ACE基因多態(tài)性及大容量肺灌洗術(shù)對塵肺患者血清ACE濃度影響

1、    ACE基因多態(tài)性及大容量肺灌洗術(shù)對塵肺患者血清ACE濃度影響作者：馬國宣,李宏芬,吳壽嶺作者單位：河北秦皇島，國家煤礦安全監(jiān)察局塵肺病康復(fù)中心，063000 河北開灤，開灤(集團(tuán))責(zé)任有限公司醫(yī)院【摘要】 目的 討論ACE基因多態(tài)性及大容量肺灌洗術(shù)(WLL)對塵肺患者血清ACE濃度的影響。方法 對71例塵肺患者在全身麻醉下行WLL治療，灌洗前后抽取靜脈血， PCR方法檢測ACE基因，酶兩點(diǎn)終點(diǎn)法測定ACE濃度。結(jié)果 (1)71例塵肺病患者中，ACE基因型者35例，占49.3%，ID型者25例，占35.2%，DD型者11例，占15.5%;146例正

2、常對照組中型者68例，占46.6%，ID型者54例，占37.2%，DD型者24例，占16.2%，兩組基因型頻率比較差異無顯著性;(2)塵肺患者WLL前血清ACE濃度為43.5±13.37uL,較對照組31.62±9.19 uL明顯增高(P<0.01);(3) WLL后塵肺患者血清ACE濃度為26.74±8.71uL，較術(shù)前明顯下降，且趨于正常;(4)WLL前，ID基因型血清ACE濃度最高， DD型次之,II型最低。WLL后，DD基因型血清ACE濃度最高，ID型次之。 血清ACE濃度下降程度(ACE)以ID型最明顯，為14.28±10.66u/L,D

3、D型次之，為9.45±6.43 u/L,II型變化最小，為 7.87±5.87 u/L(P<0.01)。結(jié)論 ACE基因多態(tài)性影響塵肺患者血清ACE濃度;WLL后患者血清ACE濃度明顯下降?！娟P(guān)鍵詞】 肺灌洗,血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE),基因多態(tài)性;ACE濃度【Abstract】 Objective Analysis the effects on serum ACE concentration in the pneumoconiosis patients by ACE gene polymorphism and WLL .Methods 71patients were

4、 performed WLL under general anesthesia ;blood samples from the vein were taken before and after WLL; polymerize chain reaction was used to detected the ACE gene, the serum ACE was measured by the way of enzyme two points destination.Results (1) In the 71 pneumoconiosis group ,the frequency of ACE g

5、ene II, ID, DD genotype was 49.3%, 35.2%, 15.5% respectively. In the control group, the frequency of ACE gene II, ID, DD genotype was 46.6%, 37.2%, 16.2% respectively. There was no significant difference between each genotype of the two groups. (2) Serum ACE concentration in pneumoconiosis patients

6、before WLL were higher than that of normal people. (3) The serum ACE concentration decreased dramatically after WLL and trend to normal. (4) Before WLL, ID geneotype serum ACE concentration was the highest,DD genotype was second,II genotype was the lowest; after WLL,DD genotype serum ACE concentrati

7、on was the highest,ID genotype was the second; ACE of ID geneotype is the largest, 14.28±10.66 u/L, DD geneotype is second, 9.45±6.43 u/L, II genotype was the lowest,7.87±5.87u/L(P<0.01).Conclusion Serum ACE concentration was affected by ACE gene polymorphism, and the serum ACE con

8、centration decreased dramatically after WLL.【Key words】 lung lavage; angiotensin converting enzyme(ACE); gene polymorphism ; ACE concentration塵肺病是由于長期吸入含游離二氧化硅(SiO2)及其他粉塵所致的、以肺組織廣泛纖維化為主的全身性疾病。大容量全肺灌洗術(shù)(whole-lung lavage, WLL)是近幾年逐步成熟的一種治療塵肺病的新技術(shù)，它可清除肺泡腔和細(xì)支氣管內(nèi)的粉塵、吞塵肺泡巨噬細(xì)胞(pulmonary alveolar macrophage

