血清和關(guān)節(jié)液中YKL-40對骨性關(guān)節(jié)炎

1、 導 師: 衛(wèi)小春教授研究生: 王國金科研開題報告關(guān)節(jié)軟骨特性：光關(guān)節(jié)軟骨特性：光滑、耐磨、富有彈滑、耐磨、富有彈性及一些特有的機性及一些特有的機械性能械性能 功能：傳導載荷、功能：傳導載荷、吸收震蕩、潤滑關(guān)吸收震蕩、潤滑關(guān)節(jié)節(jié) 由于關(guān)節(jié)軟骨沒有血管、神經(jīng)，一旦損傷，很難自我修復(once destoryed，is not repaired)關(guān)節(jié)軟骨是一種高度關(guān)節(jié)軟骨是一種高度分化的組織，由于缺分化的組織，由于缺乏血供，損傷后很難乏血供，損傷后很難自我修復自我修復（once destoryed，is not repaired）國內(nèi)外曾用多種修復方法來治療軟骨損傷，如刨削成形術(shù)、微骨折術(shù)、軟骨下

2、骨鉆孔術(shù)等，其基本原理是利用生物或機械因素使骨髓中的多能干細胞到達軟骨缺損區(qū)，并進一步分化為軟骨及骨組織。研究發(fā)現(xiàn)形成的軟骨為纖維軟骨或類透明軟骨，且該軟骨容易發(fā)生退變。 骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)生物學標志物(Biomarkers, Biological Markers,marker. BM)的研究領(lǐng)域。 采用橫斷面研究的方法,對OA體液中生物學標志物之一 YKL-40(又稱人軟骨糖蛋白-39,human cartilage glycoprtein-39,HC gp-39/GP-39)進行的臨床診斷性試驗 研究。 OA是引起關(guān)節(jié)疼痛和活動受限的常見病變,是世界性的關(guān)節(jié)

3、疾病。 在美國50歲以上的人群中已成為勞動力喪失的第二大疾患。 在我國OA的發(fā)病率:農(nóng)村為9.6%,城市人群為4.9%。 OA是以疼痛、腫脹、活動受限、彈響，有時伴關(guān)節(jié)積液，以及不同程度的局部炎癥,但無全身癥狀為特點的關(guān)節(jié)病。 OA的病理生理學特點： 負重部位的不規(guī)則軟骨喪失； 軟骨下骨硬化、囊性變、邊緣骨贅形成 不同程度的滑膜炎癥。 目前臨床所通用的是1986年美國風濕病協(xié)會關(guān)于OA的診斷標準，主要是以癥狀+X線征像為依據(jù)的。 現(xiàn)有檢查手段對OA軟骨退變診斷的局限性 MRI X線 其征象改變比軟骨發(fā)生退變遲3-5年。 近年來國內(nèi)外學者欲在OA患者的體液中尋找理想的病變標志物，來及時反映關(guān)節(jié)軟

4、骨代謝狀態(tài)和局部病變的進展情況，揭示病情活動或預后，并為臨床提供療效評價的客觀依據(jù)。 美國國立衛(wèi)生研究院2000年建議用Biomarker取代marker,這樣可更好地揭示其生物學本質(zhì)。 大量實驗研究已發(fā)現(xiàn)許多能反映OA病情的BM： 反映骨代謝的BM； 反映軟骨代謝的BM； 反映滑膜代謝的BM。 YKL-40：可能是反映軟骨和滑膜代謝的BM之一。 近年來，國外開始進行臨床試驗研究。 合成代謝 I型膠原：型膠原：I型前膠原氨基端前肽型前膠原氨基端前肽, I型前膠原羧型前膠原羧基端前肽?；饲半摹?非膠原蛋白：骨特異性堿性磷酸酶非膠原蛋白：骨特異性堿性磷酸酶; 骨鈣素骨鈣素 。 分解代謝 I型膠原

5、：脫氧吡啶酚型膠原：脫氧吡啶酚, 吡啶酚吡啶酚; I型膠原氨基端型膠原氨基端端肽端肽, I型膠原羧基端端肽型膠原羧基端端肽-1,2 。 非膠原蛋白：血漿酒石酸鹽耐受性酸性磷酸酶非膠原蛋白：血漿酒石酸鹽耐受性酸性磷酸酶, 骨唾液蛋白。骨唾液蛋白。 合成代謝 型膠原：型膠原：型前膠原羧基端前肽型前膠原羧基端前肽, A型前膠原氨型前膠原氨基端前肽?；饲半?。 可聚蛋白多糖：硫酸軟骨素表位可聚蛋白多糖：硫酸軟骨素表位846, 3B3, 7D4。 其它蛋白：其它蛋白：YKL-40即人軟骨糖蛋白即人軟骨糖蛋白-39 分解代謝 型膠原：吡啶酚型膠原：吡啶酚; 型膠原新表位型膠原新表位COL2-3/4m, C

