高效液相色譜的基礎(chǔ)知識ppt課件

1、高效液相色譜的根底知識 1高效液相色譜法的特點高效液相色譜法的特點2高效液相色譜法儀器任務(wù)原理高效液相色譜法儀器任務(wù)原理3高效液相色譜儀的維護(hù)高效液相色譜儀的維護(hù)4高效液相色譜法儀的本卷須知高效液相色譜法儀的本卷須知5高效液相色譜的分析運用高效液相色譜的分析運用高效液相色譜法的特點高效液相色譜法的特點 高效液相色譜法HPLC是20世紀(jì)60年代末70年代初開展起來的一種新型分別分析技術(shù)，隨著不斷改良與開展，目前已成為運用極為廣泛的化學(xué)分別分析的重要手段。它是在經(jīng)典液相色譜根底上，引入了氣相色譜的實際，在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，因此具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動化的

2、特點。為了更好地了解高效液相色譜法優(yōu)越性，現(xiàn)從兩方面進(jìn)展比較：高效液相色譜法的特點高效液相色譜法的特點 1高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法 高效液相色譜法比起經(jīng)典液相色譜法的最大優(yōu)點在于高速、高效、高靈敏度、高自動化。高速是指在分析速度上比經(jīng)典液相色譜法快數(shù)百倍。由于經(jīng)典色譜是重力加料，流出速度極慢；而高效液相色譜配備了高壓輸液設(shè)備，流速最高可達(dá) 103cmmin-1.例如對氨基酸分別，用經(jīng)典色譜法，需用20多小時才干分別出20種氨基酸；而用高效液相色譜法，只需lh之內(nèi)即可完成。高效液相色譜法的特點高效液相色譜法的特點2高效液相色譜法與氣相色譜法 l氣相色譜法分析對象只限于分析氣體和沸點較低的化

3、合物，它們僅占有機(jī)物總數(shù)的20。對于占有機(jī)物總數(shù)近80的那些高沸點、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主要采用高效液相色譜法進(jìn)展分別和分析。 (2)氣相色譜采用流動相是惰性氣體，它對組分沒有親和力，即不產(chǎn)生相互作用力，僅起運載作用。而高效液相色譜法中流動相可選用不同極性的液體，選擇余地大，它對組分可產(chǎn)生一定親和力，并參與固定相對組分作用的猛烈競爭。因此，流動相對分別起很大作用，相當(dāng)于添加了一個控制和改良分別條件的參數(shù)，這為選擇最正確分別條件提供了極大方便。 (3)氣相色譜普通都在較高溫度下進(jìn)展的，而高效液相色譜法那么經(jīng)?？稍谑覝貤l件下任務(wù)。高效液相色譜法的特點高效液相色譜法的特點 分析速度快通

4、常分析一個樣品在1530 min，有些樣品甚至在5 min內(nèi)即可完成。 選擇性高可選擇固定相和流動相以到達(dá)最正確分別效果，可分析同類型的有機(jī)化合物及其同分異構(gòu)體，還可以分析在性質(zhì)上極為類似的旋光異構(gòu)體。 靈敏度高紫外檢測器可達(dá)0.01ng，熒光和電化學(xué)檢測器可達(dá)0.1pg。 柱子可反復(fù)運用用一根色譜柱可分別不同的化合物。 樣品量少，容易回收樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以搜集單一組分或做制備。高效液相色譜法的特點高效液相色譜法的特點 超高效液相色譜(UPLC) 是區(qū)別于HPLC的液相色譜新領(lǐng)域 基于小顆粒填料和LC原理的一種創(chuàng)新技術(shù) 實現(xiàn)超高分別度、靈敏度、分析速度1高效液相色譜法的特點高效液相

