第七章生物大分子的色譜分離和純化ppt課件

1、復(fù)復(fù) 習(xí)習(xí)濃差極化濃差極化濃差極化是指在超濾過程中，由于水透濃差極化是指在超濾過程中，由于水透過膜，因過膜，因而在膜表面的溶質(zhì)濃度增高，形成梯度，而在膜表面的溶質(zhì)濃度增高，形成梯度，在濃度在濃度梯度的作用下，溶質(zhì)與水以相反方向擴(kuò)梯度的作用下，溶質(zhì)與水以相反方向擴(kuò)散，在達(dá)散，在達(dá)到平衡狀態(tài)時，膜表面形成一溶質(zhì)濃度到平衡狀態(tài)時，膜表面形成一溶質(zhì)濃度分布邊界分布邊界層，它對水的透過起著阻礙作用層，它對水的透過起著阻礙作用.復(fù)復(fù) 習(xí)習(xí)膜的污染膜的污染膜分離過程中隨著操作時間的增加，膜膜分離過程中隨著操作時間的增加，膜透過流透過流速的迅速下降，溶質(zhì)的截留率也明顯下速的迅速下降，溶質(zhì)的截留率也明顯下降，這

2、降，這被稱為膜的污染。污染是由膜的劣化和被稱為膜的污染。污染是由膜的劣化和水生物水生物(附生附生)污垢所引起的。污垢所引起的。復(fù)復(fù) 習(xí)習(xí)防止膜污染的方法防止膜污染的方法（1預(yù)處理法預(yù)處理法調(diào)整供給液的調(diào)整供給液的pH值或添加阻氧化劑來防止化值或添加阻氧化劑來防止化學(xué)學(xué)劣化；預(yù)先清除供給液中的微生物，以防止劣化；預(yù)先清除供給液中的微生物，以防止生生物性劣質(zhì)等。物性劣質(zhì)等。 （2開發(fā)抗污染的膜開發(fā)抗污染的膜（3加大供給液的流速加大供給液的流速 第一節(jié)第一節(jié) 色譜概論色譜概論一、色譜的概念一、色譜的概念色譜層析是一個建立在吸附、分配、離子交換、色譜層析是一個建立在吸附、分配、離子交換、親和力和分子大

3、小等基礎(chǔ)上的分離過程。又稱色親和力和分子大小等基礎(chǔ)上的分離過程。又稱色層分離。層分離。二、色譜的特點二、色譜的特點能夠把各個有關(guān)的組成成分從復(fù)雜的混合物中分離并能夠把各個有關(guān)的組成成分從復(fù)雜的混合物中分離并檢測出來。檢測出來。它是利用不同組分在相對運(yùn)動、相互不相溶的兩相中它是利用不同組分在相對運(yùn)動、相互不相溶的兩相中其中靜止的一相為固定相，相對運(yùn)動的一相為其中靜止的一相為固定相，相對運(yùn)動的一相為流動相），吸附能力、分配系數(shù)、離子交換能力、流動相），吸附能力、分配系數(shù)、離子交換能力、親和力和分子大小等性質(zhì)的微小差別。經(jīng)過連續(xù)親和力和分子大小等性質(zhì)的微小差別。經(jīng)過連續(xù)多次在兩相中的質(zhì)量交換，從而使

4、不同組分得以多次在兩相中的質(zhì)量交換，從而使不同組分得以分離，這就是色譜法所依據(jù)的基本原理。分離，這就是色譜法所依據(jù)的基本原理。必要條件必要條件充分條件充分條件2. 色譜具有高效、快速和靈敏的特點色譜具有高效、快速和靈敏的特點色譜分離圖示色譜分離圖示 根據(jù)混合物中，溶質(zhì)在根據(jù)混合物中，溶質(zhì)在互不相溶的兩相之間分互不相溶的兩相之間分配行為的差別，引起溶配行為的差別，引起溶質(zhì)移動速度的不同而進(jìn)質(zhì)移動速度的不同而進(jìn)行分離的方法。行分離的方法。互不相溶的兩相分別稱互不相溶的兩相分別稱為：固定相和流動相。為：固定相和流動相。色譜分離圖示 三三 、層析的分類、層析的分類 根據(jù)溶質(zhì)分子與固定相相互作用的機(jī)理不

