人硒蛋白PcDNA探針的制備及其在肝臟組織中的表達(dá)

1、人硒蛋白P cDNA探針的制備及其在肝臟組織中的表達(dá) 作者：南克俊 隋晨光 韓王月 劉彥仿 胡沛臻 秦海霞 景釗 劉陜西 【關(guān)鍵詞】 人硒蛋白P Preparation of human selenoprotein P cDNA probe and expression in human hepatic tissue 【Abstract】 AIM: To investigate the expression of selenoprotein P mRNA in hepati ; 作者：南克俊 隋晨光 韓王月 劉彥仿 胡沛臻 秦海霞 景釗 劉陜西 【關(guān)鍵詞】; 人硒蛋白P Preparation

2、 of human selenoprotein P cDNA probe and expression in human hepatic tissue 【Abstract】 AIM: To investigate the expression of selenoprotein P mRNA in hepatic diseases, including cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). METHODS: Selenoprotein P cDNA fragment was amplified by PCR the expression of

3、 Selenoprotein P mRNA was detected in 13 cases of normal liver, 20 cases of cirrhosis and 30 cases of hepatocellular carcinoma (HCC) by in situ hybridization. RESULTS: The PCR products evaluated by electrophoresis were as expected. The expression of selenoprotein P mRNA was found in the tissue strom

4、a of liver, especially in the endothelial cells of vasculature. The positive expression rate of selenoprotein P mRNA was 84.6% (11/13), 50.0% (10/20), 20.0% (6/30) respectively in normal liver, cirrhosis and HCC. The rate of expression in hepatic carcinoma was significantly lower than that in others

5、 (2=15.84, P0.005; 2=4.96, P0.05). The positive blue granules were seen distributed in the nucleus and cytoplasm in normal liver and cirrhosis liver. The expression in nucleus of normal liver was significantly higher than that of cirrhosis liver. In HCC, the positive particles were located in cytopl

6、asm, but nucleolus showed almost no staining. CONCLUSION: The expression of human selenoprotein P gene is significant different in the three kinds of liver tissues, suggesting that selenoprotein P may play a role in the occurrence and development of HCC. 【Keywords】 human selenoprotein P; cDNA probes

7、; PCR; in situ hybridization; carcinoma, hepatocellular 【摘要】 目的： 探討SeP基因與肝臟疾病特別是肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系. 方法： 采用美國(guó)Georgia大學(xué)惠贈(zèng)的質(zhì)粒PBluescriptHuman Selenoprotein P，用PCR法制備人SeP cDNA探針，檢測(cè)了13例正常肝臟、20例肝硬化、30例肝癌組織中SeP mRNA的表達(dá)水平. 結(jié)果: PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定與預(yù)期相符. 3種肝臟組織的組織間質(zhì)均有SeP mRNA表達(dá)，主要位于脈管區(qū)的血管內(nèi)皮；正常肝細(xì)胞、肝硬化肝細(xì)胞及肝癌細(xì)胞中SeP mRNA陽(yáng)性率分別為84.6

8、%，50.0%，20.0%. 肝癌細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于其他兩組（2=15.84, P0.005; 2=4.96, P0.05）. 正常肝細(xì)胞和肝硬化肝細(xì)胞的胞質(zhì)及胞核內(nèi)均出現(xiàn)藍(lán)色的陽(yáng)性顆粒，在胞核主要分布在核仁與核周；正常肝細(xì)胞的核陽(yáng)性強(qiáng)于肝硬化肝細(xì)胞. HCC細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)顆粒位于胞質(zhì)，胞核幾無(wú)表達(dá). 結(jié)論: 人SeP cDNA探針制備成功，可用于人體組織SeP mRNA的原位檢測(cè). 肝癌細(xì)胞中存在SeP mRNA的表達(dá)缺失，SeP基因的缺失可能與肝癌的發(fā)生有關(guān). 【關(guān)鍵詞】 人硒蛋白P；cDNA探針；PCR；原位雜交；癌，肝細(xì)胞 0引言 硒是人體必需的微量元素之一，參與GSHPx的合成，具

