總RNA的提取_(試劑盒法、氯化鋰法和蛋白酶-熱酚法)

1、總 RNA 的提?。ㄔ噭┖蟹ā⒙然嚪ê偷鞍酌笩岱臃ǎ┧?RNA 的提取過程中都有五個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，即1 ）樣品細(xì)胞或組織的有效破碎； 2）有效地使核蛋白復(fù)合體變性； 3）對內(nèi)源 RNA 酶的有效抑制； 4）有效地將 RNA 從 DNA 和蛋白 混合物中分離； 5 ）對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。關(guān)鍵詞：試劑盒；蛋白酶；總RNA提?。辉噭┖蟹?；氯化鋰法；蛋白酶熱酚法；Total RNA Isolation完整 RNA 的提取和純化，是進(jìn)行 RNA 方面的研究工作，如 Northern 雜交、 mRNA 分 離、 RT-PCR 、定量 PCR、cDNA 合成及體外翻譯等的前提。所有

2、 RNA 的提取過程中都有 五個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，即 1）樣品細(xì)胞或組織的有效破碎；2 ）有效地使核蛋白復(fù)合體變性；3）對內(nèi)源 RNA 酶的有效抑制； 4）有效地將 RNA 從 DNA 和蛋白混合物中分離； 5）對于多糖含量 高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。但其中最關(guān)鍵的是抑制RNA 酶活性。RNA 的提取目前階段主要可采用兩種途徑， 1） 提取總核酸，再用氯化鋰將 RNA 沉淀 出來； 2） 直接在酸性條件下抽提，酸性下 DNA 與蛋白質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相而 RNA 留在水相。第 一種提取方法將導(dǎo)致小分子量 RNA 的丟失，目前該方法的使用頻率已很低。方法一 : 總 RNA 的試劑盒快速提取一些公司推出的

3、總 RNA提取試劑盒，可以用來制備高質(zhì)量的可用于建庫的RNA。該總RNA純化系統(tǒng)采用兩種著名的 RNA酶抑制劑，異硫氰酸弧（GTC）和俟巰基乙醇，加上整個(gè) 操作都在冰浴下進(jìn)行，這樣就能顯著降低RNA的降解速率。GTC和N-十二烷基肌氨酸鈉的聯(lián)合使用，將促使核蛋白復(fù)合體的解離，使 RNA 與蛋白質(zhì)分離，并將 RNA 釋放到溶液 中。而進(jìn)一步從復(fù)合體中純化 RNA ，則根據(jù) Chomc zynski 和 Sacchi 的一步快速抽提法進(jìn) 行，采用酸性酚 -氯仿混合液抽提。低 pH 值的酚將使 RNA 進(jìn)入水相，這樣使其與仍留在有 機(jī)相中的蛋白質(zhì)和 DNA 分離。 水相中的 RNA 可用異丙醇沉淀濃

4、縮。 進(jìn)一步將上述 RNA 沉 淀復(fù)溶于 GTC 溶液中，接著用異丙醇進(jìn)行二次沉淀，隨后用乙醇洗滌沉淀，即可去除所有 殘留的蛋白質(zhì)和無機(jī)鹽，而 RNA 中如含無機(jī)鹽，則有可能對以后操作中的一些酶促反應(yīng)產(chǎn) 生抑制。一：儀器恒溫水浴 ,冷凍高速離心機(jī) , 紫外分光光度計(jì) ,取液器 ,電泳儀 ,電泳槽二：試劑RNA 提取試劑盒， 0.05% 焦碳酸二乙酯 (DEPC) ，75% 乙醇操作步驟(一 ) 細(xì)胞或組織破碎A: 微生物材料1：發(fā)酵 34 天 (或?qū)?shù)生長期 )的菌體，離心收集菌絲體 (動(dòng)植物材料無需此步處理 )2：用經(jīng) DEPC 處理的水洗菌絲體 23 次，并盡量除去殘存的水 3：加液氮充分