5、同的分類根據(jù)溶質(zhì)分子與固定相相互作用的機(jī)理不同的分類凝膠過濾法凝膠過濾法分配層析法分配層析法離子交換色層分離法離子交換色層分離法吸附層析法吸附層析法疏水作用色層分離法疏水作用色層分離法金屬螯合色層分離法金屬螯合色層分離法共價作用色層分離法共價作用色層分離法 根據(jù)實驗技術(shù)的分類根據(jù)實驗技術(shù)的分類低壓層析技術(shù)低壓層析技術(shù)中壓層析技術(shù)中壓層析技術(shù)高壓層析技術(shù)高壓層析技術(shù)電泳法電泳法操作壓力在操作壓力在0.5MPa-5MPa之間之間操作壓力在操作壓力在5Mpa-40MPa之間之間操作壓力小于操作壓力小于0.5MPa靠溶質(zhì)分子在電場中的移動速度靠溶質(zhì)分子在電場中的移動速度 不同而分離不同而分離 根據(jù)固定

6、相的形狀不同的分類：根據(jù)固定相的形狀不同的分類： 柱層析法柱層析法紙層析法紙層析法薄層層析法薄層層析法 根據(jù)流動相的物態(tài)不同的分類根據(jù)流動相的物態(tài)不同的分類 汽相層析法汽相層析法液相層析法液相層析法 操作方式不同的分類操作方式不同的分類迎頭法迎頭法頂替法頂替法洗脫分析法洗脫分析法層析分類 分類原則分類原則類型類型特征特征據(jù)溶質(zhì)分子與固定據(jù)溶質(zhì)分子與固定相相互作用的機(jī)理相相互作用的機(jī)理不同不同吸附色譜吸附色譜離子交換色譜離子交換色譜疏水作用層疏水作用層金屬螯合色譜金屬螯合色譜共價作用色譜共價作用色譜分配色譜分配色譜凝膠過濾凝膠過濾親和色譜親和色譜吸附力不同吸附力不同各物質(zhì)與固定相之間的離子交換能

7、力的不同各物質(zhì)與固定相之間的離子交換能力的不同各物質(zhì)與固定相之間的疏水作用的強(qiáng)弱不同各物質(zhì)與固定相之間的疏水作用的強(qiáng)弱不同各物質(zhì)與固定相上的金屬離子的絡(luò)合能力的不同各物質(zhì)與固定相上的金屬離子的絡(luò)合能力的不同巰基化合物的巰基與固定相表面的二硫鍵作用力不同巰基化合物的巰基與固定相表面的二硫鍵作用力不同各物質(zhì)在兩液相間的分配系數(shù)不同各物質(zhì)在兩液相間的分配系數(shù)不同各物質(zhì)的分子大小或形狀不同各物質(zhì)的分子大小或形狀不同利用生物大分子與各種配基的生物識別能力不同利用生物大分子與各種配基的生物識別能力不同據(jù)實驗技術(shù)據(jù)實驗技術(shù) 低壓色譜低壓色譜中壓色譜中壓色譜高壓色譜高壓色譜電泳電泳操作壓力小于操作壓力小于0.

8、5 MPa0.5 MPa操作壓力在操作壓力在0.50.55 MPa5 MPa之間之間操作壓力在操作壓力在5 540 MPa40 MPa之間之間溶質(zhì)分子在電場中的移動速度不同溶質(zhì)分子在電場中的移動速度不同據(jù)固定相的形狀不據(jù)固定相的形狀不同同柱色譜柱色譜紙色譜紙色譜薄層色譜薄層色譜固定相裝在玻璃、不銹鋼或有機(jī)玻璃柱中固定相裝在玻璃、不銹鋼或有機(jī)玻璃柱中固定相為以氫鍵與纖維素羥基結(jié)合的水固定相為以氫鍵與纖維素羥基結(jié)合的水固定相在玻璃平板上鋪成薄層固定相在玻璃平板上鋪成薄層據(jù)流動相的物態(tài)不據(jù)流動相的物態(tài)不同同 氣相色譜氣相色譜液相色譜液相色譜超臨界流體色譜超臨界流體色譜流動相為氣體流動相為氣體流動相為