9、有抗氧化損傷作用1，流行病學(xué)調(diào)查表明缺硒可導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生2. 實(shí)驗(yàn)證實(shí)食物中添加硒可以減少前列腺癌、結(jié)腸癌、肺癌及肝癌的發(fā)生3. 硒的許多生物學(xué)功能是通過(guò)硒蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)的，迄今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了18種具有生物功能的硒蛋白，硒蛋白P（Selenoprotein P，SeP）是其中一種4. 人體幾乎所有的組織中都含有SeP，近年來(lái)大量研究證實(shí)其與多種惡性腫瘤有關(guān)，已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn). 但從基因水平對(duì)肝癌組織中的SeP進(jìn)行原位檢測(cè)，目前尚少見(jiàn)報(bào)道. 因此我們制備了特異性的SeP cDNA探針，對(duì)正常肝臟、肝硬化、肝癌組織進(jìn)行核酸原位雜交，檢測(cè)其表達(dá)水平，探討SeP與肝臟疾病特別是肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系. 1材

10、料和方法 1.1材料質(zhì)粒PBluescriptHuman Selenoprotein P由美國(guó)Georgia大學(xué)惠贈(zèng)，全長(zhǎng)為6.4 kb，為氨芐青霉素抗性（Amp+），宿主菌為JM109. 小量質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自上海華舜生物工程有限公司. Taq DNA聚合酶購(gòu)自華美生物工程公司. DNA Marker購(gòu)自大連Takara公司. 地高辛標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒購(gòu)自德國(guó)Boehringer Mannheim公司. 13例正常肝臟標(biāo)本取自非肝臟疾病的尸檢患者及肝移植的供肝者，30例肝硬化及30例原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌（HCC）標(biāo)本取自西安交通大學(xué)第一醫(yī)院1999/2001間手術(shù)切除標(biāo)本，肝

11、硬化和HCC均經(jīng)病理診斷證實(shí). 所有標(biāo)本經(jīng)40 gL-1甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 m連續(xù)切片. HE染色復(fù)查切片.1.2方法 1.2.1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒PBluescriptHuman Selenoprotein P冷點(diǎn)在保鮮膜上，將剪碎的膜用20 L的TrisHCl緩沖液（TE pH 8.0）浸泡30 min，浸出液加入100 L JM109感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30 min，42熱休克90 s，迅速置于冰上2 min，加入800 L LB培養(yǎng)基，37溫浴45 min，5000 rmin-1離心5 min，留100 L上清混勻沉淀，涂布于已加入Amp（100 gmL-1）的LB瓊脂平板

12、上，37培養(yǎng)過(guò)夜. 1.2.2質(zhì)粒的擴(kuò)增和提取挑取瓊脂平板上的單一菌落，接種于5 mL含Amp（100 gmL-1）的LB培養(yǎng)基中，37搖床，100150 rmin-1，812 h. 以質(zhì)粒提取試劑盒按說(shuō)明提取質(zhì)粒. 取5 L進(jìn)行2 gL-1的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)質(zhì)粒提取結(jié)果. 置于-20冰箱保存?zhèn)溆? 1.2.3SeP cDNA探針的制備與標(biāo)記根據(jù)SeP基因序列（GenBank access number：36425）使用Primer Premier軟件（Version 5.0，PREMIER Biosoft Inc）設(shè)計(jì)鑒定引物. 上游引物5CTCCATCGCCTCATTACCAT3，下游引

13、物5GAGGCAAACGTCACTGACAA3，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為447 bp（542988）. 引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，稀釋濃度 25 molL-1. 以提取的質(zhì)粒為模板，50 L反應(yīng)體系中含有模板RNA 4 L，Taq DNA聚合酶（3 UL-1，華美生物工程公司）1.5 L，引物各2 L，10PCR Buffer（MgCl2Free） 5 L，MgCl2（25 mmolL-1） 2 L，4dNTP（2.5 mmolL-1） 4 L，滅菌去離子水29.5 L. 循環(huán)參數(shù)為94 5 min，94 30 s，55 30 s，72 30 s，35個(gè)循環(huán)；72延伸7 min. 取

