常見的生化與分子生物學技術(shù)大串講ppt課件

1、電泳電泳是指帶電的顆?；蛏锓肿釉谕饧与妶鲎饔孟?，向帶相反電荷的電極作定向移動的現(xiàn)象。顯然，帶電粒子或分子的大小、外形、所帶的凈電荷多少等都會影響它們的電泳速度。待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等存在的差異，使得帶電分子的“泳動速度不同，因而可以利用電泳技術(shù)對生物分子進行分離、鑒定或純化。電泳技術(shù)有多種方式，但一般根據(jù)有無支持物將其分為無支持物的自由電泳和有支持物的區(qū)帶電泳兩大類。區(qū)帶電泳包括以濾紙作為支持物的紙電泳、以醋酸纖維素等薄膜為支持物的薄層電泳，以及與凝膠例如瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠為支持物的凝膠電泳。等電聚焦凝膠電泳、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、二維電泳、脈沖場凝膠

2、電泳。電泳法分離三種不同的氨基酸電泳法分離三種不同的氨基酸透析和超濾透析和超濾 J透析是利用蛋白質(zhì)等生物大分子不能透過半透膜，但小分子物質(zhì)和離子能夠通過而進行純化的一種方法。這種方法經(jīng)常被用于去除大分子溶液中的小分子物質(zhì)。J超濾 對透析原理進行了改進，它利用具有一定大小孔徑的微孔濾膜，在常壓、加壓或減壓條件下對生物大分子溶液進行過濾，使大分子保留在超濾膜上面的溶液中，小分子物質(zhì)及水過濾出去，從而達到脫鹽、濃縮或更換緩沖液的目的。透析方法示意圖透析方法示意圖超濾方法示意圖超濾方法示意圖 沉淀與離心沉淀與離心J沉淀是根據(jù)不同蛋白質(zhì)在特定條件下溶解性不同而對它們進行選擇性沉淀從而達到分離目的的一種粗

3、純化方法。它通常用于將目的蛋白從大體積的粗抽取物中沉淀出來。這種方法既能除去許多雜質(zhì)，又有濃縮之效。J實現(xiàn)選擇性沉淀的方法有改變pH 或改變離子強度或者加入特殊的化合物。無論是哪一種沉淀方法，產(chǎn)生的沉淀物都需要借助于離心的手段與上清分開。J離心方法是根據(jù)分子的特征密度來分離大分子。如果一種顆粒的密度大于其介質(zhì)溶液的密度，那么這種顆粒有可能通過溶液發(fā)生沉降。顆粒沉降的速度與顆粒與介質(zhì)溶液之間的密度之差成正比。任何一種顆粒在離心力作用下通過溶液發(fā)生沉降。J差速離心和密度梯度離心層析層析層析法又被稱為色譜。所有的層析系統(tǒng)都由兩相組成：一個是固定相，它可以是固體物質(zhì)，也可以是固定在固體物質(zhì)上的成分；另

4、一個是由可以流動的物質(zhì)組成的流動相，如水和各種溶劑。當待分離樣品隨著流動相通過固定相時，各組份在理化性質(zhì)上的差別使得各自與兩相發(fā)生相互作用如吸附、溶解或結(jié)合等的能力不同，最終導致它們在兩相中的分配不同，而且隨著流動相向前移動，各組份會不斷地在兩相中進行再分配。與固定相相互作用力越弱的組份，隨流動相移動時受到的阻力就越小，向前移動的速度越快；反之，與固定相相互作用越強的組份，向前移動速度越慢。經(jīng)過分部收集流出液，可得到樣品中所含的各單一組份，從而達到分離各組份的目的。表表1 1 主要的層析方法及其原理主要的層析方法及其原理名稱分離原理吸附層析各組份在作為固定相的固體吸附劑表面的吸附能力不同分配層

5、析各組份在流動相和靜止液相（固定相）中的分配系數(shù)不同離子交換層析固定相是離子交換樹脂，各組份因所帶電荷狀況不同與離子交換樹脂的親和力不同凝膠層析固定相為多孔凝膠，各組份的分子大小不同，因而在通過凝膠時受阻滯的程度不同疏水層析固定相為帶有強疏水基團的樹脂，各組分的疏水性不同，導致其與樹脂的結(jié)合能力不同親和層析固定相只能與一種待分離組份專一結(jié)合，以此達到和無親和力的其它組份分離的目的離子交換樹脂分離氨基酸離子交換樹脂分離氨基酸分子篩示意圖分子篩示意圖親和層析示意圖親和層析示意圖蛋白質(zhì)研究方法蛋白質(zhì)研究方法假定你發(fā)現(xiàn)一種新的蛋白質(zhì)：蛋白質(zhì)假定你發(fā)現(xiàn)一種新的蛋白質(zhì)：蛋白質(zhì)X X1. 1. 如何得到這種

