原位雜交在觀賞植物中的研究進(jìn)展

1、原位雜交在觀賞植物中的研究進(jìn)展目錄 1、概述 2、分類 3、RNA原位雜交 4、總結(jié)一、概述 原位雜交(In situ hybridization，簡(jiǎn)稱ISH)，利用放射性或非放射性標(biāo)記已知的核酸探針，通過放射自顯影或非放射檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)組織、細(xì)胞及染色體上特異DNA或RNA序列的一種技術(shù)，一種直接、簡(jiǎn)便的研究基因定位和表達(dá)的方法。是一種能夠從形態(tài)學(xué)上證明特異性的DNA或RNA序列存在于個(gè)別細(xì)胞、組織部分，單細(xì)胞或染色體中的技術(shù)，是分子生物學(xué)和組織化學(xué)、細(xì)胞學(xué)結(jié)合的產(chǎn)物。 原理：染色體原位雜交技術(shù)是根據(jù)核酸分子堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則(AT，GC)，將有放射性和非放射性標(biāo)記的探針與染色體上經(jīng)過變性后的

2、單鏈DNA互補(bǔ)配對(duì)，結(jié)合成專一的核酸雜交分子，再經(jīng)過一定的檢測(cè)手段將待測(cè)核酸在染色體上的位置顯示出來。 1969年，美國(guó)耶魯大學(xué)Gall和Pardue首先創(chuàng)立，用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細(xì)胞雜交，確定該基因定位于卵母細(xì)胞的核仁中。 1971年， Jacob 創(chuàng)立電鏡原位雜交技術(shù)檢測(cè)爪蟾卵母細(xì)胞DNA 80年代，原位雜交技術(shù)飛速發(fā)展現(xiàn)已能檢測(cè)只有數(shù)百堿基對(duì)的較小分子DNA和含量很低的mRNA。 當(dāng)時(shí)的工作多采用冰凍組織切片或培養(yǎng)細(xì)胞，探針均采用同位素標(biāo)記。 1981，Bauman等首先應(yīng)用熒光素標(biāo)記cRNA探針做原位雜交，然后用熒光顯微鏡觀察獲得成功熒光雜交技術(shù)。 1985年Rayburn首次

3、將原位雜交技術(shù)應(yīng)用于植物染色體的研究,此后在植物研究中得到廣泛的應(yīng)用,特別是在遠(yuǎn)緣雜交后代的鑒定和遺傳物質(zhì)的檢測(cè)中,由于直觀可靠等優(yōu)點(diǎn)而倍受青睞。 生物素標(biāo)記探針技術(shù)是Brigat（1983）首先建立的，它利用生物素標(biāo)記的探針在組織切片上檢測(cè)了病毒DNA，通過生物素與抗生物素結(jié)合，過氧化物酶-抗過氧化物酶顯示系統(tǒng)顯示病毒DNA在細(xì)胞中的定位。 1987年，將地高辛標(biāo)記的有關(guān)試劑及藥盒投放市場(chǎng)。地高辛標(biāo)記技術(shù)引起科技工作者的極大興趣。優(yōu)點(diǎn)：完全、方便、省時(shí)，敏感性和質(zhì)量控制較好，可檢測(cè)人基因組DNA的單拷貝基因，背景反差好。二、分類 原位雜交主要分為染色體原位雜交和RNA原位雜交，染色體原位雜交

4、應(yīng)用于觀賞植物中較多的是FISH和GISH。 FISH(Fluorescence in situ Hybridization) 因其所用探針被熒光物質(zhì)標(biāo)記（間接或直接）而得名，基本原理是熒光標(biāo)記的核酸探針在變性后與已變性的靶核酸在退火溫度下復(fù)性；通過顯微鏡觀察熒光信號(hào)可在不改變被分析對(duì)象（即維持其原位）的前提下對(duì)靶核酸進(jìn)行分析。DNA熒光標(biāo)記探針是其中最常用的一類核酸探針。利用此探針可對(duì)組織、細(xì)胞或染色體中的DNA進(jìn)行染色體及基因水平的分析。 GISH(Genome in situ Hybridization)基因組原位雜交是在分子水平上檢測(cè)外源染色質(zhì)的一種有效方法,其探針是總基因組DNA.該

5、技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物進(jìn)化、親緣關(guān)系、真實(shí)雜種鑒定上。 染色體原位雜交基本流程圖探針 靶子1.分離DNA 1. 染色體的制片準(zhǔn)備2.標(biāo)記 2. 雜交前處理3.變性 3.變性 4. 雜交 5.雜交后處理（解離非特異性結(jié)合的雙鏈，除去未雜交的探針） 6.雜交體的檢測(cè)（雜交DNA呈現(xiàn)顏色A,未雜交的呈現(xiàn)顏色B）染色體原位雜交的應(yīng)用 基因定位：物理定位 染色體識(shí)別：利用不同熒光素標(biāo)記不同的探針,進(jìn)行多色熒光原位雜交。傳統(tǒng)的染色體形態(tài)特征和熒光原位雜交結(jié)果相結(jié)合,使染色體小、數(shù)目大、形態(tài)相似植物全部或部分得到區(qū)分,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行核型分析,得到精確的核型圖以及模式圖。鑒于rDNA序列與DNA的結(jié)合的難度較低、

