富血小板血漿制備技術(shù)及其組分的研究進(jìn)展

1、Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, December 2014, Vol. 28, No.121560富血小板血漿制備技術(shù)及其組分的研究進(jìn)展付維力 李棋 李箭【 摘 要】 目的 總結(jié)富血小板血漿 (platelet rich plasma, PRP 的制備技術(shù)及其組分的研究進(jìn)展。 方法 廣泛 查閱近年國(guó)內(nèi)外有關(guān) PRP 的作用機(jī)制、 制備方法以及組成等相關(guān)文獻(xiàn), 并進(jìn)行總結(jié)分析。 結(jié)果 PRP促進(jìn)生物學(xué)修復(fù) 作用的發(fā)揮依賴于一系列序貫發(fā)生的級(jí)聯(lián)細(xì)胞分子事件。 PRP 中含有高濃度血小板, 其激活后釋放大量活性因子,

2、 還含 有少量的白細(xì)胞和紅細(xì)胞。 PRP 的制備基于血小板的濃縮技術(shù), 不同的制備技術(shù)獲得的血小板濃度、 復(fù)蘇率和組分也不 相同。 結(jié)論 PRP的制備技術(shù)目前尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn), 不同的制備方法獲得的不同成分和不同濃度的 PRP , 為臨床患者選 擇最適合的個(gè)體化 PRP 產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)?！?關(guān)鍵詞 】 富血小板血漿 制備技術(shù) 組分RESEARCH PROGRESS OF PREPARATION AND COMPONENTS OF PLATELET RICH PLASMA/FU Weili, LI Qi, LI Jian. Department of Orthopaedics, West China

3、Hospital, Sichuan University, Chengdu Sichuan, 610041, P.R.China. Corresponding author: LI Jian, E-mail: hxlijian.china【 Abstract 】 Objective To review the research progress of the preparation and components of the platelet rich plasma (PRP. Methods The recent literature concerning the biological me

4、chanism, preparation, and components of PRP was analyzed and summarized. Results The biological function of PRP depends on a series of intricate cascade of cellular and molecular events. PRP contains different concentrations of platelets, which would release a large number of the activated molecules

5、, and also contains a small amount of white blood cells and red blood cells. The preparation of PRP is based on platelet concentration. Different preparation techniques would lead to different platelet concentrations, recovery ratios, and components. Conclusion There is no uniform standard for the p

6、reparation of PRP. Different preparation methods and technical parameters of PRP will get different components and different concentrations of PRP, which also provide a reference for clinicians to select the most appropriate PRP for individual patient.【 Key words】 Platelet rich plasma Preparation me

7、thod ComponentFoundation items: National Natural Science Foundation of China (81301560; China Post-doctoral Science Foundation (2012M521698富血小板血漿 (platelet rich plasma, PRP 含有超 過生理濃度數(shù)倍的血小板, 作為一種自體血來源的產(chǎn) 品, 因獲取過程創(chuàng)傷較小、 制備簡(jiǎn)便及具有生物學(xué)治療 潛能等方面的優(yōu)點(diǎn), 被廣泛用于組織再生、 創(chuàng)面修復(fù)、 感染治療和功能重建等領(lǐng)域 1-2。 PRP 不僅能釋放大 量生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子發(fā)揮重要的

8、生物學(xué)修復(fù)功能, 還參與了血小板凝固和纖維蛋白產(chǎn)生的止血和免疫應(yīng) 答進(jìn)程。 PRP 發(fā)揮生物學(xué)治療作用有賴于血小板分泌 的蛋白分子和血漿信號(hào)蛋白等組分。目前, 對(duì)于用于 臨床的 PRP 制備技術(shù)尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn), 不同制備技術(shù)獲DOI :10.7507/1002-1892.20140337基金項(xiàng)目 :國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (81301560 ; 中國(guó)博士后科 學(xué)基金資助項(xiàng)目 (2012M521698作者單位 :四川大學(xué)華西醫(yī)院骨科 (成都 610041通訊作者 :李箭, 教授, 博士生導(dǎo)師, 研究方向 :運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué) /關(guān)節(jié)鏡外 科, E-mail: hxlijian.china網(wǎng) 絡(luò) 出 版 時(shí)