9、,PAM)及其產(chǎn)生的致炎癥、致纖維化因子，起到去除病因、改善呼吸功能、緩解癥狀的功效1。ACE基因多態(tài)性決定了人體內(nèi)ACE濃度，而ACE是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的關(guān)鍵酶，其下游產(chǎn)物-血管緊張素和醛固酮是已知的致炎和致纖維化因子2，3。本文旨在探討ACE基因及WLL對塵肺患者血清ACE濃度的影響，分析了2004年71例行WLL的塵肺患者ACE基因多態(tài)性及其WLL前后血清ACE濃度變化，從基因水平進(jìn)一步佐證了WLL治療塵肺病的療效。1 資料與方法1.1 一般資料 選擇本院2004年71例住院的塵肺病患者，塵肺病診斷分期依據(jù)我國塵肺病診斷標(biāo)準(zhǔn)GBZ70-2002?；颊呔鶠槟行裕挲g2864歲，

10、平均50.5±8.0歲;診斷分期期39例，+10例，期11例，+5例，6例;對照組為年齡、性別相匹配的146名開灤醫(yī)院健康體檢者，既往無肺疾患、高血壓、冠心病、腦血管疾病、糖尿病、腎病等病史。1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) 全部病例符合WLL條件1：肺功能檢查：肺活量(VC)、最大通氣量(MVV)達(dá)到預(yù)計值70%;呼氣流速峰值(PEF)、用力肺活量25%75%的最大流速(FEF 25%75%)，第一秒時間肺活量(FEF1.0),彌散功能(DLco)均達(dá)到預(yù)計值70%;動脈血氧分壓(PaO2)大于9.3 kPa (70mmHg);心、肝、腎功能及各項化驗(yàn)指標(biāo)均正常。1.3 標(biāo)本的采集與檢測 WL

11、L前抽取外周靜脈血35ml，2%EDTA抗凝，低滲法提取白細(xì)胞，-20保存，酚/氯仿法提取基因組脫氧核糖核酸(DNA)，PCR方法進(jìn)行基因擴(kuò)增，紫外燈下觀察結(jié)果。WLL前及術(shù)后1周取外周靜脈血23ml，1500rmin離心10min，取血清-80保存，酶兩點(diǎn)終點(diǎn)法測定ACE濃度。1.4 PCR方法進(jìn)行基因擴(kuò)增 (1)引物序列：采用PCR技術(shù)對ACE基因第16內(nèi)含子目的片段進(jìn)行擴(kuò)增。參照文獻(xiàn)4設(shè)計引物，上游引物5-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3，下游引物5-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3;PCR反應(yīng)體系：總反應(yīng)體積為25l,其中模板DNA 0.51g

12、,TaqDNA聚合酶0.6l(5ul),dNTP 2l (2.5pmoll),10XBuffer 2.5l,MgCl2 1.5l,引物上、下游混合物1.6l(2.5pmoll)，無菌雙蒸水15.8l,應(yīng)用PE-9700擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增;PCR循環(huán)參數(shù)：94預(yù)變性240s，進(jìn)入循環(huán)，94變性50s，58退火50 s，72延伸60s,30個循環(huán)，后延伸72 300s結(jié)束反應(yīng)。(2) ACE基因型判定：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，以2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，溴化己啶染色，與Marker對照，在紫外燈下觀察結(jié)果。只有一條約在490bp處出現(xiàn)亮帶者為插入型純合子型，只有一條約在190 bp處出現(xiàn)亮帶者為缺失型純合子DD

13、型，兩條亮帶分別在490bp處和190bp處出現(xiàn)者為雜合子ID型(如圖1)。1.5 血清ACE濃度測定 采用日立(7060Automatic Analyzer)全自動生化測定儀檢測。1.6 WLL常規(guī)進(jìn)行1，5。1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 全部資料采用EXCEL建庫，分別計算各組ACE基因頻率與血清ACE濃度。ACE基因型各組間頻率比較采用2檢驗(yàn)，血清ACE濃度測定結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用方差分析。2 結(jié)果2.1 塵肺患者與正常人群ACE基因I/D多態(tài)性比較 71例塵肺患者中，ACE基因型者35例，占49.3%，ID型者25例，占35.2%，DD型者1

