金色鏈霉菌原生質(zhì)體的制備_邱荔

1、第29卷第2期福州大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版Vol.29No.2 2001年4月Jour nal of Fuzhou U niversity(N atural ScienceApr.2001文章編號:1000-2243(200102-0124-04金色鏈霉菌原生質(zhì)體的制備邱荔1,孟春1,郭養(yǎng)浩1,胡詩國1,林冉1,程紹軍2(1.福州大學(xué)僑興輕工學(xué)院,福建福州350002; 2.江西省醫(yī)藥學(xué)校,江西南昌330001摘要:對金色鏈霉菌原生質(zhì)體制備的具體條件進行了優(yōu)化研究.發(fā)酵培養(yǎng)基中采用蔗糖濃度12%、甘氨酸濃度0.5%、酶解條件采用菌齡為48h的菌絲、溶菌酶濃度6mg/mL、酶解時間為1h制備原生質(zhì)體

2、,原生質(zhì)體制備率可高達60%以上.關(guān)鍵詞:金色鏈霉菌;原生質(zhì)體;再生中圖分類號:Q815文獻標識碼:A在抗生素工業(yè)中,天然抗生素約有60%以上是由鏈霉菌產(chǎn)生的1.近年來,隨著基因克隆技術(shù)的逐步完善和對鏈霉菌基因表達研究的逐步深入,已發(fā)現(xiàn)鏈霉菌基因組分子量大,其原生質(zhì)體經(jīng)PEG處理后可以有效地吸收外源DNA2,成為重組DNA技術(shù)中表達異源基因的良好宿主,從而在尋找新的天然抗生素產(chǎn)生菌的同時,又開辟了利用重組克隆技術(shù)產(chǎn)生新的抗生素的途徑.在重組DNA技術(shù)的使用過程中,要使外源DNA良好地克隆進宿主原生質(zhì)體中,制備優(yōu)質(zhì)的宿主原生質(zhì)體和轉(zhuǎn)化子的再生成為關(guān)鍵步驟.由于不同的鏈霉菌菌株具有各自的特性(如培

3、養(yǎng)基組成不同、菌本身的胞壁結(jié)構(gòu)不同、生長條件不同等,其原生質(zhì)體制備條件也互不一致.目前未見有對金色鏈霉菌的原生質(zhì)體制備條件的報道,所以針對金色鏈霉菌的菌株特性,研究了影響原生質(zhì)體制備的一系列因素.1材料和方法1.1菌種和試劑1金色鏈霉菌為我室保藏菌種.2溶菌酶購自上海生物工程有限公司.3溶菌酶液,P-Buffer,10.3%蔗糖溶液,0.01%SDS溶液配制見操作手冊3.1.2培養(yǎng)基1種子培養(yǎng)基組成:葡萄糖、牛肉浸膏、酵母浸出物、酪蛋白水解物.2發(fā)酵培養(yǎng)基組成:YEM E培養(yǎng)基3.3再生培養(yǎng)基組成(pH7.0:葡萄糖、蔗糖、牛肉浸膏、酵母浸出物、酪蛋白水解物、瓊脂.1.3原生質(zhì)體制備步驟1從金

4、色鏈霉菌斜面上刮取適量孢子,接種于種子培養(yǎng)基(500mL三角瓶,每瓶裝30m L種子液體培養(yǎng)基,放于旋轉(zhuǎn)式搖床上(250r/min,在3032e的條件下培養(yǎng).2培養(yǎng)1d后,取出3份等量樣品分別裝入3個無菌離心管(A,B,C中,離心(6000r/m in,5 min,倒去上清液.3在3管中各加入10.3%蔗糖溶液,混勻后離心(6000r/min,5m in,倒去上清液,然后重復(fù)洗滌沉淀一次.4取B,C管的沉淀加入溶菌酶液于3335e培養(yǎng)一段時間后,離心(6000r/min,3min,倒去上清液,用P-Buffer洗滌沉淀1次,將A,B管沉淀懸浮于P-Buffer中混勻,將C管的沉淀懸浮于0.01