9、液態(tài)流動相為液態(tài)流動相為液態(tài)流動相為液態(tài)按操作方式不同按操作方式不同 迎頭法迎頭法頂替法頂替法洗脫法洗脫法將混合物溶液連續(xù)通過固定相，只有化學(xué)親和力最弱的組分以純粹狀態(tài)最先流將混合物溶液連續(xù)通過固定相，只有化學(xué)親和力最弱的組分以純粹狀態(tài)最先流出，但其它各組分都不能達(dá)到分離。出，但其它各組分都不能達(dá)到分離。利用一種化學(xué)親和力比各被結(jié)合組分都強(qiáng)的物質(zhì)來洗脫，這種物質(zhì)稱為頂替劑。利用一種化學(xué)親和力比各被結(jié)合組分都強(qiáng)的物質(zhì)來洗脫，這種物質(zhì)稱為頂替劑。此法處理量大，且各組分分層清楚，但層與層相連，故不能將組分分離完全。此法處理量大，且各組分分層清楚，但層與層相連，故不能將組分分離完全。將混合液盡量濃縮，

10、使體積縮小，引入固定相的一端，然后用溶劑洗脫，洗脫將混合液盡量濃縮，使體積縮小，引入固定相的一端，然后用溶劑洗脫，洗脫溶劑可以是原來溶解混合物的溶劑，也可選用另外的溶劑。溶劑可以是原來溶解混合物的溶劑，也可選用另外的溶劑。吸附色譜與其它色譜法的異同點 類型類型機(jī)理機(jī)理優(yōu)點優(yōu)點缺點缺點適用范圍適用范圍吸附色譜吸附色譜化學(xué)、物理吸附化學(xué)、物理吸附操作簡便操作簡便易受離子干易受離子干擾擾各種生物大分各種生物大分子的分離、脫子的分離、脫色、和去熱源色、和去熱源凝膠過濾凝膠過濾分子篩的排阻效應(yīng)分子篩的排阻效應(yīng)分辨力高，不分辨力高，不會引起變性會引起變性各種凝膠介各種凝膠介質(zhì)昂貴，處質(zhì)昂貴，處理量有限制理

11、量有限制分子量有明顯分子量有明顯差別的可溶性差別的可溶性生物大分子生物大分子分配色譜分配色譜溶質(zhì)在固定相和流溶質(zhì)在固定相和流動相中分配系數(shù)的動相中分配系數(shù)的差異差異分辨力高，重分辨力高，重復(fù)性較好，能復(fù)性較好，能分離微量物質(zhì)分離微量物質(zhì)影響因子多，影響因子多，上樣量太小上樣量太小用于各種生物用于各種生物大分子的分析大分子的分析鑒定鑒定親和色譜親和色譜親和色譜生物大分親和色譜生物大分子與配體之間有特子與配體之間有特殊親和力殊親和力分辨力很高分辨力很高 一種配體只一種配體只能用于一種能用于一種生物大分子，生物大分子，局限性大局限性大各種生物大分各種生物大分子子聚焦色譜聚焦色譜等電點和離子交換等電點

12、和離子交換作用作用分辨力高分辨力高進(jìn)口試制昂進(jìn)口試制昂貴貴蛋白質(zhì)和酶蛋白質(zhì)和酶三、色譜的分類三、色譜的分類兩兩 相相 物物 理理 狀狀 態(tài)態(tài)作作 用用 機(jī)機(jī) 理理固定相的物理特性固定相的物理特性流動流動相相固定相固定相名名 稱稱原原 理理名名 稱稱物理特性物理特性名名 稱稱液相液相氣體氣體液相液相固相固相液體液體固體固體液相色譜液相色譜液液色譜液液色譜液固色譜液固色譜氣相色譜氣相色譜氣液色譜氣液色譜氣固色譜氣固色譜分配系數(shù)分配系數(shù)吸附能力吸附能力分子大小分子大小離子交換離子交換能力能力親和力親和力分配系數(shù)分配系數(shù)吸附能力吸附能力液液分配色譜液液分配色譜液固吸附色譜液固吸附色譜凝膠滲透色譜凝膠滲