6、檢出率高、雜交信號(hào)強(qiáng)等特點(diǎn),其成為染色體識(shí)別中應(yīng)用最為廣泛的一類探針。通過比較rDNA雜交信號(hào)的數(shù)量、位置、大小,進(jìn)行染色體識(shí)別,這些信息已經(jīng)成為核型分析的重要參數(shù)指標(biāo)。棉屬、藍(lán)豬耳、夜香樹屬。 構(gòu)建植物基因組物理圖譜 基因組進(jìn)化研究：基因組原位雜交(GISH)是基因組進(jìn)化研究常用的技術(shù)手段,因此,通過基因組原位雜交可以鑒定雜種。利用雜交種親本的總DNA作為標(biāo)記探針,另一個(gè)親本基因組DNA做封阻DNA,在該雜交種的染色體制片上進(jìn)行原位雜交,可以有效地區(qū)分同源性相近的兩個(gè)染色體組。四倍體棉起源。 轉(zhuǎn)基因植物的鑒定以地高辛標(biāo)記的45SrDNA為探針,用鮭魚精DNA (ssDNA)做封阻,對(duì)6個(gè)梅花

7、品種的分裂間期細(xì)胞核進(jìn)行FISH實(shí)驗(yàn)。玉米45SrDNA在梅花中有6個(gè)信號(hào)位點(diǎn),主要分布于第1、3、7號(hào)染色體上,不同品種略有差異,為梅花品種分類提供一定的客觀依據(jù)。45SrDNA雜交位點(diǎn)主要分布于染色體長(zhǎng)臂末端,結(jié)合染色體核型參數(shù),推斷出梅花進(jìn)化程度較低。梅花染色體制片技術(shù)優(yōu)化及基于熒光原位雜交的核型分析-陳晶鑫，2013幾種紫薇屬植物染色體制片技術(shù)優(yōu)化及原位雜交體系的建立楊冰潔，2013基因組原位雜交(GISH ) 在分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域具有重要作用。該技術(shù)能夠直接地、可見地辨別屬間或種間雜種中親本基因組的構(gòu)成,這是常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)方法不能或難以達(dá)到的RNA原位雜交的特點(diǎn) (1)使用的探針不同

8、：RNA原位雜交中多采用RNA或寡核苷酸探針，避免了應(yīng)用雙鏈DNA探針在雜交反應(yīng)中存在的兩條鏈之間的復(fù)性和第二條鏈的競(jìng)爭(zhēng)性雜交問題。cRNA-RNA雜交體比DNA-DNA、cDNA-RNA雜交體性能穩(wěn)定，在雜交反應(yīng)后可用RNA酶洗脫，以除去未結(jié)合的探針，因此特異性更強(qiáng)。 (2)檢測(cè)的目的不同：RNA原位雜交檢測(cè)和分析的主要為內(nèi)源性基因，包括細(xì)胞內(nèi)固有基因、異?；蚝妥儺惢?。以正確反映組織與細(xì)胞之間相互關(guān)系及功能和代謝狀態(tài)、探索疾病發(fā)病機(jī)理、觀察治療的療效和評(píng)估疾病的預(yù)后等。 (3)有較高的靈敏度：在檢出細(xì)胞和組織內(nèi)在低拷貝核苷酸時(shí)，RNA原位雜交能獲得較好定位。 三、RNA原位雜交的操作流程

9、 以組織切片和DIG標(biāo)記RNA探針為例：材料固定與包埋制片質(zhì)粒DNA線性化和DIG標(biāo)記的體外轉(zhuǎn)錄（探針制備）預(yù)雜交雜交雜交后處理免疫反應(yīng)顯色反應(yīng)封片觀察。探針的制備RNA探針是指帶有標(biāo)記的能與組織內(nèi)相對(duì)應(yīng)的核苷酸序列互補(bǔ)結(jié)合的一段單鏈cDNA或cRNA分子。根據(jù)在RNA雜交中所使用的探針依其來源可分為三種：1、特異性特異性cDNA： cDNA中不存在內(nèi)含子及其它高度重復(fù)序列，又克服了雙鏈cDNA探針在雜交反應(yīng)中兩條鏈之間復(fù)性的缺點(diǎn)，從而提高了雜交反應(yīng)的敏感性2、cRNA探針探針：以cDNA為模板，通過體外轉(zhuǎn)錄而獲得的。因?yàn)樗且环N單鏈探針，因此也避免了應(yīng)用雙鏈cDNA探針做雜交反應(yīng)時(shí)存在的兩條

10、鏈之間的復(fù)性問題。cRNA與RNA之間形成的雜交體要比cDNA-RNA雜交體穩(wěn)定。cRNA-RNA之間形成的雜交體不受RNA酶的影響。因此雜交反應(yīng)后可用RNA酶處理，以除去未結(jié)合的探針。3、人工合成寡核苷酸探針人工合成寡核苷酸探針：人工合成的寡核苷探針是以核苷酸為原料，通過DNA合成儀合成，避免了真核細(xì)胞中存在的高度重復(fù)序列帶來的不利影響。它與mRNA形成的雜交體不如cRNA-RNA雜交體穩(wěn)定，再則探針較短，所攜帶的標(biāo)記物少，敏感性較低。 百合花發(fā)育相關(guān)基因的組織原位雜交研究_潘梅百合花發(fā)育相關(guān)基因的組織原位雜交研究-潘梅，2010總結(jié) 以野菊不同發(fā)育時(shí)期的花器官為材料，通過制備菊花花型對(duì)稱相關(guān)基