5、% SDS溶液中混勻,分別用塞有脫脂棉的無菌漏斗過濾到另一無菌試管中,各取適量涂布于再生培養(yǎng)基上,收稿日期:2000-07-05作者簡介:邱荔(1975-,女,碩士研究生;郭養(yǎng)浩為通訊聯(lián)系人.基金項目:福建省科委基金資助項目(99-H-46于3234e 倒置培養(yǎng).當平皿長出可見菌落時,即可計數(shù).最終菌落數(shù)(個/mL=平皿菌落數(shù)(個/m L樣品稀釋倍數(shù).其中,A 平皿長出的菌落數(shù)為酶解前的菌絲數(shù),B 平皿長出的菌落數(shù)為再生的原生質(zhì)體數(shù)和殘余菌絲數(shù),C 平皿長出的菌落數(shù)為殘余菌絲數(shù).這是因為原生質(zhì)體對SDS 非常敏感3,所以用0.01%SDS 懸浮的沉淀涂布后再生的應(yīng)是濾液中殘余的菌絲生成的菌落.

6、由此可算出原生質(zhì)體形成率:x %=B -CA100%其中:A 為酶解前的菌落數(shù)(個/mL ;B 為原生質(zhì)體數(shù)和殘余菌絲數(shù)(個/mL ;C 為殘余菌絲數(shù)(個/mL .1.4 實驗方法1菌絲量計算:將發(fā)酵液離心,沉淀菌絲體積占總體積比為菌絲量(%.2pH 值測定:采用METTLA TOLENT O 320pH 計.3原生質(zhì)體占有數(shù)(個/mL=B -C.2 結(jié)果與討論2.1 YEME 的改進將種子液接入鏈霉菌適宜生長的YEME 培養(yǎng)基,發(fā)現(xiàn)菌體在YEME 中不能繼續(xù)生長,推斷有可能是蔗糖濃度或是甘氨酸濃度過高.以蔗糖濃度、甘氨酸濃度為因素,各選擇3個水平作正交實驗,菌體生長情況見表1(初始菌體量為0

7、.17%.表1 不同蔗糖、甘氨酸濃度對金色鏈霉菌生長的影響序號U 蔗糖/%U 甘氨酸/%培養(yǎng)48h 的菌體量/%初始pH 值培養(yǎng)48h 后的pH 值1120.2 3.3 6.208.182120.3 4.6 6.218.563120.5 5.5 6.218.594240.20.33 6.21 4.715240.30.25 6.22 4.886240.50.29 6.21 4.497360.20.18 6.21 4.928360.30.28 6.21 5.049360.50.346.214.68實驗結(jié)果表明,金色鏈霉菌可利用蔗糖作為碳源,在蔗糖濃度不高的情況下,菌絲較易聚集成團,降低溶酶效率,但

8、如果蔗糖濃度高過20%,菌體在代謝的過程中產(chǎn)生過多的有機酸,造成pH 值低于5.0,抑制了菌體的生長,所以24%、36%的蔗糖濃度均不適合菌體的繼續(xù)生長,只有12%的濃度適合.另一方面,甘氨酸在培養(yǎng)基中的作用是代替D-丙氨酸摻入細胞壁,破壞細胞壁肽聚糖短肽間的交聯(lián),引起細胞壁結(jié)構(gòu)的不完整以便于酶解破壁4.考慮到酶解時間和甘氨酸濃度對溶酶效率的交互影響,逐選擇3種酶液濃度0.2%、0.5%、1%,2種酶解時間分別為1、2h,進行了原生質(zhì)體制備實驗,結(jié)果見表2(初始菌體量為0.17%,初始pH 值6.21.實驗結(jié)果表明,甘氨酸的濃度高于0.5%時,菌體量少于3.1%,原生質(zhì)體占有數(shù)也低于4000個