13、透色譜離子交換色譜離子交換色譜親和力色譜親和力色譜氣液分配色譜氣液分配色譜氣體吸附色譜氣體吸附色譜 板狀板狀 紙紙 一薄層一薄層 根柱子根柱子填充緊密填充緊密空心管壁空心管壁流動相高流動相高壓壓 根柱子根柱子填充緊密填充緊密空心管壁空心管壁平板色譜平板色譜 紙色譜紙色譜薄層色譜薄層色譜柱色譜柱色譜(液相液相)填充柱色譜填充柱色譜空心柱色譜空心柱色譜高效液相色譜高效液相色譜柱色譜柱色譜(氣相氣相)填充柱色譜填充柱色譜空心柱色譜空心柱色譜1.5 層析劑種類層析劑種類氧化鋁氧化鋁硅膠硅膠活性炭活性炭瓊脂糖瓊脂糖 纖維素纖維素 現(xiàn)代色譜技術(shù)中除了分配色譜、吸附色譜外，生物現(xiàn)代色譜技術(shù)中除了分配色譜、吸

14、附色譜外，生物制藥中廣泛使用的還有離子交換色譜、凝膠色譜和親制藥中廣泛使用的還有離子交換色譜、凝膠色譜和親和色譜等。選擇的原則：和色譜等。選擇的原則：易溶于有機(jī)溶劑而難溶于水的樣品，選擇吸附色譜；易溶于有機(jī)溶劑而難溶于水的樣品，選擇吸附色譜；水溶液中可解離成離子的水溶性樣品，可選用離子交水溶液中可解離成離子的水溶性樣品，可選用離子交換色譜；換色譜；樣品既溶于水，又溶于有機(jī)溶劑，可選用分配色譜。樣品既溶于水，又溶于有機(jī)溶劑，可選用分配色譜。除了平板、紙和薄層色譜外，其余色譜都可以在柱子除了平板、紙和薄層色譜外，其余色譜都可以在柱子中進(jìn)行，因此柱色譜的應(yīng)用非常廣泛。中進(jìn)行，因此柱色譜的應(yīng)用非常廣泛

15、。 Principles of Operation for Chromatography TechniquesIonExchangeHydrophobic InteractionAffinity Reversed Phase1.色譜分離種類色譜分離種類國產(chǎn)氣相色譜儀HP高壓液相色譜儀美國氣相色譜儀4.分離設(shè)備分離設(shè)備4.分離設(shè)備分離設(shè)備4.分離設(shè)備分離設(shè)備制備色譜技術(shù)制備色譜技術(shù)生產(chǎn)規(guī)模制備生產(chǎn)規(guī)模制備色譜柱直徑色譜柱直徑100-800mm中試規(guī)模制備中試規(guī)模制備色譜柱直徑色譜柱直徑50-150mm小量制備，小量制備，色譜柱直徑色譜柱直徑10-40mm4.分離設(shè)備分離設(shè)備制備液相色譜系列半制備

16、液相色譜半制備液相色譜中試規(guī)模制備色譜中試規(guī)模制備色譜工業(yè)規(guī)模制備色譜工業(yè)規(guī)模制備色譜制備液相色譜制備液相色譜分析液相色譜分析液相色譜 不同溶質(zhì)在其遷移速度大于零，但小于流動相的線速度時，溶質(zhì)在色譜柱上的遷移對分離有貢獻(xiàn)，此時溶質(zhì)遷移所經(jīng)歷的柱長也對分離有貢獻(xiàn)；而當(dāng)不同溶質(zhì)在其遷移速度等于流動相的線速度時，溶質(zhì)遷移所經(jīng)歷的柱長對分離無貢獻(xiàn)。裝置包括：流動相供給、進(jìn)樣、色譜柱和裝置包括：流動相供給、進(jìn)樣、色譜柱和檢測器檢測器4大部分。大部分。1.柱色譜系統(tǒng)的組成柱色譜系統(tǒng)的組成 色譜介質(zhì)有各種各樣，但柱式色譜系統(tǒng)的組成基本相色譜介質(zhì)有各種各樣，但柱式色譜系統(tǒng)的組成基本相似，一般由蠕動泵、色譜柱、

