enascin-R多克隆抗體的制備及其被動(dòng)免疫治療大鼠脊髓損

1、南方醫(yī)科大學(xué)級(jí)博士學(xué)位論文多克隆抗體的制備及其被動(dòng)免疫治療大鼠脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究課題來(lái)源：國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（）學(xué)位申請(qǐng)人導(dǎo)專師業(yè)酉建徐如祥教授神經(jīng)外科學(xué)科學(xué)型姓名名稱型次院培養(yǎng)類培養(yǎng)層所在博士研究生第二臨床醫(yī)學(xué)院鐘世鎮(zhèn)院士學(xué)答辯委員會(huì)主席答辯委員會(huì)委員戴建武教授張成崗教授張志文教授張劍寧教授殷勤偉教授戴宜武教授徐如祥教授年月日廣州博士學(xué)位論文唑剃多克隆抗體的制備及其被動(dòng)免疫治療大鼠脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究博士研究生：酉建指導(dǎo)教師：徐如祥教授摘要脊髓損傷（阱）這一重大疾病在全球呈現(xiàn)高發(fā)生率、高致死率和高致殘率的特點(diǎn)，其救治一直是世界性的醫(yī)學(xué)難題之一。相對(duì)于周圍神經(jīng)損傷后的自發(fā)性修復(fù)，成年哺乳動(dòng)

2、物中樞神經(jīng)系統(tǒng)（，）受損后，被截?cái)嗟纳窠?jīng)元軸突再生能力極其有限，造成的運(yùn)動(dòng)感覺(jué)等功能障礙難以恢復(fù)。因此，脊髓損傷后的神經(jīng)再生與修復(fù)仍是目前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。上世紀(jì)八十年代，及其同事突破性的研究顛覆了神經(jīng)科學(xué)界的傳統(tǒng)觀念，他們發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)軸突再生困難并非是缺乏再生能力，而是中樞內(nèi)微環(huán)境限制了神經(jīng)軸突的再生。近年來(lái)的研究表明，有兩個(gè)主要因素形成了不利于軸突再生的微環(huán)境。首先是少突膠質(zhì)細(xì)胞及其形成的髓鞘上含有多種軸突生長(zhǎng)抑制因子，在受損后被大量釋放出來(lái)，如、髓鞘相關(guān)糖蛋白（）、少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白（），三者都是通過(guò)與神經(jīng)元上的受體復(fù)合物結(jié)合，激活介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白，導(dǎo)致生長(zhǎng)錐的塌

3、陷而抑制軸突再生。阻礙中樞神經(jīng)軸突再生的另一重要原因是膠質(zhì)瘢痕，它主要是由膠質(zhì)細(xì)胞和結(jié)締組織成分構(gòu)成，被認(rèn)為是阻礙再生軸突穿越的機(jī)械屏障。此外，由瘢痕細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)成分在損傷區(qū)的堆積也是重要的抑制因素，主要代表是硫酸軟骨素蛋白多糖（）和細(xì)胞粘合素（，）。摘要是日前已知的一個(gè)抑制神經(jīng)軸突冉牛的重要因子。它屬于細(xì)胞粘合素家族，該家族還包括、一。是一個(gè)大的多域糖蛋白，形聚體（型）或三聚體（弧型），它存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，豐要巾少突膠質(zhì)細(xì)胞和某些類型的神經(jīng)元表達(dá)并分泌到細(xì)胞外基質(zhì)中。體外研究發(fā)現(xiàn)，蛋白對(duì)神經(jīng)元有抗細(xì)胞粘附的排斥作用，以及阻礙神經(jīng)突起生長(zhǎng)的抑制作用。這些作用足由蛋的結(jié)構(gòu)域與神經(jīng)元生長(zhǎng)