5、色譜法的特點2高效液相色譜法儀器任務(wù)原理高效液相色譜法儀器任務(wù)原理3高效液相色譜儀的維護(hù)高效液相色譜儀的維護(hù)4高效液相色譜法儀的本卷須知高效液相色譜法儀的本卷須知5高效液相色譜的分析運用高效液相色譜的分析運用高效液相色譜儀任務(wù)原理高效液相色譜儀任務(wù)原理 高壓輸液系統(tǒng) 進(jìn)樣系統(tǒng) 分別系統(tǒng) 檢測系統(tǒng)高效液相色譜儀任務(wù)原理高效液相色譜儀任務(wù)原理 其任務(wù)過程如下：首先高壓泵將貯液器中流動相溶劑經(jīng)過進(jìn)樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當(dāng)注入欲分別的樣品時，流經(jīng)進(jìn)樣器貯液器的流動相將樣品同時帶入色譜柱進(jìn)展分別，然后依先后順序進(jìn)入檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，由此得到液相色譜圖。高效液相色

6、譜儀任務(wù)原理高效液相色譜儀任務(wù)原理 1 1高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液系統(tǒng) 由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細(xì)，因此對流動相由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細(xì)，因此對流動相阻力很大，為使流動相較快流動，必需配備有高壓輸液系阻力很大，為使流動相較快流動，必需配備有高壓輸液系統(tǒng)。它是高效液相色譜儀最重要的部件，普通由儲液罐、統(tǒng)。它是高效液相色譜儀最重要的部件，普通由儲液罐、高壓輸液泵、過濾器、壓力脈動阻力器等組成，其中高壓高壓輸液泵、過濾器、壓力脈動阻力器等組成，其中高壓輸液泵是中心部件。對于一個好的高壓輸液泵應(yīng)符合密封輸液泵是中心部件。對于一個好的高壓輸液泵應(yīng)符合密封性好，輸出流量恒定，壓力平穩(wěn)，可調(diào)范

7、圍寬，便于迅速性好，輸出流量恒定，壓力平穩(wěn)，可調(diào)范圍寬，便于迅速改換溶劑及耐腐蝕等要求。常用的輸液泵分為恒流泵和恒改換溶劑及耐腐蝕等要求。常用的輸液泵分為恒流泵和恒壓泵兩種。恒流泵特點是在一定操作條件下，輸出流量堅壓泵兩種。恒流泵特點是在一定操作條件下，輸出流量堅持恒定而與色譜柱引起阻力變化無關(guān)；恒壓泵是指能堅持持恒定而與色譜柱引起阻力變化無關(guān)；恒壓泵是指能堅持輸出壓力恒定，但其流量那么隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故輸出壓力恒定，但其流量那么隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保管時間的注重性差，它們各有優(yōu)缺陷。目前恒流泵正逐保管時間的注重性差，它們各有優(yōu)缺陷。目前恒流泵正逐漸取代恒壓泵。恒流泵又稱機(jī)械泵，它又

8、分機(jī)械注射泵和漸取代恒壓泵。恒流泵又稱機(jī)械泵，它又分機(jī)械注射泵和機(jī)械往復(fù)泵兩種，運用最多的是機(jī)械往復(fù)泵。機(jī)械往復(fù)泵兩種，運用最多的是機(jī)械往復(fù)泵。高效液相色譜儀任務(wù)原理高效液相色譜儀任務(wù)原理 2進(jìn)樣安裝 高效液相色譜儀任務(wù)原理高效液相色譜儀任務(wù)原理3 3 分別系統(tǒng)分別系統(tǒng)色譜柱色譜柱 色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管資料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合分。柱管資料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合資料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。資料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。普通色譜柱長普通

9、色譜柱長5 530cm30cm，內(nèi)徑為，內(nèi)徑為4 45mm5mm，凝膠色譜柱內(nèi)，凝膠色譜柱內(nèi)徑徑3 312mm12mm，制備往內(nèi)徑較大，可達(dá)，制備往內(nèi)徑較大，可達(dá)25mm 25mm 以上。普通以上。普通在分別前備有一個前置柱，前置柱內(nèi)填充物和分別柱完全在分別前備有一個前置柱，前置柱內(nèi)填充物和分別柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過前置柱為其中的固定相一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過分別柱時不再洗脫其中固定相，保證分飽和，使它在流過分別柱時不再洗脫其中固定相，保證分別技的性能不受影響。別技的性能不受影響。 柱子裝填得好壞對柱效影響很大。對于細(xì)粒度的填料柱子裝填得