6、OL2-1/4N1; 型膠原羧基端端肽。型膠原羧基端端肽。 可聚蛋白多糖：可聚蛋白多糖片斷可聚蛋白多糖：可聚蛋白多糖片斷; 硫酸角質(zhì)素表位硫酸角質(zhì)素表位 5D4,AN9P1; 其它蛋白：軟骨寡聚基質(zhì)蛋白。其它蛋白：軟骨寡聚基質(zhì)蛋白。 合成代謝 I型和型和III型膠原：型膠原： I型前膠原羧基端前肽型前膠原羧基端前肽, III型前型前膠原氨基端前肽。膠原氨基端前肽。 非膠原蛋白：透明質(zhì)酸非膠原蛋白：透明質(zhì)酸; YKL-40 ; 軟骨寡聚基質(zhì)軟骨寡聚基質(zhì)蛋白蛋白; 基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制因子?；|(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制因子。 分解代謝 I型和型和III型膠原：葡萄糖型膠原：葡萄糖-半乳糖半乳糖

7、-吡啶酚吡啶酚; I型膠原型膠原羧基端端肽羧基端端肽-2。YKL-40（又稱人軟骨糖蛋白-39，human cartilage glycoprtein 39，HC gp-39/ GP-39） 在非泌乳期牛的乳清分泌物中被首次發(fā)現(xiàn)的。 來源：軟骨細胞、滑膜細胞、單核巨噬細胞和中性粒細胞等。 相對分子量為40 000的糖蛋白，含383個氨基酸。 由10個外顯子構(gòu)成的含開放讀碼框架完全互補cDNA序列編譯。 是殼質(zhì)酶(chitinase)糖蛋白家族的成員, 但不具備殼質(zhì)酶活性。目前YKL-40的相關(guān)研究主要集中于以下領(lǐng)域： 類風濕性關(guān)節(jié)炎； 骨性關(guān)節(jié)炎； 巨細胞性動脈炎； 肝纖維化； 乳腺癌和結(jié)腸直

8、腸癌，等等。雖然YKL-40的作用機制尚不清楚，但研究表明它與許多組織的重塑和細胞外基質(zhì)降解有關(guān)。關(guān)節(jié)液內(nèi)YKL-40是軟骨細胞和滑膜細胞的分泌產(chǎn)物。OA患者Volck ： YKL-40在關(guān)節(jié)液中含量增加； 血清水平也升高。Johansen報道：血清和關(guān)節(jié)液中YKL-40水平是反映滑膜炎時滑膜合成代謝水平的指標。Volk等的研究表明：YKL-40可能在OA的關(guān)節(jié)軟骨降解和重塑形中也起著重要作用。 YKL-40是一個反映滑膜和關(guān)節(jié)軟骨代謝的BM? 經(jīng)檢索十年的CBMDisc未發(fā)現(xiàn)國內(nèi)關(guān)于YKL-40在骨性關(guān)節(jié)炎方面的研究論文發(fā)表。 血清BM除反映關(guān)節(jié)的病情外，還可能受其它因素的影響： 生物節(jié)律的

9、影響 腸蠕動的影響 體育活動的影響 肝腎等疾病的影響 年齡和性別的影響 手術(shù)的影響 藥物因素的影響 多以O(shè)A患者X線征象的Kellgren&Lawrence分級作為“金標準”，來對照評價OA病情嚴重程度。 充分考慮混雜因素控制的相關(guān)論著也不多見。明確關(guān)節(jié)液（synovial fluid, SF）中YKL-40水平對膝OA的診斷價值；探討血清（Serum）中YKL-40水平對膝OA的診斷價值。 診斷試驗的“金標準” 關(guān)節(jié)鏡下關(guān)節(jié)軟骨損傷和滑膜炎病理變化程度的評分； WOMAC骨性關(guān)節(jié)炎指數(shù)（由患者自我評估）； X線的Kellgren&Lawrence分級，負重位X線的膝關(guān)節(jié)間隙寬度。 充分控制混