4、錐上的細(xì)胞粘附分子結(jié)合后介導(dǎo)的。脊髓損傷后，傷灶處的表達(dá)上調(diào)。有學(xué)者利用基因敲除鼠發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后口以阻礙運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元與其他神經(jīng)元重建突觸聯(lián)系，從而限制了！后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。對(duì)基因敲除鼠面神經(jīng)損傷模型的研究也發(fā)現(xiàn)不利于神經(jīng)損傷后的功能恢復(fù)。為了消除軸突再生抑制因子的抑制效應(yīng)，神經(jīng)科學(xué)家們常常應(yīng)用抗體阻斷抑制因子或其受體，以此達(dá)到促進(jìn)神經(jīng)元軸突再生及脊髓損傷等損傷后功能恢復(fù)的目的。如采用單克隆抗體和以封閉其抑制活性的策略就收到了很好的療效。除了直接應(yīng)用特異性抗體進(jìn)行封閉即被動(dòng)免疫治療外，還可以通過(guò)主動(dòng)免疫刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的中和抗體。相關(guān)研究表明通過(guò)不同主動(dòng)免疫方式刺激機(jī)體產(chǎn)生對(duì)抗相關(guān)抑制性因了的抗體

5、，能夠有效的促進(jìn)損傷軸突的再生及功能恢復(fù)。然而，雖然主動(dòng)免疫能夠起到良好的作用，但是在臨床實(shí)踐中，絕大多數(shù)人也許不會(huì)考慮在受傷前就進(jìn)行此種疫苗的接種。再者，損傷后急性期單獨(dú)采用主動(dòng)免疫方式接種，機(jī)體也需要經(jīng)歷較長(zhǎng)的一段時(shí)間后才能夠產(chǎn)生保護(hù)性抗體，而實(shí)際上此時(shí)早期干預(yù)治療很有必要，有利于傷后的康復(fù)。因此，在損傷急性期通過(guò)被動(dòng)免疫治療應(yīng)用中和抗體消除或削弱相關(guān)抑制性因子可能更具有臨床可行性。綜上，已經(jīng)被證實(shí)能抑制神經(jīng)軸突再生并阻礙脊髓損傷后的功能恢復(fù)，兇此以為治療靶點(diǎn)，開(kāi)發(fā)拮抗功能的藥物，如的抗體藥物等，將為臨床上治療脊髓損傷提供新的選擇和手段。本研究擬以人蛋白結(jié)構(gòu)域?yàn)榘悬c(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成多肽片段作為

6、抗原制備兔源性丁多克隆抗體，檢博士學(xué)位論文測(cè)其效價(jià)和特異：性，并在體外觀察其對(duì)大鼠皮層神經(jīng)元突起牛長(zhǎng)勺影響：最后，建立大鼠背側(cè)半橫斷脊髓損傷模型，對(duì)其進(jìn)行多克隆抗體被動(dòng)免疫治療，刪察抗體對(duì)脊髓損傷大鼠的療效。第一部分多克隆抗體的制備及鑒定目的：以人蛋白結(jié)構(gòu)域?yàn)榘悬c(diǎn)制備多克隆抗體，檢測(cè)其效價(jià)，并初步驗(yàn)證其對(duì)靶分子的特異性識(shí)別能力。方法：根據(jù)人蛋白結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列信息設(shè)計(jì)多肽抗原，序列長(zhǎng)度在個(gè)氨基酸殘基之間，合成后與載體蛋白相偶聯(lián)，充分乳化后免疫新西蘭大白兔，免疫前采集兔血清用作陰性對(duì)照。經(jīng)過(guò)一次基礎(chǔ)免疫和次加強(qiáng)免疫，測(cè)定抗體效價(jià)達(dá)標(biāo)后放血并分離血清，獲得的抗血清采抗原親和純化。間接法測(cè)定純化后

7、抗體的效價(jià)。以人重組蛋白為上樣蛋白，制備的多克隆抗體為一抗，法檢驗(yàn)抗體的特異性。結(jié)果：查詢數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取人蛋白結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列信息（，：），將肽段確定為多肽抗原，經(jīng)合成獲得多肽，純度。免疫前獲得陰性對(duì)照血清。第三次加強(qiáng)免疫后少量采血行法測(cè)定抗血清中多抗效價(jià)：，達(dá)到預(yù)期效價(jià)，耳緣靜脈放血收獲血液共，制備抗血清，經(jīng)抗原親和純化后獲得多克隆抗體，法測(cè)得濃度為。經(jīng)間接法檢測(cè)，結(jié)果顯示，在多抗側(cè)相對(duì)分子量約處出現(xiàn)陽(yáng)性條帶，而對(duì)照血清側(cè)為陰性，表明多抗能與上樣的人重組蛋白結(jié)合。結(jié)論：通過(guò)合成多肽抗原，成功制備了兔源性多克隆抗體，其效價(jià)高、多抗滴度：，。對(duì)蛋白有良好的特異結(jié)合性，為進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。摘要