6、蛋白質(zhì)如何得到這種蛋白質(zhì)? ? 蛋白質(zhì)的分離、純化技術(shù)蛋白質(zhì)的分離、純化技術(shù)2. 2. 這種蛋白質(zhì)的大小？這種蛋白質(zhì)的大??？ （SDS-PAGESDS-PAGE）3.3.它的它的pIpI是多少？是多少？ （等電聚焦）（等電聚焦）4. 4. 其他細胞或其他生物體內(nèi)是否存在？其他細胞或其他生物體內(nèi)是否存在？ （WesternWestern印跡）印跡）5. 5. 其一級結(jié)構(gòu)如何？其一級結(jié)構(gòu)如何？ （序列分析）（序列分析）6.6.其三維結(jié)構(gòu)又如何？其三維結(jié)構(gòu)又如何？ X- X-射線衍射和核磁共振射線衍射和核磁共振蛋白質(zhì)純化蛋白質(zhì)純化一、準備工作：要解決三個問題：（1純化蛋白質(zhì)的目的；（2目標蛋白的測活

7、方法；（3純化蛋白質(zhì)的原料。二、純化步驟：（1破碎細胞或組織混合和勻漿）；（2去除殘渣離心）；（3沉淀/濃縮硫酸銨或聚乙二醇）；（4純化層析）；（5鑒定蛋白質(zhì)和酶純化的常見方法和方案設(shè)計分離純化蛋白質(zhì)的各種方法都是利用蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，例如溶解性、質(zhì)量和形狀、表面電荷、表面疏水性、與特定配體結(jié)合的性質(zhì)等。常用的方法有：沉淀溶解性）； 離子交換電荷）；聚焦層析電荷）；凝膠過濾大小和形狀）；疏水作用層析疏水性）；親和層析與特定配體的特異性結(jié)合）。蛋白質(zhì)純化的準備工作。在進行蛋白質(zhì)純化之前首先要解決三個問題：（1純化蛋白質(zhì)的目的；（2目標蛋白的測活方法；（3純化蛋白質(zhì)的原料。一個典型的蛋白質(zhì)純化方案

8、開始于完整的組織，一般經(jīng)過四個階段：（1破碎細胞或組織混合和勻漿）；（2去除殘渣離心）；（3沉淀/濃縮硫酸銨或聚乙二醇）；（4純化層析）；（4鑒定，包括純度、大小或pI的測定。蛋白質(zhì)純度的鑒定（1電泳法：如聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦和毛細管電泳等，純凈的蛋白質(zhì)電泳的結(jié)果應(yīng)該是一條帶。如果使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，則應(yīng)該特別小心，因為SDS能夠破壞蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)，如果一種蛋白質(zhì)由不同的亞基組成，則會出現(xiàn)幾條帶。此外，電泳法檢測蛋白質(zhì)的純度時，應(yīng)取分布在蛋白質(zhì)等電點兩側(cè)的兩個不同的pH 值分別進行檢測，這樣得出的結(jié)論才更可靠；（2化學法：N-端測定，C-端測定。純品蛋白質(zhì)應(yīng)該具有恒定的N

9、-端或C-端組成。如果一種蛋白質(zhì)只有一條鏈組成，則只會檢測到一種N-端或C-端氨基酸；（3儀器法：HPLC或質(zhì)譜。如果一種蛋白質(zhì)樣品在HPLC上只表現(xiàn)單一的峰，則可視為其為純品；如果純化的是一種已知蛋白，經(jīng)質(zhì)譜分析測定出來的相對分子量與實際的值一致，那么也可認為它是純品。 等電聚焦需要在凝膠中加入兩性電解質(zhì)，以在陽極和陰極之間建立遞增的pH梯度，處在其中的蛋白質(zhì)分子在電場的作用下遷移，最后各自移動到并聚焦于與其pI相當?shù)膒H位置上。于是通過等電聚焦，不僅可以實現(xiàn)pI不同的蛋白質(zhì)之間的分離，而且還可以測定出各種蛋白質(zhì)的pI蛋白質(zhì)的雙向電泳蛋白質(zhì)的雙向電泳蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定直