10、好壞對柱效影響很大。對于細(xì)粒度的填料20m20m普通采用勻漿填充法裝柱，先將填料調(diào)成勻普通采用勻漿填充法裝柱，先將填料調(diào)成勻漿，然后在高壓泵作用下，快速將其壓入裝有洗脫液的色漿，然后在高壓泵作用下，快速將其壓入裝有洗脫液的色譜柱內(nèi)，經(jīng)沖洗后，即可備用。譜柱內(nèi)，經(jīng)沖洗后，即可備用。 高效液相色譜儀任務(wù)原理高效液相色譜儀任務(wù)原理4 4檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng) 目前有兩種根本類型的檢測器目前有兩種根本類型的檢測器: : 一類是溶質(zhì)性檢測器，它僅對被分別組分的物理或一類是溶質(zhì)性檢測器，它僅對被分別組分的物理或化學(xué)特性有呼應(yīng)，屬于這類檢測器的有紫外、熒化學(xué)特性有呼應(yīng)，屬于這類檢測器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測器等

11、。光、電化學(xué)檢測器等。 另一類是總體檢測器，它對試樣和洗脫液總的物理另一類是總體檢測器，它對試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有呼應(yīng)，屬于這類檢測器的有示差折或化學(xué)性質(zhì)有呼應(yīng)，屬于這類檢測器的有示差折光，蒸發(fā)光散射，電導(dǎo)檢測器等。光，蒸發(fā)光散射，電導(dǎo)檢測器等。高效液相色譜儀任務(wù)原理高效液相色譜儀任務(wù)原理1 1紫外檢測器紫外檢測器 任務(wù)原理：任務(wù)原理： 基于基于Lambert-BeerLambert-Beer定律，即被測組定律，即被測組分對紫外光或可見光具有吸收，且分對紫外光或可見光具有吸收，且吸收強(qiáng)度與組分濃度成正比。吸收強(qiáng)度與組分濃度成正比。 通用型檢測器約有通用型檢測器約有8080的分析樣品的

12、分析樣品具有紫外吸收具有紫外吸收, ,可以運用這種檢測可以運用這種檢測器檢器檢 測。測。高效液相色譜儀任務(wù)原理高效液相色譜儀任務(wù)原理1紫外檢測器 優(yōu)點:a: 靈敏度高b: 線性范圍廣 C: 對溫度和流速不敏感，適于進(jìn)展梯度洗脫限制:a: 沒有紫外吸收的物質(zhì)不能檢測b: 應(yīng)盡能夠選擇在檢測波長下沒有背景吸收的流動相 (限制了一些截止波長在200300nm之間的良好溶劑的運用 ) 高效液相色譜儀任務(wù)原理高效液相色譜儀任務(wù)原理1紫外檢測器 2熒光檢測器 原理: 物質(zhì)的分子或原子經(jīng)光照射后，有些電子被激發(fā)至較高的能 級，這些電子從高能級 躍至低能級時，物質(zhì)會發(fā)出比入射光 波長較 長的光，這種光稱為熒光