10、雜因素 探討血清YKL-40診斷價值。學術(shù)意義 可以明確YKL-40對OA的診斷價值； 可為OA的癥狀解釋、早期診斷及其分期提供一種實驗室檢查手段； 可為OA的治療提供一種療效評價的客觀指標； 可為進一步研究確定國人體液YKL-40的正常參考值奠定基礎(chǔ)。 經(jīng)濟效益 近期效益； 遠期效益。統(tǒng)計學分析統(tǒng)計學分析X線評價線評價體液體液YKL-40的檢測（的檢測（ELISA）體液標本的預處理和儲存體液標本的預處理和儲存OA病變程度的評價病變程度的評價術(shù)中關(guān)節(jié)鏡下觀察術(shù)中關(guān)節(jié)鏡下觀察采集關(guān)節(jié)液標本采集關(guān)節(jié)液標本采集血液標本采集血液標本膝關(guān)節(jié)鏡手術(shù)時膝關(guān)節(jié)鏡手術(shù)時術(shù)前化驗時術(shù)前化驗時病例選擇病例選擇關(guān)節(jié)軟

11、骨退變和滑關(guān)節(jié)軟骨退變和滑膜炎關(guān)節(jié)鏡分級膜炎關(guān)節(jié)鏡分級關(guān)節(jié)液和血關(guān)節(jié)液和血清清YKL-40濃度濃度Kellgren&Lawrence 分級分級技術(shù)路線技術(shù)路線功能評估功能評估WOMAC指數(shù)指數(shù)專業(yè)結(jié)論專業(yè)結(jié)論 體液標本的采集和預處理 體液標本的檢測 統(tǒng)計學的統(tǒng)計處理病例來源：山醫(yī)二院骨科行膝關(guān)節(jié)鏡檢查和膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的患者。擇入標準: 非發(fā)育期患者（年齡18歲）； 排除肝腎疾病、全身感染和癌癥等的患者； 體液標本采集前兩月未使用糖皮質(zhì)激素類藥物的患者。樣本含量：60例。 體液標本的采集、儲存前處理、儲存和取用、以及檢測前處理和檢測，應(yīng)依據(jù)課題技術(shù)規(guī)范進行。 本課題相關(guān)技術(shù)規(guī)范主要參考Poole

12、R. NIH White Paper: Biomakers, the Osteoarthritis Initiative (A Basis for Discussion). Ferbruary 3rd,2000.制定。體液標本的采集規(guī)范 血液標本在清晨6-8時空腹抽取靜脈血5ml，留存于無菌非抗凝試管中送檢。并應(yīng)限制病人在采集標本前活動。 關(guān)節(jié)液標本在行關(guān)節(jié)鏡手術(shù)時麻醉后采集：抽取關(guān)節(jié)液原液留存于無菌非抗凝試管中（盡量多抽?。?體液標本均應(yīng)在采樣后2小時內(nèi)進行離心處理： 血清標本：在至少600g，3000rpm， 10分鐘的條件下離心。 關(guān)節(jié)液標本：在2500g，4，15分鐘的條件下離心。

13、（4500rpm，20min）體液標本的儲存 標本離心后取上清液，經(jīng)快速冷凍后, -70條件下凍存。體液標本的取用 在室溫下復溫解凍。 標本避免反復凍融。 體液標本的檢測前處理 關(guān)節(jié)液標本應(yīng)先經(jīng)離心后，取上清液測定其含量； 血清標本不需進行特殊處理。 體液標本的檢測 ELISA法。臨床資料 一般資料； 臨床癥狀、體征； 問卷調(diào)查：WOMAC指數(shù)實驗室檢查資料 常規(guī)項目，血清型膠原。X線資料 關(guān)節(jié)間隙的寬度； Kellgren&Lawrence分級。 手術(shù)資料 關(guān)節(jié)軟骨損傷和滑膜炎程度的評分； 手術(shù)錄像資料。 手術(shù)中對關(guān)節(jié)內(nèi)組織的病變程度進行評價： 關(guān)節(jié)軟骨損傷：Outerbridge膝關(guān)節(jié)軟骨

