RhoA基因在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)及其意義

1、RhoA基因在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)及其意義*         06-07-01 11:05:00     編輯：studa20         作者：王德盛，竇科峰，項(xiàng)紅軍，李 郁，宋振順，趙青川【摘要】  目的  探討RhoA基因與肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法  采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）在半定量水平檢測(cè)42例肝細(xì)胞癌及其相對(duì)應(yīng)的癌旁肝組織

2、中RhoA mRNA的表達(dá)，同時(shí)采用PCR產(chǎn)物單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）銀染法檢測(cè)RhoA基因的突變情況。結(jié)果  本組42例肝癌組織中RhoA mRNA光密度相對(duì)值明顯高于癌旁肝組織（P<0.01）；有門靜脈癌栓者其癌組織中RhoA mRNA光密度相對(duì)值明顯高于無(wú)癌栓者（P<0.05）。經(jīng)PCR-SSCP銀染法分析未發(fā)現(xiàn)異常泳動(dòng)條帶。結(jié)論  RhoA基因在肝細(xì)胞肝癌進(jìn)展中起重要作用，并可能與肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)。        【關(guān)鍵詞】  肝癌；RhoA；基因表達(dá)；RT-PCR &

3、#160;          【Abstract】  Objective  To investigate the expression of RhoA gene in hepatocellular carcinoma and to evaluate the relationship between RhoA gene expression and invasion of hepatocellular carcinoma.Methods  The mRNA expression

4、 of RhoA gene was examined by RT-PCR in 42 cases of hepatocellular carcinoma and adjacent non-cancerous tissue.In addition，the mutation of RhoA gene was examined by PCR-SSCP.Results  The opacity density (OD) of RhoA mRNA expression in hepatocellular carcinoma tissues was significantly higher th

5、an that in adjacent non-cancerous tissues (P<0.01）.The OD of RhoA mRNA expression in hepatocellular carcinoma with intrahepatic metastasis was significantly higher than that without intrahepatic metastasis (P<0.05）.Mutation was not found in RhoA gene by PCR-SSCP examination.Conclusion  Th

6、e RhoA gene may be related to malignant transformation and development of hepatocellular carcinoma probably by overexpression.        【Key words】  hepatocellular carcinoma；RhoA；gene expression；RT-PCR        原發(fā)性肝癌發(fā)生率高，手術(shù)切除是目前最主要的治療方法。盡管

7、隨著影像診斷和外科技術(shù)的進(jìn)步，尤其是肝移植在肝癌中的運(yùn)用，肝癌的預(yù)后已經(jīng)有所改善，但肝臟的特殊解剖結(jié)構(gòu)和功能決定著肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)率高，術(shù)后復(fù)發(fā)已成為影響患者預(yù)后的主要問(wèn)題。肝癌侵襲轉(zhuǎn)移是主要的影響因素之一，深入研究肝癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制對(duì)于改善肝癌患者的總體預(yù)后有重要作用。Rho蛋白和腫瘤發(fā)生有密切的關(guān)系，參與腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程。Rho家族屬于Ras超家族，是重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子，在細(xì)胞的許多基礎(chǔ)生命活動(dòng)中起關(guān)鍵的作用1。目前研究證實(shí)，Rho蛋白特別是RhoA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，在結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、頭頸癌等均報(bào)道有RhoA表達(dá)的異常增高2。本研究利用RT-PCR技術(shù)及分子定量成像系統(tǒng)分

8、析42例肝細(xì)胞肝癌（HCC）病人的肝癌組織及癌旁肝組織中RhoA mRNA的表達(dá)，并探討其臨床意義。        1  材料與方法        1.1  材料        1.1.1  主要試劑及儀器  RT-PCR試劑盒購(gòu)自MBI公司；dNTP及DNAmarker購(gòu)自Promega公司；瓊脂糖、TRIzol試劑及DEPC購(gòu)于Gibco公司。凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Genes