10、接測定法間接測定法： 先得到某一種蛋白質(zhì)基因的核苷酸序列，然后根據(jù)通用的遺傳密碼表間接推導出由其決定的氨基酸序列。表表2 各種印跡技術(shù)各種印跡技術(shù)印跡類型 轉(zhuǎn)移到膜上的分子探針獲得的信息Southern DNA片段 放射性標記的互補RNA或DNA 基因結(jié)構(gòu)等 Northern RNA放射性標記的互補RNA或DNA特定RNA的大小、分布和含量Western 蛋白質(zhì) 一級抗體和與酶偶聯(lián)的二級抗體 特定蛋白質(zhì)的大小、分布和含量WesternWestern印跡印跡4基因芯片是隨著“人類基因組計劃和其它模式生物基因組計劃的進展而發(fā)展起來一門新技術(shù)，也叫DNA芯片、DNA微陣列或寡核苷酸陣列，它采用原位合

11、成或顯微打印手段，將數(shù)以萬計的DNA探針固定在支持物表面上，產(chǎn)生二維DNA探針陣列，然后，與標記的樣品分子進行雜交，通過檢測雜交信號的強弱，對生物樣品進行快速、并行和高效地檢測或醫(yī)學診斷，由于常用硅芯片作為固相支持物，且在制備過程運用了計算機芯片的制備技術(shù)，所以稱之為基因芯片技術(shù)?；蛐酒云錈o可比擬的信息量、高通量、快速和準確地分析基因的本領(lǐng)，在基因組功能研究、臨床診斷及新藥開發(fā)等方面顯示出巨大的威力，已成為人類研究和維護生命的一大利器，因此，被譽為是基因功能研究領(lǐng)域最偉大的發(fā)明之一。4一般說來應(yīng)用基因芯片分5步進行：（1生物學問題的提出和芯片設(shè)計與制備；（2樣品制備；（3生物雜交反應(yīng)；（4

12、結(jié)果探測；（5數(shù)據(jù)處理和建模。使用基因芯片對正常細胞和癌細胞進行基因表達分析比使用基因芯片對正常細胞和癌細胞進行基因表達分析比較較RNA干擾干擾RNAi）4RNA干擾是指通過雙鏈RNA使目的mRNA降解，從而特異性地抑制目的蛋白表達的現(xiàn)象。4miRNA是指微RNA，其長度通常為21nt25 nt，由內(nèi)源基因編碼，前體含有不完善的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，能夠識別多個目標，通常與目標mRNA的3-UTR結(jié)合，從而阻止它們的翻譯，但并不導致目標mRNA的水解。4siRNA是指短干擾RNA，長度也在21nt25 nt之間，但多數(shù)來自外源的雙鏈RNA，作用方式通常為高度特異性的，與目標mRNA結(jié)合后，導致它們的降解。

13、4RNAi的作用機制4RNAi的生物學意義目前普遍認為，它在植物和昆蟲體內(nèi)相當于一種免疫系統(tǒng)，起著保衛(wèi)基因組的作用，它能夠防止外來的有害基因或病毒基因整合到植物基因組中，此外，它還參與基因表達的調(diào)控。miRNA的產(chǎn)生和作用機制的產(chǎn)生和作用機制siRNAsiRNA的產(chǎn)生和作用機制的產(chǎn)生和作用機制哺乳動物成熟的紅細胞內(nèi)還有哪些代謝途徑？4哺乳動物成熟的紅細胞已經(jīng)喪失了各種細胞器，因此，那些發(fā)生在特定細胞器內(nèi)的或部分反應(yīng)發(fā)生在特定細胞器內(nèi)的代謝途徑也就不復存在。例如，發(fā)生在線粒體內(nèi)的TCA循環(huán)、氧化磷酸化和脂肪酸氧化，發(fā)生在細胞核內(nèi)的DNA復制、DNA轉(zhuǎn)錄及其后加工，部分反應(yīng)發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的糖異生、發(fā)

14、生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的磷脂合成。被保留的代謝途徑主要是對紅細胞的功能所必需的兩條代謝途徑：一條是糖酵解，另外一條是PPP。糖酵解是它獲取ATP的唯一手段，通過乳酸發(fā)酵維持NAD+的再生，而產(chǎn)生的乳酸通過乳酸循環(huán)在肝細胞內(nèi)重新轉(zhuǎn)變成葡萄糖。PPP是維持其細胞膜的完整性和血紅蛋白的血紅素鐵處于二價態(tài)所必需的。 如何計算ATP的得失？4細胞內(nèi)許多代謝途徑伴隨著ATP的消耗或合成。計算一種物質(zhì)在特殊的條件下的合成或分解能產(chǎn)生或消耗多少ATP已成為許多考試的焦點例如1分子葡萄糖在破傷風桿菌氧化最多能產(chǎn)生多少ATP或1分子葡萄糖在含有大量的砷酸的紅細胞內(nèi)產(chǎn)生多少ATP？）。遇到這樣的問題，實際上只要全面考慮就行了