14、1例，占15.5%;146例正常對照組中ACE基因II型者68例，占46.6%，ID型者54例，占37.2%，DD型者24例，占16.2%，兩組基因型頻率比較差異無顯著性(P>0.05);等位基因頻率塵肺患者I62.5%(6096),D37.5%(3696)，正常對照組I65.1%(190292),D34.9%(102292)，兩組等位基因頻率比較差異無顯著性(P>0.05)，見表1。表1 塵肺組與對照組ACE基因I/D多態(tài)性基因型和等位基因頻率分布比較(略)注：兩組基因型頻率比較P>0.05 ,等位基因頻率比較P>0.052.2 塵肺患者與正常人群ACE濃度比較 塵肺

15、患者血清ACE濃度為37.62±11.53uL，對照組血清ACE濃度為31.62±9.19uL，差異有顯著性(P<0.01)。2.3 塵肺患者ACE基因多態(tài)性與血清ACE濃度關(guān)系 WLL前，ID基因型者血清ACE濃度最高，為43.5±13.37uL，DD型者次之，為38.18±5.89u/L，II型者最低，為32.65±9.34u/L;WLL后，DD基因型者血清ACE濃度最高，為29.55±7.61u/L,ID型者次之，為28.88±11.58u/L,II型者最低，為24.26±5.68u/L。II型血清AC

16、E濃度與ID型及DD型相比較，差異有顯著性(P<0.01)，ID型與DD型血清ACE濃度比較，差異無顯著(P>0.05);ACE以ID型者最明顯，為14.28±10.66 u/L,DD型者次之，為9.45±6.43 u/L,II型者變化最小，為7.87±5.87 u/L，差異有顯著性(P<0.01)，見表2。表2 不同ACE基因型塵肺患者肺灌洗前后血清ACE濃度變化比較 (略)注：與WLL前比較P<0.01;與組比較P<0.01，#P<0.01，#P<0.052.4 WLL后血清ACE濃度與術(shù)前比較 WLL后血清ACE濃度

17、為26.74±8.71 uL，較術(shù)前明顯降低(P<0.01)。3 討論ACE的主要作用是催化血管緊張素轉(zhuǎn)變?yōu)檠芫o張素(Ag)，后者具有強(qiáng)烈收縮血管及刺激醛固酮分泌，滅活緩激肽的作用，在調(diào)節(jié)血管張力和血管平滑肌的增生中起作用。人類ACE基因第16內(nèi)含子中有一段287堿基對(base pair,bp)的插入(insertion,I)和缺失(delection,D)多態(tài)性，組成II、ID、DD三種基因型。我國漢族人群ACE基因多態(tài)性的分布特征，D等位基因頻率明顯低于I等位基因頻率6，7。本研究顯示塵肺患者ACE基因型頻率及等位基因頻率與正常人群一致，均以II型最高，ID型次之，DD

18、型最低，證明塵肺發(fā)病無ACE基因易感性而與環(huán)境因素有關(guān)。血清ACE水平是由遺傳決定的,ACE基因中攜帶D等位基者，血漿ACE濃度較高，且DD基因型血漿ACE濃度為II型的兩倍，ID則介于兩者之間8，9。本結(jié)果顯示，塵肺患者I/D基因型血清ACE濃度最高，DD型次之，II型最低，與文獻(xiàn)報道不一致。正常人群在環(huán)境因素不變的條件下,等位基因?qū)CE濃度起決定作用，但在病理條件(SiO2刺激)下，慢性炎性刺激對ACE濃度起主要調(diào)控作用，基因的作用變得微小，導(dǎo)致與正常人群不同基因型對ACE的作用結(jié)果。1975年，Lieberman J10首先報道了結(jié)節(jié)病患者血清ACE活性增高，1996年，Arbusti