5、研磨，使其成為粉末，以釋放RNA4：研磨后的樣品轉(zhuǎn)移至 12ml 變性液的容器中勻漿。B: 動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)材料 (適用的樣品量為細(xì)胞1: 細(xì)胞或組織培養(yǎng) : 按常規(guī)方法進(jìn)行2: 深層懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的破碎 :(1) 細(xì)胞收集：含一定濃度的細(xì)胞培養(yǎng)液置于無菌離心管中，4C ,3000 g離心5分鐘。 細(xì)胞洗滌：上步沉淀用25毫升滅菌后冰凍的1XPBS緩沖液洗滌，然后 4 C ,3000 g離 心 5 分鐘。(3) 細(xì)胞破碎 ： 在沉淀細(xì)胞中加入 15 毫升預(yù)冷的變性液，用無菌處理過的勻漿器勻漿。3： 表面培養(yǎng)細(xì)胞的破碎 ：(1) 確定培養(yǎng)瓶數(shù)量，使選定的各培養(yǎng)瓶細(xì)胞累加后總量達(dá)108。(2) 細(xì)胞收

6、集 ： 將培養(yǎng)液倒掉，用預(yù)冷的無菌 PBS 緩沖液洗滌一次，在培養(yǎng)瓶中加入 8 毫 升預(yù)冷變性液，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞溶解，此時(shí)可見粘度加大。(3) 用無菌吸管將第一個(gè)培養(yǎng)瓶中的液體吸入第二個(gè)培養(yǎng)瓶,旋轉(zhuǎn)， 溶解細(xì)胞， 再吸入第三個(gè)培養(yǎng)瓶， 以此類推， 直到將所選定的培養(yǎng)瓶全部洗滌一次，然后從第一個(gè)培養(yǎng)瓶開始再加入4 毫升上述變性液，將所有培養(yǎng)瓶洗一次。將上述 12 毫升含細(xì)胞的變性液轉(zhuǎn)移至一 50 毫升無菌離心管中，勻漿破碎細(xì)胞。C： 植物組織破碎(適用的樣品量為 0.05 g 組織)(1)將600 ul變性液置于1.5 ml離心管中，將此離心管放于冰浴中5分鐘。(2) 將0.05 g新鮮組織

7、用液氮冰凍。(3) 在液氮下，研磨組織塊。(4) 待液氮揮發(fā)后，將上述分散的組織轉(zhuǎn)移至無菌離心管中。D:動(dòng)物組織破碎(適用的樣品量為1克組織)。(1) 將12毫升變性液置于 50毫升離心管中，將此離心管放于冰浴中5分鐘。(2) 在上述管中加入1克新鮮或冰凍動(dòng)物組織，勻漿粉碎。注1：研磨組織塊用于 RNA提取的樣品，必須是新鮮的細(xì)胞或組織，如采樣后，不能立即用于提取則樣品應(yīng)用液氮速凍并貯于-70 C的冰箱中保存。2:變性液及相應(yīng)的離心管需預(yù)冷。(二)：RNA的抽提在經(jīng)變性液勻漿的細(xì)胞或組織600ul + 60ulpH4. 0的咖乙醜鈉徹底混J勻，可用游渦振蕩器| 600ul酚'氯仿昇戊醇

8、(25241),徹底混勻或漩渦振蕩器振蕩10秒1冰裕中1LL5分鐘離心,40 lOOOOg, 20分鐘上層水相吸至無菌離心管中傳郞積的異丙醇廠TOC, 30分鐘沉淀RNA *離心、4C, lOOOOg, 20 分鐘沉淀RNA,冷祿干燥15分鐘,RHA沉淀重新i容于300ul變性液中，可 振蕩(有時(shí)為了幫助潛解，可在6兀加熱，但時(shí)間應(yīng)極短)60ulpH4. 0的2M乙醍鈉徹底混勻，可用漩渦振蕩器I 600ul酚氯仿異戊醇(25X24U),徹底混勻或漩渦振蕩器振蕩10秒I 冰裕中 iai5分融l"l0Z4；離心10000氐20爐申 上層水相吸至無菌韶心管中*等體積異丙醇二袂沉淀分0),