14、損傷評分法； 滑膜炎：Ayral膝滑膜炎評分法。 術(shù)中對病變部位用探鉤進行相對測量，并注意留存錄像資料。關(guān)節(jié)組織的關(guān)節(jié)鏡征象評價標準 關(guān)節(jié)軟骨退變程度：Outerbridge法 ； 滑膜炎程度： Ayral膝滑膜炎評分法。OA病變程度的X線征象評價標準 Kellgren&Lawrence 分級； 負重位的膝關(guān)節(jié)間隙寬度。OA病變程度的患者自我評估標準 WOMAC骨性關(guān)節(jié)炎指數(shù)。 使用SPSS11.0軟件進行統(tǒng)計學分析 OA組和非OA組之間體液YKL-40水平的比較用多元協(xié)方差分析。 體液YKL-40水平與關(guān)節(jié)鏡下相關(guān)組織的病變程度評分之間用多元線性回歸。 體液YKL-40水平與膝關(guān)節(jié)間隙寬度或

15、WOMAC評分間用相關(guān)分析。 標本的采集、預處理和檢測等的標準化 嚴格依據(jù)課題技術(shù)規(guī)范進行，才能保證結(jié)果的有效性和可比性。 混雜因素的控制 探討血清YKL-40水平對OA診斷價值的關(guān)鍵。 生物節(jié)律影響的控制 血液標本的采集在固定時間（清晨6-8時）進行。 腸蠕動影響的控制 血液標本在清晨空腹時采集。 體育活動影響的控制 采集血液標本前限制病人的體育活動。 肝腎等疾病影響的控制 選擇肝腎功能均正常的病例； 若樣本含量不足時，用統(tǒng)計學方法進行控制。 經(jīng)術(shù)前檢查可排除全身感染和腫瘤等的影響。 年齡和性別影響的控制 采用統(tǒng)計學方法進行控制。 手術(shù)影響的控制 由于體液標本是在麻醉后手術(shù)前采集的，故麻醉的

16、影響可忽略。 藥物因素影響的控制 采集標本前兩月內(nèi)未使用糖皮質(zhì)激素類藥物。2005年1月2005年4月 文獻檢索，課題設(shè)計，課題技術(shù)規(guī)范的制定,開題報告。2005年5月2005年9月 標本的采集和預處理，臨床和手術(shù)資料的收集。2005年10月2005年12月 預實驗，部分體液標本YKL-40含量的測定，分析關(guān)節(jié)液和血清YKL-40水平與膝骨性關(guān)節(jié)炎WOMAC評分和X線分級的相關(guān)性。2006年1月2006年2月 體液標本YKL-40含量的測定，分析關(guān)節(jié)液和血清YKL-40水平與膝關(guān)節(jié)鏡下相關(guān)組織大體病理變化程度的相關(guān)性。2006年3月2006年6月 數(shù)據(jù)整理，統(tǒng)計分析，撰寫論文,論文答辯。 研究

17、人員 衛(wèi)小春教授 長期從事關(guān)節(jié)軟骨損傷的研究,具有豐富的臨床經(jīng)驗和很強的科研能力.能及時把握國際上關(guān)節(jié)軟骨損傷研究的最新進展。主持承擔國家863計劃一項及省部級科研項目多項，在國內(nèi)外期刊上發(fā)表論文多篇。 文獻和技術(shù)準備 已檢索并熟讀了大部分相關(guān)核心文獻，了解該領(lǐng)域的研究進展、YKL-40的檢測方法。 病源及標本來源 山醫(yī)二院骨科病源充足； 課題所需的體液標本較易獲得。 山醫(yī)二院所具備的實驗條件 手術(shù)室：關(guān)節(jié)鏡設(shè)備； 骨科實驗室：酶標儀及相關(guān)波長的濾光片、深低溫冰箱、低速離心機、高速離心機、電熱恒溫孵育箱、電子天平、普通冰箱； 放射科：拍片相關(guān)設(shè)備。 科研業(yè)務(wù)費 3000元 實驗材料費 7000

18、元 儀器設(shè)備費 4000元 協(xié)作費 1500元 科研組織費 2000元 合 計 17500元 Poole R. NIH White Paper: Biomakers, the Osteoarthritis Initiative (A Basis for Discussion). Ferbruary 3rd,2000.Morgante M, Metelli MR, Morgante D. Observations on the increased serum levels of YKL-40 in patients with rheumatoid arthritis and osteoarthr

19、itis. Minerva Med. 2001;92(3):151-3. Johansen JS, Olee T, Price PA, et al. Regulation of YKL-40 production by human articular chondrocytes. Arthritis Rheum. 2001;44(4):826-37. Volck B, Johansen JS, Stoltenberg M, et al. Studies on YKL-40 in knee joints of patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Involvement of YKL-40 in the joint pa