乙型肝炎核心抗體放射免疫定量試劑盒的研制

1、收稿日期:2003212223;修回日期:2004206210作者簡(jiǎn)介:官國(guó)英(1969,女(漢族,四川威遠(yuǎn)人,高級(jí)工程師,放射化學(xué)專業(yè)第17卷第3期2004年8月同位素Jou rnal of Iso topesV o l.17N o .3A ug .2004乙型肝炎核心抗體放射免疫定量試劑盒的研制官國(guó)英,孔繁信,王衍真,劉一兵,隗秀芳,王云艷(中國(guó)原子能科學(xué)研究院同位素研究所,北京102413摘要:以聚苯乙烯小球?yàn)楣滔噍d體,在小球表面包被一層基因工程制備的乙型肝炎核心抗原(HBc A g ,以125I 標(biāo)記的乙型肝炎核心抗體(125I 2A n ti 2HBc 作為標(biāo)記物,采用固相放射免疫競(jìng)

2、爭(zhēng)法研制成乙型肝炎核心抗體放射免疫定量試劑盒(A n ti 2HBc 2R I A 。本試劑盒的靈敏度為0.8N CU mL ,批內(nèi)變異系數(shù)<9.9%,批間變異系數(shù)<13.8%,回收率為92.6%109.2%。正常參考值為02.0N CU mL 。關(guān)鍵詞:乙型肝炎病毒(HBV ;乙型肝炎核心抗體(A n ti 2HBc ;固相放射免疫分析中圖分類(lèi)號(hào):TQ 46317;Q 615142文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):100027512(20040320143204病毒性肝炎是世界性重點(diǎn)研究課題之一,至今尚無(wú)特效治療措施。我國(guó)現(xiàn)有肝炎病人2700萬(wàn),每年新發(fā)病例900萬(wàn),乙型肝炎病毒攜帶者1

3、12億1,已嚴(yán)重影響了人們身體健康和正常生活,故對(duì)病毒性肝炎進(jìn)行早診斷,早治療,切斷傳染源和傳播途徑有重要的社會(huì)經(jīng)濟(jì)意義。乙型肝炎核心抗體(A n ti 2HB c 是針對(duì)乙型肝炎核心抗原(HB c A g 的抗體,不具有保護(hù)性,但卻是乙型肝炎感染的可靠指標(biāo),分為A n ti 2HB c 2IgG 和A n ti 2HB c 2Ig M ,前者低滴度時(shí)作為既往感染的指標(biāo),用于乙型肝炎流行病學(xué)的調(diào)查,高滴度時(shí)作為乙型肝炎感染的指標(biāo);后者出現(xiàn)于新感染早期,是乙型肝炎早期診斷的指標(biāo),同時(shí)也是乙型肝炎急性感染和復(fù)制活躍的指針2。定量測(cè)定乙型肝炎核心抗體含量,對(duì)于乙型肝炎的臨床診斷、治療效果評(píng)價(jià)、嚴(yán)格篩

4、選供血血源、阻斷乙型肝炎的傳播等有一定的參考價(jià)值。1材料與方法111試劑與儀器HB c A g :中美合資延春益康科學(xué)研究所產(chǎn)品;A n ti 2HB c 血清:中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所生物免疫制品室產(chǎn)品;A n ti 2HB c 參考標(biāo)準(zhǔn):中國(guó)藥品生物制品檢定所產(chǎn)品;新生牛血清:北京軍區(qū)獸醫(yī)防治中心產(chǎn)品;聚苯乙烯小球:北京門(mén)頭溝淤白塑料廠產(chǎn)品;125I 2N a I 溶液:放化純度99.9%,中國(guó)原子能科學(xué)研究院產(chǎn)品;FT 2630G微機(jī)多探頭計(jì)數(shù)器:北京核儀器廠產(chǎn)品。112實(shí)驗(yàn)方法1.2.1125I 2A n ti 2HB c 的制備采用氯胺T (Ch 2T 法3,標(biāo)記率70%,放化純度&

5、gt;90%,將原溶液稀釋到一定的放射性濃度作為工作液,分裝,凍干,4貯存?zhèn)溆谩?.2.2HB c A g 包被小球的制備將預(yù)先處理好的塑料小球倒入含HB c A g 0.02m o l L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(PB S 中,4過(guò)夜,封閉,分裝,4貯存?zhèn)溆谩?.2.3A n ti 2HB c 標(biāo)準(zhǔn)品的制備將A n ti 2HB c 母液標(biāo)定后進(jìn)行倍比稀釋,配制濃度依次為0、2、8、16、32、64、128N CU mL 系列標(biāo)準(zhǔn)品,分裝,4貯存?zhèn)溆谩?.2.4A n ti 2HB c 放射免疫分析程序?qū)⒎琶夤芑蚍磻?yīng)盤(pán)編號(hào),取100L 標(biāo)準(zhǔn)品或樣品和100L 125I 2A n ti 2

