清，通過超濾和超速離心進(jìn)行純化和濃縮獲得高滴度和 高純度的慢病毒顆粒。Q:病毒是否可以重新凍融？A:病毒可以凍融，但是反復(fù)多次的凍融會降低病毒的滴度。Q:什么是病毒的滴度？A:病毒的滴度即每升溶液中含有的病毒數(shù)量。滴度值用于評估轉(zhuǎn)導(dǎo)一定數(shù)量靶細(xì)胞所需要的病毒數(shù)量。Q：轉(zhuǎn)導(dǎo)單位（TU ）的含義？A:轉(zhuǎn)導(dǎo)單位（TU ）即能夠感染并整合到細(xì)胞內(nèi)的病毒載體基因組，Q:MOI 的含義？A:MOI 指用來轉(zhuǎn)染單個細(xì)胞的病毒數(shù)量， 即含義是感染時病毒與細(xì)胞數(shù)量的比值。 如果 MOI 為 1 則感染每 個細(xì)胞的病毒顆粒數(shù)為 1。同一種類同一批次的病毒感染不同種類的

6、細(xì)胞，其 MOI 值不盡相同，需要進(jìn)行梯度實(shí)驗(yàn)測算；另外不同的滴度檢測方法也會導(dǎo)致 MOI 很大的差異。Q:可以獲得的病毒可以達(dá)到多少滴度？A:常規(guī)生產(chǎn)的病毒的滴度在2 x 10E8TU/ml之間。Q:如何使用慢病毒感染細(xì)胞？A：使用慢病毒感染細(xì)胞的操作流程取決于細(xì)胞種類，因此首先要了解細(xì)胞的來源和背景，我們將在發(fā)貨時 將通用操作流程發(fā)送客戶。通常來講首先要根據(jù)準(zhǔn)確的 MOI 和需要感染的細(xì)胞量計(jì)算所需要的病毒量，然 后將所需病毒也加入培養(yǎng)體系后 4 小時左右即可換成完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。Q:如何確定慢病毒感染靶細(xì)胞的感染效率？A:慢病毒感染靶細(xì)胞的感染效率可以通過Real-time PCR檢測

7、靶細(xì)胞中的慢病毒載體拷貝數(shù)來測算。另外如果構(gòu)建的慢病毒載體帶有標(biāo)記基因（如GFP、RFP 等），則可以通過 FACS 檢測陽性細(xì)胞的比例來評估感染效率。Q：慢病毒感染靶細(xì)胞后，目的基因的表達(dá)是瞬時表達(dá)還是穩(wěn)定表達(dá)？A:慢病毒感染靶細(xì)胞后，目的基因或者干擾序列被整合到細(xì)胞的染色體DNA;并且隨靶細(xì)胞的增殖分化，目的基因或者干擾序列也隨靶基因 DNA 的一起復(fù)制并遺傳到子代細(xì)胞中,所以是穩(wěn)定表達(dá)。Q:通常生產(chǎn)一個慢病毒載體的實(shí)驗(yàn)周期是多久？A:我們將在收到您的訂單和實(shí)驗(yàn)材料20個工作日左右完成病毒的生產(chǎn)和檢測，如果客戶需要委托購買或者合成目的基因（干擾序列） ，會增加相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)周期。Q:是否可以直

8、接從慢病毒顆粒中提取慢病毒載體？A:不可以。慢病毒載體用于轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞后生產(chǎn)病毒，包裝好的病毒顆粒只含有載體中5 and 3 LTRs的RNA。Q:使用公司提供的病毒可以感染多少細(xì)胞？A:可以感染的細(xì)胞量取決于您需要感染的靶細(xì)胞的易感性，原代細(xì)胞或者難感染的細(xì)胞需要較高的MOI,因此需要的病毒量也比較多。我們建議您可以通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定目的細(xì)胞的MOI, 即使用公司的 GFP 病毒設(shè)定不同的 MOI （1、5、10、15 等）分別感染目的細(xì)胞。Q：如何知道靶細(xì)胞是否能夠被慢病毒感染？A:根據(jù)現(xiàn)有的研究表明，慢病毒感染譜很廣，包括分裂和非分裂細(xì)胞。一方面可以通過查詢文獻(xiàn)得知是否 可以被感染，另外也可

9、以使用提供的 GFP 慢病毒載體對照顆粒進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定細(xì)胞的易感性和 MOI.Q：在使用慢病毒時需要哪些預(yù)防措施？A:慢病毒的操作要求在BSL2級別的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)操作人員需帶上乳膠手套，按照標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)操作流程進(jìn)行。Q：在實(shí)驗(yàn)室使用慢病毒是否安全？A:慢病毒載體包括包裝成分和載體成分：包裝成分由HIV-1基因組去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列而構(gòu)建，能夠反式提供產(chǎn)生病毒顆粒所必需的蛋白；載體成分則與包裝成分互補(bǔ)，即含有包裝、 逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的 HIV 順式作用序列，同時具有異源啟動子控制下的多克隆位點(diǎn)及在此位點(diǎn)插入的目的基因。為降低兩種成分同源重組恢復(fù)成野生型病毒的可

10、能，需盡量減少二者的同源性， 如將包裝成分上5 LTR換成CMV （巨細(xì)胞病毒早期啟動子）、3 LTR換成SV40 polyA等。包裝成分通常被分開構(gòu)建到兩個質(zhì)粒上， 一個質(zhì)粒表達(dá) Gag 和 Pol 蛋白，另一個質(zhì)粒表達(dá) Env 蛋白，其目的也是降低恢復(fù)成野生型病毒的可能。目 前在用 HIV-1 載體已經(jīng)進(jìn)行的所有體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中，未出現(xiàn)過有復(fù)制力的 HIV ，說明其安全性是有保證的。Q:什么是自身失活慢病毒載體 （SIN ） ?A:SIN載體的構(gòu)建是將載體 3 LTF長末端重復(fù)序列）中的U3區(qū)增強(qiáng)子和啟動子序列刪除。U3-LTR是前病毒DNA兩端LTR中U3的模板，在逆轉(zhuǎn)錄過程中，3 L TR

11、中的缺失被傳遞到子代載體的5 L TR中，所形成的載體缺乏 HIV-1 的增強(qiáng)子和啟動子序列 , 即使在所有病毒蛋白都存在的情況下也不能轉(zhuǎn)錄 RNA , 產(chǎn)生 了一個滅活的前病毒 ， 但其中的外源啟動子仍然有活性 ， 能進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。 這種方式主要用來消除病 毒LTR中的啟動子/增強(qiáng)子序列對病毒載體中外源啟動子指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的干擾作用，以及消除可能的由3 LTR啟動子指導(dǎo)的下游基因組中原癌基因的激活與轉(zhuǎn)錄作用 ， 一定程度上提高了載體的安全性Q：獲得慢病毒顆粒后是否可以在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)一步增殖？A:不可以。科學(xué)家考慮到了其使用的生物安全性將慢病毒載體改造成為復(fù)制缺陷型病毒載體。獲得的病毒 顆粒的基因組不具有重組所