17、檢測器、記錄儀以及似，一般由蠕動泵、色譜柱、檢測器、記錄儀以及部分收集器等幾個部分構(gòu)成。部分收集器等幾個部分構(gòu)成。 柱式層析系統(tǒng)的組成基本相似。由以下幾個部分構(gòu)成：柱式層析系統(tǒng)的組成基本相似。由以下幾個部分構(gòu)成： A A 蠕動泵蠕動泵 B B 層析柱層析柱 C C 裝柱裝柱 D D 加試樣加試樣 E E 洗脫洗脫 F F 檢測器檢測器 G G 部分收集器部分收集器柱層析系統(tǒng)的組成柱層析系統(tǒng)的組成柱層析裝置圖柱層析裝置圖 緩緩沖沖液液管管柱柱梯梯度度制制造造器器監(jiān)監(jiān)視視器器記錄器記錄器分分劃劃收收集集器器(1)(2)泵(3)(4)(5)adaptorreservoir膠膠體體裝裝填填膠膠體體A2

18、 2 紙層析法紙層析法2.1 2.1 基本原理基本原理2.2 2.2 操作方法操作方法2.3 2.3 操作步驟操作步驟小實驗小實驗1234這就是紙層析法。這就是紙層析法。對照上圖，可知道對照上圖，可知道1-4號的各代表什號的各代表什么氨基酸。么氨基酸。紙層析法是分離鑒定蛋白質(zhì)的氨基紙層析法是分離鑒定蛋白質(zhì)的氨基酸組成的重要工具。酸組成的重要工具。 1234甘氨酸半胱氨酸組氨酸纈氨酸紙層析小實驗動畫演示紙層析小實驗動畫演示凝膠裝置圖色譜峰和分離結(jié)果 1層析柱 層析柱通常是玻璃的?？偟恼f來，長柱分辨好。但大量物質(zhì)的處理則用粗的柱比較適宜。層析柱的基本裝置如圖。 2層析材料的準(zhǔn)備 許多材料都可在層析

19、法中使用。在裝柱前這些材料要用溶劑平衡，另外還需作一些預(yù)處理。例如，凝膠層析材料需要溶脹，吸附劑需要加熱或酸處理來活化，離子交換樹脂需要用酸堿處理來得到所需的電離形式。 在用溶劑平衡時，先使材料沉淀，用傾瀉法除去懸浮的細(xì)顆粒，否則由于細(xì)顆粒的堵塞，溶劑的流速將顯著降低。 3裝柱 層析柱的填裝是先關(guān)閉出口，用溶劑灌注至13體積，并使支持板下的“死體積不存有氣泡，再慢慢地向溶劑中加漿狀物，要小心地沿著玻棒傾注以防止氣泡存留在柱內(nèi)。讓懸浮液沉淀，并放出過多的溶劑，為了避免分層。最好一次裝完，如需分幾次填裝，則在二次填裝前應(yīng)先在已經(jīng)沉淀的表面用玻棒攪拌后再傾注，重復(fù)這個過程，直至裝到需要的高度。用溶劑

20、徹底洗滌層析柱后使液面降到比層析床表面略高一點。最后覆蓋一張圓形濾紙或尼龍布，以免加樣時擾亂床表面。 4上樣上樣 樣品濃度越高越好；上樣體積越小，分樣品濃度越高越好；上樣體積越小，分辨率越高；辨率越高； 上樣體積一般為床體積的上樣體積一般為床體積的15%； 例外：例外：G-25脫鹽脫鹽30% 親和層析親和層析為床體積的幾倍為床體積的幾倍 5洗脫 用適當(dāng)?shù)南疵撘喊迅鹘M分依次從柱上洗脫下來。3洗脫 影響分離效果的主要因素之一： 洗脫流速。 要求流速合適而恒定。 洗脫方式洗脫方式 連續(xù)洗脫連續(xù)洗脫continual elution）：同一種洗脫液洗脫）：同一種洗脫液洗脫 分步洗脫分步洗脫stepwi