19、ni E11等對61例結(jié)節(jié)患者和80例健康對照組的ACE基因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)病II基因型的血清ACE水平最低，而DD型則顯示最高。近年陸續(xù)有有關(guān)塵肺患者與血清ACE濃度關(guān)系的研究， Gronhagen-Riska等12報道矽肺患者血清ACE增高，國內(nèi)學(xué)者也有相同看法。張繆佳等13對78例塵肺患者及24名健康對照者血清ACE活性進(jìn)行了對比分析，發(fā)現(xiàn)塵肺患者ACE活性明顯高于對照組。本研究亦顯示塵肺患者血清ACE濃度明顯高于對照組。塵肺血清ACE濃度增高的原因：(1)塵肺患者肺功能損害，慢性缺氧，肺血管內(nèi)皮損傷，代償性刺激血管平滑肌細(xì)胞合成ACE增多，(2)與AM ACE活性增強(qiáng)及肺內(nèi)AM數(shù)量增

20、多密切相關(guān)14。(3)ACE是由肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生并直接進(jìn)入肺循環(huán)中，抗原抗體復(fù)合物刺激肺血管內(nèi)皮細(xì)胞可使細(xì)胞損傷導(dǎo)致ACE逸出，同時也刺激肺血管內(nèi)皮的增生15。(4)矽塵對PAM的毒性作用使其崩解死亡，崩解產(chǎn)生的H因子，即緩激肽和激肽刺激肺血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生ACE。由于SiO2等粉塵的長期刺激，產(chǎn)生粉塵性或巨噬細(xì)胞性肺泡炎，進(jìn)而形成肺間質(zhì)纖維化，長期慢性的炎癥刺激，使血清ACE水平增加，體內(nèi)高水平ACE，可誘導(dǎo)肺內(nèi)Ag及醛固酮產(chǎn)生增多，Ag不但能引起血管收縮的活性肽增加，也能引起支氣管痙攣，氣道平滑肌及肺血管收縮，促進(jìn)微血管滲漏和氣道內(nèi)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致氣道高反應(yīng)，血管阻力增加而形成高血壓、C

21、OPD、肺心病等病變，最后因呼衰、心衰而危及生命;同時Ag可促使細(xì)胞因子PDGF-A、TGF-、bFGF的mRNA基因表達(dá)增強(qiáng)2，促進(jìn)膠原合成，促使肺纖維化形成。WLL治療機(jī)制是針對塵肺病理過程的肺泡炎階段，它清除大量PAM后，對其毒性減弱，PAM功能恢復(fù);同時清除大量SiO2粉塵，對肺部的炎性刺激作用減弱，使血清ACE濃度下降，血管緊張素及醛固酮分泌減少，從而使具有促成纖維細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子(PDGF-A、TGF-等)生成減少，可阻止或延緩肺纖維化的形成，尚可改善癥狀，恢復(fù)肺功能，降低心腦血管并發(fā)癥，提高患者生活質(zhì)量。WLL后基因調(diào)控作用恢復(fù)，ACE基因與血清ACE濃度關(guān)系恢復(fù)到正常人群的分

22、布狀態(tài)，以DD型血清ACE濃度最高，且不同基因型血清ACE濃度變化程度以WLL前ACE濃度最高的ID型下降最明顯，進(jìn)一步證明塵肺患者環(huán)境因素對ACE濃度影響的主導(dǎo)地位。WLL清除了大量粉塵及吞塵PAM，去除了病理因素的作用，降低了促使纖維化的細(xì)胞因子的生成，從基因水平進(jìn)一步佐證了WLL治療塵肺病的有效性。本研究樣本數(shù)尚小，觀察時間短，尚需進(jìn)行遠(yuǎn)期療效的隨訪觀察。(本文圖片見封三)(略)【參考文獻(xiàn)】1 陳志遠(yuǎn)，張志浩，車審言.大容量全肺灌洗術(shù)醫(yī)療護(hù)理常規(guī)及操作規(guī)程.北京 北京科技出版社， 2004，26.2 木宏實(shí).動脈硬化細(xì)胞分子生物學(xué)病態(tài)治療.1994，545.3 Song L,Wang D

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