8、第二部分多克隆抗體對(duì)大鼠皮層神經(jīng)元及其突起生長(zhǎng)的影響目的：了解體外培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元及其突起在蛋白上的生長(zhǎng)情況，以及多克隆抗體劉其柏?zé)o影響，為多克隆抗體的應(yīng)提供體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。方法：在絀胞多孔培養(yǎng)板上包被蛋白，經(jīng)過(guò)免疫前血清或者多克隆抗體處理后，加入原代培養(yǎng)的新生大鼠皮層神經(jīng)元（小組織塊、單層細(xì)胞），間接免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法對(duì)神經(jīng)元及其突起進(jìn)行染色。定性觀察不同包被基質(zhì)的邊界抑制效應(yīng)以及不同基質(zhì)環(huán)境中神經(jīng)元的黏附數(shù)量，利用軟件對(duì)神經(jīng)元突起進(jìn)行長(zhǎng)度測(cè)量和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：蛋白存在區(qū)域的邊界抑制效應(yīng)十分明顯，大鼠皮層神經(jīng)元的突起不能長(zhǎng)入蛋白的涂布區(qū)域，在其邊緣停止生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)向生長(zhǎng)，單純包被則沒(méi)有此現(xiàn)象

9、，此外蛋白區(qū)域內(nèi)黏附的神經(jīng)元數(shù)目很少。多克隆抗體處理后能減弱這些抑制效應(yīng)，但免疫前血清沒(méi)有類似作用。對(duì)三組神經(jīng)元突起長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)量和統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，三組數(shù)值差異具有顯著性（，），其中正常對(duì)照組神經(jīng)元的平均突起長(zhǎng)度為，培養(yǎng)在蛋白免疫前血清包被基質(zhì)卜的神經(jīng)元，突起生長(zhǎng)受到顯著抑制，平均突起長(zhǎng)度為：岬（）。當(dāng)基質(zhì)經(jīng)過(guò)多克隆抗體處理后，蛋白的抑制作用得到部分逆轉(zhuǎn)，神經(jīng)元突起長(zhǎng)度為岬（），但與正常對(duì)照組相比仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（）。結(jié)論：在體外，。蛋白能明顯抑制神經(jīng)元的黏附及突起的生長(zhǎng)伸展，多克隆抗體的應(yīng)用能有效地部分阻斷蛋白對(duì)神經(jīng)元及其突起的抑制作用。第三部分脊髓半橫斷模型大鼠多克隆抗體被動(dòng)免疫治療的效果評(píng)估目

10、的：建立大鼠背側(cè)半橫斷脊髓損傷模型，應(yīng)用多克隆抗體被動(dòng)免疫治療，觀察體內(nèi)治療效果并對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行初步探討。博士學(xué)位論文方法：只成年雌性人鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（只）、對(duì)照組（只）和實(shí)驗(yàn)組（只）。假于術(shù)組大鼠僅接受椎板切開(kāi)術(shù)，另外兩組均行脊髓背側(cè)半橫斷術(shù)，并在皮下埋簧微量滲透泉，分別局部給兔免疫時(shí)血清和多克隆抗體。術(shù)后天和天取備組脊髓作冰凍切片，免疫組織化學(xué)染包檢測(cè)滲透入脊髓損傷灶處的兔源性抗體。對(duì)術(shù)后天的組織切片行間接免疫熒光染色檢測(cè)損傷灶及其周圍組織蛋門(mén)表達(dá)情況。術(shù)后天，提取各組脊髓組織蛋白并測(cè)定蛋白濃度，利用蛋質(zhì)沉淀技術(shù)及檢測(cè)方法對(duì)各組脊髓損傷處組織行活性分析。術(shù)后天及每周，對(duì)各組動(dòng)物盲法行行