6、HB c ,加入相應(yīng)的管(孔中,各加入1粒HB c A g 包被小球,混勻,45水浴中溫育1.5h。吸出液相,用23mL蒸餾水洗滌3次,將小球轉(zhuǎn)入干凈試管中測(cè)量放射性計(jì)數(shù)率(m in-1,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣品中A n ti2HB c 的含量。2結(jié)果與分析211HBcAg包被條件的選擇2.1.1HB c A g包被滴度的選擇取HB c A g母液用0.02m o l L pH7.4PB S按11000、12000、13000、14000、16000稀釋成系列工作液,包被預(yù)先處理好的塑料小球,4過(guò)夜。按11214進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果列于表1。由表1可見(jiàn),包被滴度為13000時(shí),標(biāo)準(zhǔn)品含量為2N CU

7、mL的計(jì)數(shù)率與不含標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)的計(jì)數(shù)率之比小于0.5(國(guó)家衛(wèi)生部陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)4,抑制曲線符合免疫分析要求。表1HBcAg包被滴度實(shí)驗(yàn)包被滴度不同標(biāo)準(zhǔn)品濃度(N CU mL的放射性計(jì)數(shù)率 m in-1 02641281100020971161591157697120001983494438945651300019692838482734914000193794818441212160001896646874292012.1.2HB c A g包被時(shí)間選擇將在HB c A g包被液中的塑料小球分別于4放置8、16、24、48 h后,按11214進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果列于表2。由表2可見(jiàn),4包被16h已能滿足免

8、疫分析要求。表2HBcAg包被時(shí)間實(shí)驗(yàn)包被時(shí)間 h 不同標(biāo)準(zhǔn)品濃度(N CU mL的放射性計(jì)數(shù)率( m in02648149846568296 16193728132747 24193828155752 48194328219768212125I-An ti-HBc凍干品與液體標(biāo)記物穩(wěn)定性比較分別將125I2A n ti2HB c凍干品與液體標(biāo)記物于4存放30天后,按11214進(jìn)行放射免疫分析,結(jié)果列于表3。由表3可見(jiàn),標(biāo)記物的凍干品比液體穩(wěn)定性好,故選標(biāo)記物凍干品用于免疫分析。表3125I-An ti-HBc凍干品與液體穩(wěn)定性比較標(biāo)記物放置時(shí)間d不同標(biāo)準(zhǔn)品濃度(N CU mL的放射性計(jì)數(shù)率

9、m in-10264液體019984856879630173728032547凍干019482835575230183328269738213標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的選擇選用5種稀釋液配制標(biāo)準(zhǔn)品,不同稀釋液配制的標(biāo)準(zhǔn)品的放射免疫分析結(jié)果列于表4。對(duì)表4數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn),結(jié)果顯示,5種稀釋液配制的標(biāo)準(zhǔn)品的分析結(jié)果無(wú)顯著差異,P>0.05。從經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定性角度考慮,選用稀釋液 。表4An ti-HBc-R I A標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液實(shí)驗(yàn)稀釋液不同標(biāo)準(zhǔn)品濃度(N CU mL的放射性計(jì)數(shù)率 m in-10264 15275736064316036698368215289732066515000703264314275

10、6982628214An ti-HBc-R I A動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)2.4.1反應(yīng)條件的影響A n ti2HB c2R I A反應(yīng)管或盤(pán)中加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣品、標(biāo)記物、包被小球后分別于室溫(25溫育3h,37溫育2h,45溫育1.5h,各種反應(yīng)條件下的放射免疫分析結(jié)果列于表5。由表5可見(jiàn),45溫育1.5h,時(shí)間短,抑制曲線好,能更好地滿足免疫分析要求。441同位素第17卷表5An ti -HBc -R I A 反應(yīng)條件實(shí)驗(yàn)溫度溫育時(shí)間 h不同標(biāo)準(zhǔn)品濃度(N CU mL 的放射性計(jì)數(shù)率 m in -10264室溫3125835209560372146046721680451.51865479067332.4

11、.245下反應(yīng)時(shí)間的影響A n ti 2HB c 2R I A 反應(yīng)管或盤(pán)中加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣品、標(biāo)記物、包被小球后于45溫育不同時(shí)間,結(jié)果列于表6。由表6可見(jiàn),45溫育1.5h 已達(dá)平衡,故選擇45溫育1.5h 。表6An ti -HBc -R I A 溫育時(shí)間實(shí)驗(yàn)(45反應(yīng)時(shí)間 h不同標(biāo)準(zhǔn)品濃度(N CU mL 的放射性計(jì)數(shù)率 m in -12640.51304354076271.01460465686871.51721576097192.01722876327263.0172307658753215方法學(xué)鑒定2.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線和靈敏度A n ti 2HB c 2R I A 標(biāo)準(zhǔn)曲線示于圖1。