15、，需要考慮以下幾點：（1有沒有或有多少消耗ATP或其他能量貨幣的反應(yīng)？注意其他能量貨幣與ATP是等價的，另外還要注意ATP是怎樣被消耗的，即ATP變成ADP，還是變成AMP？如果是后者，要當成消耗2個ATP才行；（2有多少產(chǎn)生ATP或其他能量貨幣的反應(yīng)？注意ATP合成有底物水平的磷酸化和氧化磷酸化。在考慮氧化磷酸化的時候，要記住線粒體內(nèi)的1分子NADH或FADH2進入呼吸鏈分別產(chǎn)生2.5個和1.5個ATP。至于細胞液內(nèi)產(chǎn)生的NADH如何進入呼吸鏈取決于它通過何種穿梭系統(tǒng)進入？如果是甘油-3-磷酸脫氫酶穿梭系統(tǒng)，是產(chǎn)生1.5個ATP，否則是產(chǎn)生2.5個ATP；（3反應(yīng)系統(tǒng)之中有無干擾ATP產(chǎn)生的

16、化學試劑，例如有無解偶聯(lián)劑砷酸或DNP或呼吸鏈的抑制劑；（4反應(yīng)系統(tǒng)有氧還是無氧？如果有氧要考慮氧化磷酸化，無氧只要考慮底物水平的磷酸化。4對于1分子葡萄糖在破傷風桿菌氧化最多能產(chǎn)生多少ATP的問題，首先需要想到破傷風桿菌是一種厭氧菌，它只能通過糖酵解產(chǎn)生ATP，因此產(chǎn)生的ATP數(shù)目是2個。至于1分子葡萄糖在含有大量的砷酸的紅細胞內(nèi)產(chǎn)生多少ATP的問題要考慮到紅細胞沒有線粒體，故只能通過糖酵解產(chǎn)生ATP，其次要考慮到砷酸在糖酵解那一步由甘油醛-3-磷酸脫氫酶催化的反應(yīng)中代替無機磷酸以后，形成的甘油酸-1-砷酸-3-磷酸很容易自發(fā)水解，而導致后面的底物水平磷酸化不能進行，因此最后產(chǎn)生的ATP數(shù)目

17、是為0。實例實例生物大分子生物合成的極性4DNA、RNA、蛋白質(zhì)、多糖和脂肪酸的生物合成都有一定的方向性，這就是所謂的極性問題。為方便記憶，可以放在一起比較。DNA和RNA合成的方向都是從53，而蛋白質(zhì)生物合成的方向總是從N端C端，閱讀mRNA模板的方向也總是從53，多糖的合成以糖原為例，總是從還原端向非還原端，而脂肪酸的合成從甲基端向羧基端。在書寫DNA、RNA和蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)的時候，正好按照它們生物合成的方向來寫。然而，人工合成核酸和蛋白質(zhì)的方向正好與生物合成的方向相反，這一點需要注意。DNA復制、轉(zhuǎn)錄和翻譯的校對機制4校對的目的是維持各自的忠實性。DNA復制是通過DNA聚合酶內(nèi)在的3-

18、外切酶活性來校對；RNA聚合酶本身無任何外切酶活性，但通過特殊的蛋白質(zhì)也可以進行校對；氨酰-tRNA合成酶具有校對中心，將誤載的氨基酸切除。如何理解“信號學說”？4“信號學說是用來解釋細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)如何各得其所、各就各位的。其基本內(nèi)容是：各種蛋白質(zhì)在細胞中的最終定位由多肽鏈本身所具有的特定氨基酸序列決定。這些特殊的氨基酸序列起著一種信號向?qū)У淖饔茫虼吮环Q為信號序列。在某種意義上，一個蛋白質(zhì)分子上的信號序列相當于它特有的“分子郵政編碼”。如果一個蛋白質(zhì)缺乏任何一種信號序列，則會留在其“默許的位置細胞液，如參與糖酵解和磷酸戊糖途徑的酶。4注意有兩類指導蛋白質(zhì)分撿的信號，需要將它們區(qū)分開來：一類稱為信號肽，其本質(zhì)是一段在一級結(jié)構(gòu)上連續(xù)的氨基酸序列，通常有1