9、is公司；UV-3000型紫外分析儀購(gòu)自上海天能科技有限公司；PE-2400TMPCR儀購(gòu)自美國(guó)Perkin。        1.1.2  標(biāo)本來(lái)源  42例患者的原發(fā)性肝癌組織及相對(duì)應(yīng)的癌旁肝組織來(lái)自第四軍醫(yī)大學(xué)附屬第一醫(yī)院2004年8月2005年3月的新鮮手術(shù)標(biāo)本，離體后30min內(nèi)分裝保存于液氮罐中，所有病例均附癌旁肝組織作為對(duì)照，分別伴有慢性炎癥、纖維化和肝硬化，全部標(biāo)本均經(jīng)病理科醫(yī)師切片確診。        1.2  方法 &

10、#160;      1.2.1  擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)  以GenBank中人RhoA基因全長(zhǎng)序列為模板，按引物設(shè)計(jì)原則予以設(shè)計(jì)，采用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，其序列如下（U，D分別表示上游和下游引物）：RhoA U1 5CTGGTGATTGTTGTTGGTGATGG3，U2 5GATTCGTTGCCTGAGCAATG3，D 5GCGATCATAATCTT-CCTGCC3。Bactin引物序列：上游引物，5CGGGAAATC-GTGAT3；下游引物，5GAACTTTGGGGG ATGCTCGC3。其中U1、U2為RhoA

11、上游引物，分別用于定量RT-PCR和PCR-SSCP，D為下游引物。RhoA產(chǎn)物分別為183bp和221bp。        1.2.2  總RNA提取  組織總RNA的抽提取：0.5g組織塊，加入Trizol試劑1ml，在電動(dòng)玻璃勻漿器中，充分勻漿。將全部勻漿液轉(zhuǎn)入1ml離心管中，加0.25ml氯仿，充分振蕩混勻，冰浴15min。低溫 13000r/min離心15min。小心吸取上層水相至另一1.5ml離心管中，注意不要吸到蛋白層或有機(jī)相，加等體積異丙醇，搖勻，室溫放置10min，低溫13000r/min離心15

12、min，沉淀RNA。加70%酒精漂洗沉淀，5000r/min，離心10min，小心棄去酒精，空氣中干燥10min。經(jīng)電泳證實(shí)有兩條明顯的18S及28S條帶，用紫外可見(jiàn)分光光度儀檢測(cè)RNA的純度及含量。        1.2.3  RT-PCR擴(kuò)增RhoA mRNA及鑒定  cDNA制備：應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，總RNA投入量為2g，使用隨機(jī)引物。第一鏈cDNA合成后終體積10m，具體方法按說(shuō)明操作。RhoA與Bactin反應(yīng)同管進(jìn)行，反應(yīng)終體積為50l，反應(yīng)條件為94 30s，57 30s，72 40s，共25個(gè)循環(huán)。P

13、CR產(chǎn)物在含0.5g/ml溴化乙錠的1.0%瓊脂糖凝膠上電泳，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行掃描分析。利用分析軟件計(jì)算并比較每一對(duì)樣品中RhoA mRNA與B-actin的光密度的相對(duì)比值，從而獲得每對(duì)樣品中肝癌組織及癌旁肝組織RhoA mRNA表達(dá)的相對(duì)含量。        1.2.4  PCR-SSCP分析  PCR反應(yīng)試劑基本同前，仍用cDNA模板，改用U2和D引物擴(kuò)增RhoA基因，反應(yīng)條件為94 1min，57 2min，72 1min，共擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物變性后行聚丙烯酰胺凝膠電泳，觀察泳動(dòng)條帶是否異位以判斷突變情況。        1.3  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法  所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，用SPSS10.0進(jìn)行分析，組間比較用Students t檢驗(yàn)，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。        2  結(jié)果        將各樣品RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)分子定量成像系統(tǒng)分析，以Bactin條帶為內(nèi)參照，