11、為學(xué)評(píng)分以評(píng)價(jià)大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)情況。結(jié)果：兔源性抗體滲透性分析：術(shù)后天，假手術(shù)組脊髓切片兔源性抗體免疫組化染色陰性，對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組脊髓損傷處免疫組化染色均為陽(yáng)性；術(shù)后天，對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組脊髓傷灶及其周圍組織仍可檢測(cè)到兔源性抗體。多抗結(jié)合特異性分析：實(shí)驗(yàn)組切片染色強(qiáng)度明顯弱于對(duì)照組，但與假手術(shù)組相比免疫強(qiáng)度稍強(qiáng)：對(duì)各組免疫熒光染色的值進(jìn)行定量統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，三組值差異具有顯著性（，），對(duì)照組值顯著高于假手術(shù)組（氏），實(shí)驗(yàn)組值比對(duì)照組顯著降低（尸），但仍高于假手術(shù)組（）。脊髓組織活化信號(hào)檢測(cè)：各組蛋白總表達(dá)量無(wú)差異，但活化蛋白量以對(duì)照組最高，實(shí)驗(yàn)組次之，假手術(shù)組最少。以總蛋白為校正標(biāo)準(zhǔn)，獲取活化蛋白

12、光密度指數(shù)為統(tǒng)計(jì)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，三組光密度指數(shù)值差異具有顯著性（廬，），對(duì)照組的活性顯著高于假手術(shù)組（戶），實(shí)驗(yàn)組的活性比對(duì)照組顯著降低（），但仍高于假手術(shù)組（）。評(píng)分結(jié)果：在周的觀察期內(nèi)，大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能逐漸恢復(fù)，但從天開(kāi)始一直到觀察終點(diǎn)天，在各固定時(shí)問(wèn)點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組大鼠的評(píng)分始終要高于對(duì)照組（氏），總體來(lái)說(shuō)，兩組評(píng)分也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（，摘要）。滅時(shí)，評(píng)分達(dá)到或超過(guò)分的比率，實(shí)驗(yàn)組要高于對(duì)照組（），統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異（）；天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的這一比率也要高于對(duì)照組（），萍異具有姓著性（）。結(jié)論：通過(guò)微量滲透壓泵的局部給藥，多克隆抗體能在不少于刷的時(shí)間窗內(nèi)持續(xù)滲透入損傷脊髓組織，并且能夠與組

13、織中大部分上調(diào)的蛋白特異性結(jié)合。多抗可顯著削弱胞內(nèi)軸突再生抑制信號(hào)的激活，從而促進(jìn)脊髓損傷后神經(jīng)元軸突的再生，以及損傷脊髓的功能恢復(fù)。總結(jié)本研究制備了一種釧對(duì)軸突再生抑制因子的多克隆抗體，該抗體足以人蛋白結(jié)構(gòu)域?yàn)榘悬c(diǎn)，通過(guò)合成多肽抗原制備的，經(jīng)鑒定具有高效價(jià)與良好的特異性，對(duì)其在體外和體內(nèi)的功能進(jìn)行檢測(cè)和評(píng)估發(fā)現(xiàn)，該抗體能顯著削弱蛋白對(duì)神經(jīng)元及其突起的抑制作用，阻礙中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的神經(jīng)抑制信號(hào)傳遞，促進(jìn)受損脊髓的功能恢復(fù)。但是，這一中和抗體的生物安全性還需要進(jìn)一步評(píng)估，其相關(guān)的作用機(jī)制也有待于闡明。木研究提供的證據(jù)表明：拮抗劑的被動(dòng)免疫具有治療脊髓損傷的潛在應(yīng)用價(jià)值，為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷提供了一種新的、有前途的手段和策略。關(guān)鍵詞：脊髓損傷軸突再生被動(dòng)免疫治療多克隆抗體多肽抗原博士學(xué)位論文：（，（），（）（），（）（），彤一。（）（），博士學(xué)位論文，；，；，：，：（），（）：（）：，：（）（）（：），博士學(xué)位論文（）（）：，：，：，：（），：，（仁，），土（），（），（）：，：，：博士學(xué)位論文：（），（。），（），：，：（廬，尸蘭）（）（），（）：（艮，）。（）妒），（尸）：，儼），士（，），（，）（。，尸：）：