9、 間 :2014-11-21 17:12:28;網(wǎng) 絡(luò) 出 版 地 址 :http:/www. 得的 PRP 所含的血小板濃度和組分也不同, 導(dǎo)致生物 學(xué)治療效果各異 3-8。現(xiàn)就 PRP 的作用機(jī)制、 制備、 組 分等相關(guān)研究熱點(diǎn)作一總結(jié)。1 PRP的作用機(jī)制PRP 生物學(xué)作用的發(fā)揮依賴于一系列序貫發(fā)生的 級(jí)聯(lián)細(xì)胞分子事件, 通過多層次旁分泌 /自分泌的蛋 白因子介導(dǎo)損傷修復(fù)和組織再生過程。具體作用機(jī)制 為 :PRP 激活后, 血小板釋放大量的活性因子促進(jìn)組織 形成, 活性因子首先錨定相關(guān)細(xì)胞的增殖和遷移, 再介 導(dǎo)炎性反應(yīng)和血管發(fā)生, 然后調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)蛋白合 成和組織重塑 9。 PRP

10、能用于組織修復(fù), 與其能釋放 大量信號(hào)分子構(gòu)建有利于組織重建的微環(huán)境有關(guān) 10。 此外, PRP 包含的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子在創(chuàng)傷愈合和 組織重塑過程中也發(fā)揮了重要作用 11-12。這些因子通 過激活細(xì)胞表面受體來調(diào)控基因表達(dá), 介導(dǎo)細(xì)胞增殖、 分化, 以及參與基質(zhì)降解和組織重建過程 13。 PRP 提 供的生長(zhǎng)因子還能刺激新生血管形成, 并為受損組織中國(guó)修復(fù)重建外科雜志 2014年 12月第 28卷第 12期1561的再生增加血供和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì), 尤其是血供有限和細(xì)胞 更新較緩慢的肌肉骨骼組織, 如軟骨、 肌腱、 韌帶等 14。 新生的血管將帶來新的細(xì)胞并清除受損組織的碎片。 PRP 促進(jìn)組織愈合

11、的生物學(xué)機(jī)制及臨床相關(guān)性見表 1。表 1 PRP的生物學(xué)機(jī)制及其臨床相關(guān)性Tab.1 The biological mechanism of PRP and their clinical correlations生物學(xué)機(jī)制 Biological mechanism涉及的活性分子 Active molecule臨床意義 Clinical value止血 15-16、 、 、 因 子, 血 管 性血友病因子, Ca 2+和凝 血 酶防止血液丟失和減少異體輸血 免疫應(yīng)答17-20趨 化 因 子, 包 括 CXCL7、 CCL5、 MCP-1和 IL-8; 生 長(zhǎng) 因 子, 包 括 HGF和 TGF-

12、1介 導(dǎo) 炎 性 反 應(yīng), 控 制感染和緩解疼痛 血管生成 21-23VEGF , TGF-1, bFGF , PDGF , EGF , IL-8, 血管生 成素, CXCL12, 基質(zhì)金屬 蛋白酶 1、 2、 9, 內(nèi)皮抑素, 纖維連接蛋白, 血管內(nèi)皮 抑制因子和 2-巨球蛋白改 善 血 供, 治 療 缺 性血壞死疾病 合成代謝 24TGF-1、 PDGF 、 腦 源 性 神 經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 、 IGF-1促 進(jìn) 基 質(zhì) 合 成, 重 塑組織結(jié)構(gòu)2 PRP的組分PRP 中含有高濃度血小板, 血小板激活后能釋放 大量活性分子, 以及少量的白細(xì)胞和紅細(xì)胞 25。血小 板是 PRP 中最主要成分, 其