13、。熒光檢測器就是在樣品的激發(fā)波優(yōu)點檢測發(fā)射光的強(qiáng)弱.熒光檢測器是一種選擇性檢測器 不到20%的物質(zhì)運用這種檢測手段,許多藥物采用這種檢測方法. 高效液相色譜儀任務(wù)原理高效液相色譜儀任務(wù)原理1紫外檢測器 2熒光檢測器 優(yōu)點: a: 靈敏度非常高(靈敏度在目前常用的HPLC檢測器中最高 )，比紫外檢測器高23個數(shù)量級，適宜于痕量分析 b: 可以用于梯度洗脫 c: 對儀器的穩(wěn)定性如溫度和壓力的穩(wěn)定性依賴較小 d: 選擇性好，優(yōu)于紫外缺陷: a:適用范圍有一定的局限性 只適用于有熒光基團(tuán)衍生化之后有熒光基團(tuán)的化合物 b: 定量分析時線性范圍較窄 它適宜于 稠環(huán)芳烴、氨基酸、胺類、維生素、蛋 白質(zhì)等熒光

14、物質(zhì)的測定 高效液相色譜儀任務(wù)原理高效液相色譜儀任務(wù)原理1紫外檢測器 2熒光檢測器 3二極管陣列檢測器原理: 光電二極管陣列或CCD陣列，硅靶攝像管等作為檢測元件的UV-VIS檢測器。它可構(gòu)成多通道并行任務(wù)，同時檢測由光柵分光，再入射到陣列式接受器上的全部波長的信號，然后，對二極管陣列快速掃描采集數(shù)據(jù)，得到的是時間、光強(qiáng)度和波長的三維譜圖。 高效液相色譜儀任務(wù)原理高效液相色譜儀任務(wù)原理1紫外檢測器 2熒光檢測器 3二極管陣列檢測器 高效液相色譜儀任務(wù)原理高效液相色譜儀任務(wù)原理1紫外檢測器 2熒光檢測器 3二極管陣列檢測器與普通UV-VIS檢測器不同之處: a: 普通UV-VIS檢測器是先用單色

15、器分光，只讓特定波長的光進(jìn)入流動池。 而二極管陣列UV-VIS檢測器是先讓一切波長的光都經(jīng)過流動池，然后經(jīng)過一系列分光技術(shù)，使一切波長的光在接受器上被檢測. b:普通UV-VIS檢測器只能得到二維的譜圖,而DAD可以得到三維圖譜. 高效液相色譜儀任務(wù)原理高效液相色譜儀任務(wù)原理1紫外檢測器紫外檢測器 2熒光檢測器熒光檢測器 3二極管陣列檢測器二極管陣列檢測器運用運用a: 色譜峰純度檢查色譜峰純度檢查b: 色譜峰鑒定色譜峰鑒定三維色譜能提供更多全面的信息。三維色譜能提供更多全面的信息。 高效液相色譜儀任務(wù)原理高效液相色譜儀任務(wù)原理1紫外檢測器 2熒光檢測器 3二極管陣列檢測器4示差折光率檢測器 是

16、一種通用型檢測器，只需被測組分與洗脫液的折光指數(shù)有差別就可運用。生命科學(xué)中常遇到各類糖類化合物，沒有紫外吸收，普通常用示差折光檢測器。它的通用性比UVD廣，但靈敏度要低，對溫度變化敏感，并與梯度洗脫不相容，因此限制了它的運用。 高效液相色譜儀任務(wù)原理高效液相色譜儀任務(wù)原理1紫外檢測器 2熒光檢測器 3二極管陣列檢測器4示差折光率檢測器5電導(dǎo)檢測器 電化學(xué)檢測器ECD ECD是根據(jù)物質(zhì)的電復(fù)原性和電氧化性來進(jìn)展檢測的，運用于對紫外光沒有吸收或不能發(fā)出熒光，但具有電活性的物質(zhì)測定。假設(shè)結(jié)合衍生技術(shù)，也可運用于非電活性物質(zhì)的檢測。安培檢測器和電導(dǎo)檢測器在生化、醫(yī)學(xué)、食品和環(huán)境分析中獲得廣泛的運用。