9、7 5 %乙醇洗沉淀,沉淀冷 凍干燥，復(fù)潛于去m酶的水中(對于準(zhǔn)備長期保存的m可加入PH 5. o的乙 酸鈉至終濃度為0. 25M,再加入2.5體積的乙醇，-7 012保存“)注:1變性液組成：25 g異硫氰酸胍溶于 33 ml CSB (42 mM pH4.0乙酸鈉、0.83%十二烷基肌氨酸鈉、0.2 m M3 -巰基乙醇),65C溶解，過濾滅菌，4C預(yù)冷。2酸性酚配制：55 C時(shí)，500 g酚溶入500 ml 50 mM , pH4.0乙酸鈉，混勻，靜止分層后， 去上清，再反復(fù)加 500 ml 50 mM , pH4.0乙酸鈉，直到 pH<4.1。方法二 : 氯化鋰法提取總 RNA本

10、方法用高濃度尿素變性蛋白并抑制 RNA 酶，用氯化鋰選擇沉淀 RNA ，其特別適合于 從大量樣品中提取少量組織 RNA ，具有快速簡潔的長處， 但也存在少量 DNA 的污染及 RNA 得率不高，小 RNA 片斷丟失的缺陷。儀器：同上試劑：氯化鋰 /尿素溶液【氯化鋰 126g(3M) 尿素、 360g(6M) 加水至 1L ，過濾滅菌】懸浮液【 10mMTris-HCL (pH7.6) ， 1mMEDTA (pH8,0) ， 0.5%SDS 】其余同上操作步驟：1：對于大量組織或細(xì)胞，則每克組織或細(xì)胞加入510 ml 氯化鋰尿素溶液，勻漿器高速勻槳2分鐘；對于少量細(xì)胞(107個(gè)細(xì)胞/ml),則每

11、克組織或細(xì)胞加入0.5 ml氯化鋰尿素溶液手工勻槳，并轉(zhuǎn)移至 Eppendof 管中。2:勻漿液在0 4C放置4小時(shí)后，12000 g離心30分鐘。3：取沉淀,加入原勻漿液 1/2 體積的氯化鋰尿素溶液,重復(fù)步驟 2。4:沉淀用原勻漿液 1/2 體積的氯化鋰尿素溶液復(fù)溶后, 加入等體積酚 /氯仿/異戊醇在室溫 放置 1530 分鐘并不時(shí)搖動(dòng)混勻, 4000g 離心 5分鐘。5:取上層水相，力口 1/10倍體積的3M乙酸鈉(pH5.2 )及2倍體積的乙醇，20 C放置1 小時(shí), 5000 g 離心。6: 70乙醇洗沉淀一次。真空干燥。7: RNA溶解液溶解沉淀，得 RNA，分裝，于70 C保存。

12、方法三：蛋白酶熱酚法本方法適合于病毒 RNA 的提取。儀器：同上試劑：蛋白酶 K (終濃度 50 ug/ml )2 X緩沖液：1% SDS , 20 mM Tris-HCL (pH 7.6), 0.2 M NaCI。其余同上操作：1、提純病毒液中加入等體積緩沖液、蛋白酶 K, 37 C 40-50分鐘。2、 加入等體積65 C預(yù)熱的酚溶液，輕徭，在 65 C保溫5分鐘后再輕徭。3、離心，取上清，氯仿抽提一次。4、取上層水相，加1/10倍體積的3 M乙酸鈉（pH5.2 ）及2倍體積的乙醇，20 C放置1 小時(shí)， 5000 g 離心 （10000 g,10 min） 。5、70乙醇洗沉淀一次。真空