13、在止血、 凝血及炎性反應(yīng)等 生理及病理過程中發(fā)揮重要作用。 PRP 中血小板濃度 過高或過低都不利于組織愈合, 有學(xué)者提出最有利于 組織愈合的血小板濃度為 (1.53.0 106/L , 約為 全血血小板生理濃度的 38倍 26。在損傷炎癥期后 立即使用血小板對(duì)組織愈合可發(fā)揮最大作用, 因此一 些學(xué)者認(rèn)為 PRP 給藥時(shí)機(jī)選擇的重要性甚至高于所含 血小板的數(shù)量 27。PRP 還含有對(duì)組織愈合存在潛在促進(jìn)作用的其他 細(xì)胞類型。 CD34+細(xì)胞是來源于循環(huán)血單核細(xì)胞的一 類干細(xì)胞, 能為組織愈合創(chuàng)造最佳微環(huán)境28。由于白細(xì)胞對(duì)健康組織存在潛在的損傷, PRP 制備時(shí)是否保 留白細(xì)胞仍存在爭(zhēng)議。一方

14、面, 白細(xì)胞在組織重建和 免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要功能 ; 另一方面, 白細(xì)胞可能 加劇炎性反應(yīng), 例如在損傷炎癥期, 白細(xì)胞中的中性粒 細(xì)胞產(chǎn)生過量的基質(zhì)金屬蛋白酶和 IL , 可能引起肌肉 損傷。中性粒細(xì)胞是對(duì)抗病原微生物和局部炎性反應(yīng) 主要的防御系統(tǒng), 它還釋放大量的蛋白酶和活性氧來 對(duì)抗微生物 29。另一類白細(xì)胞即單核 -巨噬細(xì)胞, 來 源于循環(huán)血單核細(xì)胞, 有助于組織損傷至修復(fù)過程中壞死物質(zhì)的清除。白細(xì)胞如單核和多核粒細(xì)胞可錨定 局部炎性反應(yīng), 適當(dāng)?shù)难仔苑磻?yīng)有利于組織修復(fù)進(jìn)程 ; 再者適當(dāng)濃度的中性粒細(xì)胞還能控制感染 30。含有一 定濃度白細(xì)胞的 PRP 常用于預(yù)防關(guān)節(jié)置換和其他外科

15、 手術(shù)操作中可能發(fā)生的感染 31。 PRP 中通常含有少量 的紅細(xì)胞, 紅細(xì)胞的主要功能是攜帶氧氣, 有利于組織 修復(fù)。此 外, PRP 中 的 PDGF 、 VEGF 、 bFGF 等 蛋 白 濃 度較高 32, 因此有學(xué)者提出含有特定濃度生長(zhǎng)因子 的 PRP 有利于組織修復(fù) 33。 PDGF 是組織愈合初期 最關(guān)鍵的生長(zhǎng)因子, 能促進(jìn)相關(guān)組織細(xì)胞, 尤其是干細(xì) 胞、 成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的趨化和有絲分裂, 還能 趨化炎性細(xì)胞產(chǎn)生級(jí)聯(lián)生長(zhǎng)因子釋放 ; TGF-能促進(jìn) 細(xì)胞增殖和分化, 基質(zhì)合成 ; VEGF 與內(nèi)皮細(xì)胞表面受 體結(jié)合后促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和有絲分裂, 刺激血管生 成 ; HGF

16、能協(xié)同 VEGF 促進(jìn)血管化, 但其促進(jìn)骨分化 作用尚不明確 ; bFGF 和 IGF 在組織修復(fù)、 成熟和重塑 階段都發(fā)揮重要作用 34-35。 PRP 中還包括促遷移、 黏 附、 增殖和分化的細(xì)胞因子和黏附分子等, 如基質(zhì)細(xì) 胞衍生因子 1激活介導(dǎo)細(xì)胞遷移和歸巢到修復(fù)區(qū)。PRP 中各種生長(zhǎng)因子在組織愈合的不同階段和不同部 位發(fā)揮不同的作用, 形成錯(cuò)綜復(fù)雜的信號(hào)分子調(diào)控網(wǎng) 絡(luò)。此外, PRP 還能釋放一些表現(xiàn)抑制作用的蛋白, 如 TGF-1。 PRP 中凝血酶的準(zhǔn)確作用尚不明確, 凝血 酶是纖維蛋白原向纖維蛋白轉(zhuǎn)化的前提條件, 還包括 血小板分泌生長(zhǎng)因子, 有研究表明外源性凝血酶激活 PRP