9、/mL.這可能是因為甘氨酸濃度過高,抑制了菌絲體的生長4.另外,從酶解效果來看,甘氨酸濃度為0.2%時,原生質(zhì)體占有數(shù)隨酶解時間增加而增加,酶解2h 時,原生質(zhì)體占有數(shù)達到1.5105個/mL.甘氨酸濃度為0.5%時,隨著酶解時間增加,原生質(zhì)體占有數(shù)先增加后減少.酶解1h,原生質(zhì)體占有數(shù)達到2.03105個/mL,酶解2h,原生質(zhì)體占有數(shù)下降至0.99105個/mL.這可能是因為在不影響菌絲生長的情況下,甘氨酸濃度越高,細胞壁結(jié)構(gòu)越便于酶解,所以0.5%的濃度酶解1h 所獲得的原生質(zhì)體數(shù)大于0.2%的濃度酶解2h 的,而且酶解得較完全.若再增加酶解時間,則形成的原生質(zhì)體會受到酶的破壞,造成原生

10、質(zhì)體數(shù)目下降.所以經(jīng)過比較,在發(fā)酵培養(yǎng)基中采用蔗糖濃度12%,甘氨酸濃度0.5%為較優(yōu)方案.#125#第2期邱荔等:金色鏈霉菌原生質(zhì)體的制備表2 不同甘氨酸濃度、酶解時間對原生質(zhì)體制備的影響序號U 甘氨酸/%t 酶解/h 培養(yǎng)48h 的pH 值培養(yǎng)48h 菌體量/%原生質(zhì)體占有數(shù)/個#mL -110.218.18 3.20.13610520.228.21 3.4 1.510530.518.59 5.3 2.0310540.528.60 5.50.991055117.90 2.932506128.053.021002.2 菌齡、溶菌酶濃度的確定處于不同生長時間的菌體,經(jīng)過處理后都可以形成原生質(zhì)體

11、,但其活性差異很大.處于穩(wěn)定期和衰老期的菌體,由于菌體老化生理活性低,此時期制備的原生質(zhì)體大小差異很大,異質(zhì)性明顯,再生能力差;而對數(shù)期(包括對數(shù)前、中、后期的菌絲各部分生理差異小,菌絲活力高,所制備的原生質(zhì)體內(nèi)含物及細胞器缺損少,修復(fù)能力高,再生效果好4.所以根據(jù)金色鏈霉菌發(fā)酵特性,選擇24h 和48h 的菌絲來進行原生質(zhì)體制備實驗.另一方面,溶菌酶濃度對原生質(zhì)體的制備也是一個重要因數(shù),酶量過低,影響原生質(zhì)體化,酶量過高,不僅會影響原生質(zhì)體活性,而且影響原生質(zhì)體再生率.本實驗考慮到酶濃度,酶解時間,菌齡三者對原生質(zhì)體制備的交互影響,選擇酶濃度3、6mg/mL,菌齡24、48h,酶解時間1、1

12、.5h,進行了正交實驗,結(jié)果見表3.表3 不同酶濃度、酶解時間、菌齡對原生質(zhì)體制備的影響序號Q 酶/mg #mL -1t 菌齡/h t 酶解/h 原生質(zhì)體占有數(shù)/個#mL -1原生質(zhì)體形成率/%132410.225105232324 1.50.26910527.533481 1.588105534348 1.5 1.64810555562410.297105306624 1.50.23610523.876481 1.9981056686481.51.58910552. 5圖1 不同酶濃、酶解時間、菌齡對原生質(zhì)體制備的影響實驗結(jié)果表明,在酶解時間和酶濃度相同的條件下,菌齡48h 的比菌齡24h

13、的便于酶解(圖1.這可能是因為24h 的菌絲尚處于生長期,制備出來的原生質(zhì)體再生能力差,即使增加酶濃度原生質(zhì)體占有數(shù)也只能達到0.297105個/mL,形成率為30%.而對于同樣菌齡的菌絲,酶濃度為3mg/mL 時,酶解時間越長,效果越好,但酶濃度為6mg /mL 時,酶解時間的增長,反而使原生質(zhì)體數(shù)目下降,這可能是因為高的酶濃度情況下,1h 就已經(jīng)基本酶解完全,若再增加酶解時間,酶會對生成的原生質(zhì)體發(fā)生作用使細胞質(zhì)膜受到損傷,造成大量的原生質(zhì)體破壞,從而使其失活,原生質(zhì)體形成率下降.所以溶菌酶處理較佳條件是菌齡48h,酶濃度6m g/mL,酶解時間1h,在此條件下原生質(zhì)體占有數(shù)1.99810