17、1高效液相色譜法的特點高效液相色譜法的特點2高效液相色譜法儀器任務(wù)原理高效液相色譜法儀器任務(wù)原理3高效液相色譜儀的維護(hù)高效液相色譜儀的維護(hù)4高效液相色譜法儀的本卷須知高效液相色譜法儀的本卷須知5高效液相色譜的分析運用高效液相色譜的分析運用高效液相色譜儀的維護(hù)高效液相色譜儀的維護(hù) 泵的運用和維護(hù)泵的運用和維護(hù)防止任何固體微粒進(jìn)入泵體，由于塵?；蚱渌魏坞s質(zhì)微粒防止任何固體微粒進(jìn)入泵體，由于塵?；蚱渌魏坞s質(zhì)微粒都會磨損柱塞、密封環(huán)、缸體和單向閥，因此應(yīng)預(yù)先除去都會磨損柱塞、密封環(huán)、缸體和單向閥，因此應(yīng)預(yù)先除去流動相中的任何固體微粒。流動相最好在玻璃容器內(nèi)蒸餾，流動相中的任何固體微粒。流動相最好在

18、玻璃容器內(nèi)蒸餾，而常用的方法是濾過，可采用而常用的方法是濾過，可采用MilliporeMillipore濾膜濾膜0.2m0.2m或或0.45m0.45m等濾器。泵的入口都應(yīng)銜接砂濾棒或片。等濾器。泵的入口都應(yīng)銜接砂濾棒或片。輸液泵的濾器應(yīng)經(jīng)常清洗或改換。輸液泵的濾器應(yīng)經(jīng)常清洗或改換。流動相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖液的流動相不應(yīng)流動相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖液的流動相不應(yīng)保管在泵內(nèi)，尤其是在停泵過夜或更長時間的情況下。假保管在泵內(nèi)，尤其是在停泵過夜或更長時間的情況下。假設(shè)將含緩沖液的流動相留在泵內(nèi)，由于蒸發(fā)或走漏，甚至設(shè)將含緩沖液的流動相留在泵內(nèi)，由于蒸發(fā)或走漏，甚至只是由于溶液

19、的靜置，就能夠析出鹽的微細(xì)晶體，這些晶只是由于溶液的靜置，就能夠析出鹽的微細(xì)晶體，這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞密封環(huán)和柱塞等。因此，必體將和上述固體微粒一樣損壞密封環(huán)和柱塞等。因此，必需泵入純水將泵充分清洗后，再換成適宜于色譜柱保管和需泵入純水將泵充分清洗后，再換成適宜于色譜柱保管和有利于泵維護(hù)的溶劑對于反相鍵合硅膠固定相，可以是有利于泵維護(hù)的溶劑對于反相鍵合硅膠固定相，可以是甲醇或甲醇甲醇或甲醇- -水。水。泵任務(wù)時要留心防止溶劑瓶內(nèi)的流動相被用完，否那么空泵泵任務(wù)時要留心防止溶劑瓶內(nèi)的流動相被用完，否那么空泵運轉(zhuǎn)也會磨損柱塞、缸體或密封環(huán)，最終產(chǎn)生漏液。運轉(zhuǎn)也會磨損柱塞、缸體或密封環(huán)，

20、最終產(chǎn)生漏液。輸液泵的任務(wù)壓力決不要超越規(guī)定的最高壓力，否那么會使輸液泵的任務(wù)壓力決不要超越規(guī)定的最高壓力，否那么會使高壓密封環(huán)變形，產(chǎn)生漏液。高壓密封環(huán)變形，產(chǎn)生漏液。流動相應(yīng)該先脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定流動相應(yīng)該先脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性，假設(shè)有大量氣泡，泵就無法正常任務(wù)性，假設(shè)有大量氣泡，泵就無法正常任務(wù) 高效液相色譜儀的本卷須知高效液相色譜儀的本卷須知柱的運用和維護(hù)1、運用前仔細(xì)閱讀色譜柱附帶的闡明書，留意適用范圍，如pH值范圍、不得注射強(qiáng)酸強(qiáng)堿的樣品，特別是堿性樣品。2、運用符合要求的流動相； 3、運用維護(hù)柱； 4、如所用流動相為含鹽流動相，反相色譜