17、 可能降低脫鈣骨基質(zhì)誘導(dǎo)成骨的能力 36。纖維蛋 白也是 PRP 重要成分, 它能產(chǎn)生一個(gè)合適的三維結(jié)構(gòu), 為修復(fù)細(xì)胞提供良好支架, 有利于生長(zhǎng)因子的分泌和 組織修復(fù), 還可收縮創(chuàng)面, 促進(jìn)凝血, 刺激組織再生, 促 進(jìn)創(chuàng)面閉合 37。3 PRP的制備3.1 PRP 的分離及采集方法PRP 的制備是基于血小板濃縮過程, 根據(jù)全血不 同成分的密度經(jīng)梯度離心分離獲得。首先無菌條件下 采集自體靜脈血于抗凝管中。 PRP 制備中最常用的 抗凝劑是枸櫞酸鈉, 它是一種較弱的鈣螯合劑, 可通 過抑制凝血和血小板功能達(dá)到抗凝效果, 用于 PRP 制 備副作用較小 38-39。將采集的自體靜脈血采用 2次 離

18、心血漿提取法獲得 PRP :第 1階段為相對(duì)低速離心 (100 g , 離心 10 min , 使血漿和血小板與紅細(xì)胞和 白細(xì)胞分開 ; 第 2階段為相對(duì)高速離心 (400 g , 離心 10 min , 進(jìn)一步濃縮 PRP 和分離貧血小板血漿組分, 獲得最佳的血小板濃度 40。離心后,各成分根據(jù)比重Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, December 2014, Vol. 28, No.121562不同分為 3層 :下層為紅細(xì)胞, 中間層為白細(xì)胞和血小 板, 上層為淡黃色血漿層, 吸取中間層混勻即為 PRP 。

19、PRP 在抗凝狀態(tài)下一般可保存 8 h。但目前對(duì)是否需 要進(jìn)行第 2階段離心仍存在爭(zhēng)議, 部分商業(yè)化產(chǎn)品均 無這一步驟 41。3.2 血小板激活載體的選擇PRP 必須通過激活血小板來釋放生長(zhǎng)因子, 因此 血小板激活載體的選擇非常重要。既往研究采用牛凝 血酶作為血小板激活載體, 但近年研究表明其所含的 抗牛凝血因子 V 抗體可與人凝血因子 V 交叉反應(yīng), 引 起凝血功能障礙, 因此已不再使用 42。目前較常用的 血小板激活載體為氯化鈣, 其優(yōu)點(diǎn)是安全、 無朊蛋白 或病毒暴露風(fēng)險(xiǎn), 但激活速度較慢, 活化血小板至少 需要 20 min43。近年來, 自體凝血酶試劑盒被認(rèn)為是 安全、 快速、 高效的

20、血小板激活載體, 它是通過將 10%氯化鈣和制備的少量 PRP 或血液混合裝于帶有負(fù)電 荷粒子 (例如玻璃纖維 的注射器中, 室溫條件下孵育 1015 min, 然后過濾去除細(xì)胞和纖維蛋白成分, 即可 作為血小板激活載體用于激活血小板。采用該方法制 備的自體凝血酶, 常通過雙針筒注射器與 PRP 同時(shí)注 射 36, 經(jīng)自體凝血酶活化血小板后, TGF-1和 PDGF-AB 等生長(zhǎng)因子會(huì)立即釋放 44。3.3 不同制備方法對(duì) PRP 組分的影響目前, 對(duì)于用于臨床的 PRP 產(chǎn)品的制備技術(shù)尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn), 主要涉及 3個(gè)基本技術(shù) :重力血小板封存 (gravitationalplatelet se