12、采用20個(gè)0標(biāo)準(zhǔn)平均值x-2s 計(jì)算出本試劑盒的分析靈敏度為0.8N CUmL 。2.5.2精密度重復(fù)測(cè)定低、中、高3份A n ti 2HB c 血清樣品,觀察批內(nèi)批間變異,結(jié)果列于表7。由表7可見(jiàn),本試劑盒批內(nèi)變異<10%,批間變異<15%,精密度達(dá)到臨床要求。表7An ti -HBc -R I A 批內(nèi)批間變異實(shí)驗(yàn)樣品批內(nèi)(n =10x ±s N CU mL -1CV %批間(n =8x ±s N CU mL -1CV %14.2±0.32716411±0.399.5212.3±0. 987191119±1.119.3

13、324.5±2.439192518±3.5813.82.5.3準(zhǔn)確性取3份不同濃度的A n ti 2HB c血清樣品分別加入到已知濃度的A n ti 2HB c 標(biāo)圖1An ti -HBc -R I A 標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)品中,測(cè)定A n ti 2HB c 回收率,結(jié)果列于表8。由表8可見(jiàn),其回收率在90%110%,準(zhǔn)確性符合臨床要求。表8An ti -HBc -R I A 回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果樣品A nti 2HBc含量預(yù)期值 N CU mL -1A nti 2HBc含量測(cè)定值 N CU mL -1回收率 %14.13.892.6212.513.2105.632527.3109.22.5

14、.4正常參考值測(cè)定120份正常人血清樣品,范圍為02.0N CU mL ,均值1.2N CUmL 。2.5.5整體試劑盒的穩(wěn)定性將整體試劑盒分別于4放置35天,37放置7天,進(jìn)行放射免疫分析,結(jié)果列于表9。由表9可見(jiàn),4放置35天和37放置7天計(jì)數(shù)率下降不明顯,仍能滿足免疫分析要求,試劑盒穩(wěn)定性符合臨床要求。2.5.6臨床應(yīng)用本試劑盒與本院生產(chǎn)的乙型肝炎核心抗體放免定性試劑盒同時(shí)測(cè)定48份臨床血清樣品,結(jié)果列于表10。由表10可見(jiàn),兩種試劑盒在檢測(cè)血樣的陰、陽(yáng)性方面具有較好的一致性。但相對(duì)于定性藥盒,定量藥盒能更準(zhǔn)確地反映患者HB c A g 的含量,方便醫(yī)生及時(shí)進(jìn)行治療。541第3期官國(guó)英等

15、:乙型肝炎核心抗體放射免疫定量試劑盒的研制表9An ti-HBc-R I A穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)溫度 放置時(shí)間d不同標(biāo)準(zhǔn)品濃度(N CU mL的放射性計(jì)數(shù)率 m in-10264室溫0198118430837 435153156928622 377173757470759表10兩種試劑盒的比較試劑盒陰性樣品例陽(yáng)性樣品例可疑樣品例總計(jì)例本院定性試劑盒379248本試劑盒3990483結(jié)論本試劑盒從固相包被、標(biāo)記物、標(biāo)準(zhǔn)品、反應(yīng)條件、溫育時(shí)間等方面作了一系列條件優(yōu)化工作,建立了A n ti2HB c放射免疫定量分析試劑盒的制備方法,直觀反映出血清中核心抗體的含量,為乙型肝炎的診斷、療效評(píng)價(jià)、血液制品的篩選等

16、提供參考4。參考文獻(xiàn):1蔡錫麟,陳耀華,秦明秀.臨床放射免疫學(xué)M.北京:原子能出版社,1994.212221.2宋清林.病毒性肝炎的防治M.北京:人民軍醫(yī)出版社,1988.1013.3嚴(yán)杰,羅海波,陸德源,等.現(xiàn)代微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及其應(yīng)用M.北京:人民衛(wèi)生出版社,1997.187 188.4衛(wèi)生部藥品生物制品鑒定所.甲、乙型肝炎診斷試劑檢定要求M.北京:衛(wèi)生部藥品生物制品鑒定所,1990112.5鄭懷竟.抗2HBc(總檢驗(yàn)中存在的問(wèn)題與改進(jìn)的方法J.中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志,1992,15:80.The Establ ishm en t of Sol id Pha se Rad io i m m un

17、oa ssay forQuan tita tive D eterm i na tion of Hepa titis B Core An tibodyGU AN Guo2ying,KON G Fan2x in,W AN G Yan2zhen,L I U Y i2b ing,W E I X iu2fang,W AN G Yun2yan(D ep a rt m en t of Isotop e,Ch ina Institu te of A to m ic E nergy,B eij ing102413,Ch inaAbstract:A sen sitive and sp ecific so lid

18、p hase radi o i m m unoassay fo r hep atitis B co re an tibody(an ti2 HB c2R I Ais estab lished.H ep atitis B co re an tigen(HB c A gis coated on the so lid p hase beads,125I2 an ti2HB c is u sed as the radi oactive tracer.T he sen sitivity of the assay is0.8N CU mL.T he in tra2 assay CV s and the in tre2assay CV s of3sam p les are9.9%and13.8%resp ectively.T he analytical recoveries are ranged from92.6%to109.2%.T he level of120no rm al sub jects is1.2N CU mL w ith a rang of02.0N C