21、柱運用后，先用水或低濃度甲醇水如5甲醇水溶液，再用甲醇沖洗。 5、長時間不用儀器，應(yīng)該將柱子取下用堵頭封好保管，留意不能用純水保管柱子，而應(yīng)該用有機(jī)相(如甲醇等)，由于純水易長霉。6、 不要高壓沖洗柱子； 7、 不要在高溫下長時間運用硅膠鍵合相色譜柱； 運用過程中留意輕拿輕放。高效液相色譜儀的維護(hù)高效液相色譜儀的維護(hù) 流動相的脫氣 HPLC所用流動相必需預(yù)先脫氣，否那么容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵的任務(wù)。氣泡還會影響柱的分別效率，影響檢測器的靈敏度、基線穩(wěn)定性，甚至使無法檢測。噪聲增大，基線不穩(wěn)，忽然跳動。此外，溶解在流動相中的氧還能夠與樣品、流動相甚至固定相如烷基胺反響。溶解氣體還會引起溶劑

22、pH的變化，對分別或分析結(jié)果帶來誤差。高效液相色譜儀的維護(hù)高效液相色譜儀的維護(hù) 紫外燈的保養(yǎng)： 在分析前、柱平衡得差不多時，翻開檢測器；在分析完成后，馬上封鎖檢測器。1高效液相色譜法的特點高效液相色譜法的特點2高效液相色譜法儀器任務(wù)原理高效液相色譜法儀器任務(wù)原理3高效液相色譜儀的維護(hù)高效液相色譜儀的維護(hù)4高效液相色譜法儀的本卷須知高效液相色譜法儀的本卷須知5高效液相色譜的分析運用高效液相色譜的分析運用高效液相色譜儀的本卷須知高效液相色譜儀的本卷須知一、流動相一、流動相1 1、流動相應(yīng)選用色譜純試劑、高純水或、流動相應(yīng)選用色譜純試劑、高純水或雙蒸水，酸堿液及緩沖液需經(jīng)過濾后雙蒸水，酸堿液及緩沖液

23、需經(jīng)過濾后運用，過濾時留意區(qū)分水系膜和油系運用，過濾時留意區(qū)分水系膜和油系膜的運用范圍；膜的運用范圍； 2 2、水相流動相需經(jīng)常改換普通不超越、水相流動相需經(jīng)常改換普通不超越2 2天，防止長菌蛻變天，防止長菌蛻變. .高效液相色譜儀的本卷須知高效液相色譜儀的本卷須知二、樣品二、樣品1 1、采用過濾或離心方法處置樣品，確保樣品中不含、采用過濾或離心方法處置樣品，確保樣品中不含固體顆粒；固體顆粒； 2 2、用流動相或比流動相弱假設(shè)為反相柱，那么極、用流動相或比流動相弱假設(shè)為反相柱，那么極性比流動相大；假設(shè)為正相柱，那么極性比流動性比流動相大；假設(shè)為正相柱，那么極性比流動相小的溶劑制備樣品溶液，盡量用流動相制備相小的溶劑制備樣品溶液，盡量用流動相制備樣品液樣品液高效液相色譜儀的本卷須知高效液相色譜儀的本卷須知三、操作過程三、操作過程1 1、先以所用流動相沖洗系一致定時間如所用流動相為含、先以所用流動相沖洗系一致定時間如所用流動相為含鹽流動相，必需先用水沖洗鹽流動相，必需先用水沖洗2020分鐘以上再換上含鹽流動分鐘以上再換上含鹽流動相，正式進(jìn)樣分析前相，正式進(jìn)樣分析前30min 30min 左右開啟左右開啟D D燈或燈或WW燈，以延燈，以延伸燈的運用壽命；伸燈的運用壽命； 2 2、溶劑瓶中的沙芯過濾頭容易破碎，在改換流動相時留意、溶劑瓶中的沙芯過濾頭容