21、questration, GPS 技術(shù) ; 標(biāo)準(zhǔn) 的細(xì)胞分離技術(shù) ; 自體選擇性細(xì)胞過濾技術(shù) (血小板 過濾 。 不同方法制備的 PRP , 其組分有一定差異 45-47。 目前已有多種商業(yè)化 PRP 制備裝置, 獲得的血小板濃 度、 復(fù)蘇率和組分均不相同 (表 2 。任何 PRP 產(chǎn)品最 終的血小板濃度取決于采集全血的體積、 制備系統(tǒng)、 離 心力與溫度和時(shí)間、 血小板復(fù)蘇率、 懸浮一定濃度血小 板的血漿體積、 白細(xì)胞和 /或紅細(xì)胞的相對(duì)濃度、 凝血 酶的沾染、 保存方法與時(shí)間, 此外還與患者個(gè)體因素有 關(guān), 如外周靜脈血的參數(shù)、 有無并發(fā)癥、 年齡和循環(huán)血 中生長(zhǎng)因子和細(xì)胞組分等, 如血脂高

22、將增加血小板濃 度 48- 49。4展望目前, 不同的制備方法和技術(shù)參數(shù)可獲得不同組 分和不同濃度的 PRP , 為臨床醫(yī)生根據(jù)不同患者需要 選擇最適合的 PRP 產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)。 除了制備方法外, PRP 的有效性還取決于使用方法、 患者個(gè)體差異及適 應(yīng)證的選擇等因素。相信隨著這些問題的解決, PRP 將更好地向臨床轉(zhuǎn)化。5參考文獻(xiàn)1 Arshdeep, Kumaran MS. Platelet-rich plasma in dermatology: boon or a bane? Indian J Dermatol Venereol Leprol, 2014, 80(1: 5-14.表 2

23、 PRP的制備裝置、 血小板濃度、 復(fù)蘇率和組分Tab.2 PRP preparation devices, platelet concentration, recovery ratio, and components制備裝置 Device增加的血小板濃度Platelet concentration increase復(fù)蘇率Recovery ratio組分 ComponentBiomet GPSTM 3.2倍 70%富血小板血漿, 白細(xì)胞, 少量紅細(xì)胞 Harvest 4.6倍 65%72%富血小板血漿, 白細(xì)胞, 少量紅細(xì)胞 SmartPrep24.0倍 富血小板血漿, 白細(xì)胞, 少量紅細(xì)胞

24、BMAC TM 4.0倍 富血小板血漿, 白細(xì)胞, 少量紅細(xì)胞 Symphony TM 富血小板血漿, 白細(xì)胞, 少量紅細(xì)胞 3i PCCS 富血小板血漿, 白細(xì)胞, 少量紅細(xì)胞 Haemonetics 46倍 75%濃縮血小板, 沒有血漿、 白細(xì)胞和紅細(xì)胞 Angel TM 4.3倍 70%濃縮血小板, 白細(xì)胞, 少量紅細(xì)胞 MAGELLAN 5.1倍 76%濃縮血小板, 白細(xì)胞, 少量紅細(xì)胞 AutoloGel System12倍 78%低濃度血小板血漿, 少量白細(xì)胞Smart Prep 低濃度血小板血漿, 少量白細(xì)胞Cascade Medical FIBRINET System12倍 7

25、8%富血小板纖維蛋白膜Choukroun 12倍 70%富血小板纖維蛋白, 白細(xì)胞GenesisCS 6倍 68%濃縮血小板, 白細(xì)胞Secquire 1.6倍 31%血小板和血漿Arthrex ACP 血小板和血漿Vivostat 6倍 65%富血小板纖維蛋白S&Ns CaptionTM 4.3倍 濃縮血小板, 沒有血漿ATR -curasan Set 濃縮血小板, 沒有血漿中國(guó)修復(fù)重建外科雜志 2014年 12月第 28卷第 12期 15632 Dhillon MS, Behera P, Patel S, et al. Orthobiologics and platelet rich pl

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