14、5 L行2 gL-1瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)擴(kuò)增結(jié)果， 標(biāo)準(zhǔn)分子量marker為DL200015 000 DNA marker. 以PCR產(chǎn)物純化試劑盒按說(shuō)明純化PCR產(chǎn)物，乙醇沉淀法濃縮. 用地高辛標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒（德國(guó)Boehringer Mannheim）標(biāo)記探針并進(jìn)行檢測(cè)，按試劑盒說(shuō)明操作. 置-20冰箱保存?zhèn)溆? 1.2.4SeP mRNA的原位雜交檢測(cè)組織切片預(yù)處理：切片脫蠟至水，2 mLL-1 Triton X100處理15 min，0.2 molL-1鹽酸酸化15 min，5 mgL-1蛋白酶K消化15 min，充分干燥. 雜交：向組織上滴加預(yù)雜交液37孵育1 h. 將雜交液100變

15、性10 min，-20放置10 min，滴加于組織上，2SSC濕盒內(nèi)37雜交過(guò)夜. 洗滌、顯色：2.0SSC，1.0SSC，0.5SSC，Buffer充分洗滌，正常山羊血清封閉30 min，加DigAp （1500）37孵育2 h. Buffer洗滌，Buffer平衡組織，NBT/BCIP避光充分顯色，清水終止反應(yīng)，脫水、透明、封片，在光鏡下觀察結(jié)果. 設(shè)不加探針的預(yù)雜交液代替雜交液為空白對(duì)照. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 采用2檢驗(yàn)及確切概率法進(jìn)行組間比較，以P0.05為有顯著性差異. 2結(jié)果 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果在紫外燈下觀察，在靠近500 bp的DNA Marker條帶處可見(jiàn)明亮條帶，大小約

16、為450 bp，說(shuō)明產(chǎn)物大小與預(yù)期相符(Fig 1). 圖1PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 (略) 以SeP cDNA探針進(jìn)行原位 2結(jié)果 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果在紫外燈下觀察，在靠近500 bp的DNA Marker條帶處可見(jiàn)明亮條帶，大小約為450 bp，說(shuō)明產(chǎn)物大小與預(yù)期相符(Fig 1). 圖1PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(略) 以SeP cDNA探針進(jìn)行原位雜交檢測(cè)，正常肝組織、肝硬化組織和HCC的組織間質(zhì)均有SeP mRNA表達(dá)，特別是脈管區(qū)的血管內(nèi)皮以及淋巴細(xì)胞表達(dá)豐富，3組無(wú)差別. 正常肝組織、肝硬化組織、HCC組織中的肝細(xì)胞胞質(zhì)和（或）胞核的表達(dá)不同，以其內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)色

17、顆粒者為陽(yáng)性，其陽(yáng)性率分別為正常肝組織84.6%（11/13），肝硬化組織50.0%（10/20），HCC組織20.0%（6/30）. 3種肝細(xì)胞中SeP mRNA表達(dá)具有顯著性差異（P0.05；2=4.96，P0.05）. 其中正常肝細(xì)胞和肝硬化肝細(xì)胞的胞質(zhì)及胞核內(nèi)均出現(xiàn)藍(lán)色的陽(yáng)性顆粒，在胞核主要分布在核仁與核周；正常肝細(xì)胞的核陽(yáng)性強(qiáng)于肝硬化肝細(xì)胞（Fig 2）. HCC細(xì)胞中胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)明顯的藍(lán)色顆粒，而胞核偶有表達(dá)（Fig 3A）. 空白對(duì)照細(xì)胞呈陰性，胞質(zhì)和胞核內(nèi)均無(wú)藍(lán)色的陽(yáng)性顆粒. Sep mRNA在肝臟組織間質(zhì)中表達(dá)于基質(zhì)中(Fig 3B). 圖2SeP mRNA在肝細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中