14、5個/mL,原生質(zhì)體形成率達到66%.3 結(jié)語1金色鏈霉菌原生質(zhì)體制備發(fā)酵培養(yǎng)基配方中,蔗糖較優(yōu)含量為12%,甘氨酸濃度為0.5%時,即改善了菌絲易聚集成團的特性,又使酶解效率提高.2金色鏈霉菌原生質(zhì)體制備較優(yōu)條件為菌齡48h,溶菌酶濃度為6mg/mL,酶解時間1h.此實驗條件下,原生質(zhì)體制備率可達到66%.#126#福州大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版第29卷參考文獻:1 Iain S Hunter.鏈霉菌的基因克隆化J.國外醫(yī)藥抗生素分冊,1988,9(4:241-251.2 鄧子新.鏈霉菌基因表達分子的新進展J.中國抗生素雜志,1990,15(3:231-235.3 霍普伍德.鏈霉菌遺傳操作實驗手冊

15、M .鄧子新譯.長沙:湖南科學(xué)技術(shù)出版社,1988.4 賀筱蓉,黃小倩.鏈霉菌原生質(zhì)體的制備J.生物學(xué)通報,1998,33(1:40-41.Production and regeneration of protoplast of streptomyces aureofaciensQIU Li 1,M ENG Chun 1,GUO Yang -hao 1,HU Shi-g uo 1,LING Ran 1,CH ENG Shao-jun 2(1.College o f Q iao xin Lig ht Industry,F uzhou U niversity ,Fuzhou,Fujian 3500

16、02,China; 2.Pharmaceutic School of Jiang xi Province,Nanchang ,Jiangx i 330001,ChinaAbstract :T he conditions of producing and reg enerating protoplast of streptomyces aureofaciens were opt-im ized.In culture medium,the better concentration of sugar and glycine w ere 12%and 0.5%respectively.T he opt

17、imum conditions of protoplast production of streptom yces aureofaciens were w hen cells w ere cultured to 48h and concentrations of lysine enzyme w as added to 6mg/mL and lysine time reached 1h.The producing rate of protoplast was over 60%under the conditions.Keywords:streptomyces aureofaciens;proto

18、plast;regeneration(接第97頁4 楊鋒,顏肖慈,歐陽禮,等.拓撲指數(shù)F(c F與氣相色譜保留指數(shù)RI 的相關(guān)性研究J.分析化學(xué),1998,26(5:497500.5 楊家安,江元生.飽和鏈烴圖特征和熱力學(xué)性質(zhì)J.化學(xué)學(xué)報,1983,41(10:884894.6 朱昌中,朱鑫璋,吳錦屏,等.一種新的分子拓撲指數(shù)J.化學(xué)通報,1995,1:1518.7 Randic M.On characterization of molecular branchingJ.J Amer Chem Soc,1975,97(25:66096615.8 馮長君.T s ,m k X及其應(yīng)用J.吉林大學(xué)

19、學(xué)報(自然科學(xué)版,1999,4:71.9 成都科技大學(xué)分析化學(xué)教研室.分析化學(xué)手冊(第四分冊M .北京:化學(xué)工業(yè)出版社,1984.10 任碧也,許友,陳國斌.一個新的拓撲指數(shù)用于有機化合物QSPR/QSAR 研究J.化學(xué)學(xué)報,1999,57(6:569571.Stu dy on the quantitative structure -retention relationship of alkanes,alcohols and ethersDU Xi-hua,FENG Chang -jun(Depar tment of Chemistry,Xuzhou Education Co llege,Xuzhou,Jiangsu 221006,ChinaAbstract:Based on the adj