13、干燥。6、RNA溶解液溶解沉淀，得 RNA，分裝，于70 C保存。上面介紹了一些核酸（DNA、RNA ）提取方法，在進(jìn)行具體實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)根據(jù)研究對象 的性質(zhì)， 提取核酸的用途而對上述方法在操作步驟和試劑使用量上作一定的修改。以下一些原則和建議對核酸提取的操作可能會有一定的裨益。1：在核酸提取時(shí)，為了增加細(xì)胞的裂解度，增加核蛋白復(fù)合體破碎度，以釋放更多的 游離核酸，在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶 K,在確保沒有核酸水解酶存在的前提下，酶反應(yīng)時(shí)間越長越好。2：有時(shí)在使用蛋白酶時(shí)，為了抑制核酸水解酶的降解作用，可在蛋白酶緩沖液中用終 濃度5mM的EDTA代替NaCL，并且可將反應(yīng)溫度提高到50 60

14、C,并將反應(yīng)時(shí)間縮短到15 25min，但酶用量必須提高 10 20倍。溶菌酶使用時(shí)緩沖液中需加 EDTA，因游離 金屬離子對酶有抑制。3：許多植物材料中富含酚，在細(xì)胞破碎時(shí)，在多酚氧化酶作用下，被氧化成有色的醌 類物資，影響核酸的提取及降低提取質(zhì)量，在提取液中加入PVP 和巰基乙醇對降低酚類的干擾可能有所幫助。 PVP 將與酚形成復(fù)雜的聚合體，在提取時(shí)將酚從核酸成分中游離。且 PVP 與巰基乙醇作為強(qiáng)還原劑可防止多酚的褐變。另外作為還原劑的這些成分在一定程度 上可抑制核酸水解酶的作用。4：許多生物材料在提取核酸時(shí)，都會遇到多糖的污染問題，具體表現(xiàn)為有機(jī)溶劑沉淀 時(shí)，沉淀很多，但復(fù)溶時(shí)，大量沉

15、淀不溶，電泳觀察時(shí)核酸含量很低?？朔嗵俏廴究刹捎?以下一些辦法（ 1 ） CTAB 多次抽提。2）在有機(jī)溶劑沉淀時(shí)先稀釋樣品濃度（可到 10 倍左右），對低濃度樣品再進(jìn)行沉淀。（ 3）在有機(jī)溶劑沉淀時(shí)選用異丙醇和5MNaCL 作為沉淀溶劑， 此時(shí)氯化鈉的用量可用到 1/5-1/2 的體積，異丙醇可用到 0.6-1 的體積。異丙醇沉淀核酸時(shí)，高濃度鹽存在將使大 量多糖存在溶液中， 從而可達(dá)到去多糖的作用。 但高濃度的鹽存在會影響核酸的進(jìn)一步操作， 因此必須用乙醇多次洗滌脫鹽。5：在核酸提取時(shí)，酚與氯仿均起到變性的作用。酚的變性能力強(qiáng)于氯仿，但酚與水有 一定的互溶，因此酚抽后，除可能損失部分核酸

16、外，水相中還會殘留酚，而酚的存在將對核 酸的酶反應(yīng)產(chǎn)生強(qiáng)的抑制，因此在操作中可單用氯仿作變性劑、也可用酚/氯仿混合變性，也可用單一酚作變性己，但用單一酚后在有機(jī)溶劑沉淀時(shí)一定要用氯仿從抽提。6：在操作中當(dāng)加入變性劑氯仿后，為了保證核酸樣品的完整性，操作要輕，尤其在提DNA 時(shí)，更要避免劇烈操作。7：在沉淀核酸時(shí)可用乙醇與異丙醇，乙醇的極性要強(qiáng)于異丙醇，所以一般用2V 乙醇沉淀， 但在多糖、蛋白含量高時(shí)，用異丙醇沉淀可部分克服這種污染， 尤其用異丙醇在室溫 下沉淀對擺脫多糖、雜蛋白污染更為有效。&在提取核酸時(shí)，如樣品濃度低，則應(yīng)增加有機(jī)溶劑沉淀時(shí)間，70 C下30min20 C過夜將有助于增加核酸的沉淀量。