18、的表達(dá)(略) 3討論 SeP是一種細(xì)胞外糖蛋白4，由硒元素和蛋白以硒半胱氨酸（Sec）的方式結(jié)合而成，每個(gè)肽鏈含有1012個(gè)Sec殘基. SeP主要由肝細(xì)胞分泌，此外腦星形膠質(zhì)細(xì)胞、小腦顆粒細(xì)胞、橫紋肌細(xì)胞也可以產(chǎn)生5. 原位雜交結(jié)果顯示SeP mRNA在正常肝組織、肝硬化組織、肝細(xì)胞肝癌的組織間質(zhì)均有表達(dá)，包括纖維結(jié)締組織及血管內(nèi)皮等部位. 這與以往的研究結(jié)論一致，即SeP可以表達(dá)于人類(lèi)脈管系統(tǒng)的血管內(nèi)皮6；免疫組化研究證實(shí)，SeP主要表達(dá)于小鼠的肝、腎、腦的內(nèi)皮細(xì)胞7. SeP可與血漿中的血細(xì)胞膜結(jié)合，組織間質(zhì)可能是SeP發(fā)揮作用的目標(biāo)，SeP的堿 圖3SeP mRNA在肝癌細(xì)胞(A)和肝

19、臟組織間質(zhì)中(B)的表達(dá)(略) 基片段可能會(huì)促進(jìn)其與細(xì)胞表面和間質(zhì)中糖質(zhì)的結(jié)合. 肝臟組織中大量淋巴細(xì)胞也呈現(xiàn)SeP mRNA陽(yáng)性. 我們的結(jié)果顯示正常肝細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率為84.6%，主要表達(dá)在胞質(zhì)及胞核，在胞核中主要分布在核仁與核周，表明SeP mRNA由肝細(xì)胞產(chǎn)生后分泌入胞質(zhì). 肝硬化組肝細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率50.0%，較正常肝細(xì)胞明顯下降，可能是由于肝細(xì)胞病變受損后，其合成SeP mRNA的能力下降. 肝癌細(xì)胞中SeP mRNA陽(yáng)性表達(dá)率最低，且主要表達(dá)在胞質(zhì)內(nèi)，胞核幾無(wú)表達(dá)，差異顯著. 說(shuō)明肝癌細(xì)胞中SeP基因可能有變異或缺失，此與肝癌的發(fā)生有一定關(guān)系. 結(jié)腸腺瘤組織中SeP mRNA的表達(dá)較

20、癌周正常組織明顯下降8. 在前列腺癌細(xì)胞中SeP基因水平也呈下降趨勢(shì)9. 有研究利用二氨基萘熒光分析法測(cè)定肝癌組織及癌旁組織硒水平，發(fā)現(xiàn)肝癌組織中硒水平明顯低于癌旁組織10. SeP蛋白是組織及血漿硒的主要供應(yīng)蛋白11，因此癌組織中SeP基因變異或缺失可能正是肝癌組織硒含量較癌旁組織降低的主要原因. 大宗人群檢測(cè)表明，血清SeP蛋白的低水平與呼吸道、消化道腫瘤發(fā)生有關(guān)12. 既往認(rèn)為SeP蛋白的合成主要由硒的供給決定，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)在人肝癌細(xì)胞中SeP基因缺失，說(shuō)明SeP蛋白的減少可能不僅僅是由于缺乏硒所造成，應(yīng)考慮SeP基因變異或缺失與其有關(guān). 在人肝癌細(xì)胞中，IFN，TNF，IL1及TGF1可

21、抑制SeP啟動(dòng)子的活性，從而可降低SeP mRNA的表達(dá)水平，使SeP蛋白的產(chǎn)生減少13，14，因此可能在肝癌組織中一些細(xì)胞因子的異常導(dǎo)致了SeP mRNA的缺失. SeP具有抗氧化防御作用，然而SeP在抗癌中的具體作用，從目前實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看尚不清楚，仍需進(jìn)一步的研究. 【參考文獻(xiàn)】 1 Liu XD, Gong SM, Yang RH, Chen JY, Deng ZR, Liu XH. Apoptosis of retina nervous cells induced by microwave and theprotective effects of selenium J. Disi Jun

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