21、se elution）：用兩種或兩種以上）：用兩種或兩種以上不同洗脫液分段洗脫不同洗脫液分段洗脫 梯度洗脫梯度洗脫gradient elution）：梯度改變洗脫液的）：梯度改變洗脫液的pH值、離子強(qiáng)度或極性值、離子強(qiáng)度或極性 梯度洗脫液的制備裝置：梯度混合器、梯度三通梯度洗脫液的制備裝置：梯度混合器、梯度三通閥或簡易梯度形成裝置閥或簡易梯度形成裝置 梯度形式：直線梯度、階梯式梯度、凹指數(shù)梯梯度形式：直線梯度、階梯式梯度、凹指數(shù)梯度、凸指數(shù)梯度以及復(fù)合梯度度、凸指數(shù)梯度以及復(fù)合梯度 濃度梯度制造器濃度梯度制造器 6.部分收集及分析 柱的流出液可以用人工的方法收集到一系列試管中或使用部分收集器。

22、這種裝置能使每一管按照預(yù)定的時間或滴數(shù)收集流出液，然后自動移位，下一管再繼續(xù)收集。洗脫完畢后可選用各種適宜的方法將已收集的許多部分流出液進(jìn)行定量分析，并畫出洗脫物的量對流出液體積的洗脫曲線。每一部分的蛋白質(zhì)或核酸的含量可以讓流出液通過一個流動小室測定其280 nm或260 nm的光吸收來進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測。 6 洗脫液的分部收集洗脫液的分部收集 收集的辦法：用小試管每管收集一定的體積，直到洗脫收集的辦法：用小試管每管收集一定的體積，直到洗脫完畢為止。完畢為止。 收集的體積或時間）：隨樣品的性質(zhì)、填料、柱子的收集的體積或時間）：隨樣品的性質(zhì)、填料、柱子的直徑和流動相而變化。一般每管收集的體積直徑和流動

23、相而變化。一般每管收集的體積 為為35mL實實驗室）。驗室）。 收集的總體積：離子交換層析為床體積的收集的總體積：離子交換層析為床體積的3倍；倍； 凝膠層析為凝膠層析為1個床體積個床體積 6洗脫液的檢測和合并洗脫液的檢測和合并 分部收集的試管內(nèi)的化合物需要進(jìn)行定性或分部收集的試管內(nèi)的化合物需要進(jìn)行定性或/和定量鑒定。和定量鑒定。 鑒定的方法根據(jù)目的物的性質(zhì)而確定。鑒定的方法根據(jù)目的物的性質(zhì)而確定。 小分子化合物：脂類、糖類和氨基酸小分子化合物：脂類、糖類和氨基酸薄層層析或紙層析薄層層析或紙層析顯色反應(yīng)。顯色反應(yīng)。 大分子化合物：蛋白質(zhì)和核酸大分子化合物：蛋白質(zhì)和核酸分光光度法測定光吸收值。分光

24、光度法測定光吸收值。 蛋白質(zhì)：蛋白質(zhì)：280nm；DNA和和RNA：254nm。 洗脫液可通過紫外檢測器進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測，并將結(jié)果由記錄洗脫液可通過紫外檢測器進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測，并將結(jié)果由記錄儀描繪出來；根據(jù)吸收曲線收集、合并相關(guān)試管的洗脫液，以儀描繪出來；根據(jù)吸收曲線收集、合并相關(guān)試管的洗脫液，以進(jìn)一步處理。進(jìn)一步處理。 用色譜法來解決預(yù)分用色譜法來解決預(yù)分離和復(fù)姓便成為色譜離和復(fù)姓便成為色譜工作者當(dāng)今快速分離工作者當(dāng)今快速分離和純化及降低治療蛋和純化及降低治療蛋白或診斷蛋白的一個白或診斷蛋白的一個熱門研究課題。熱門研究課題。 首先選擇色譜柱類型首先選擇色譜柱類型 然后選擇色譜柱的填料顆粒和尺寸）然后

25、選擇色譜柱的填料顆粒和尺寸） 接著確定柱尺寸的大小接著確定柱尺寸的大小 接著選擇流動相組成、流速和洗脫方式）接著選擇流動相組成、流速和洗脫方式） 最后一旦選定了幾種不同色譜的最優(yōu)化條最后一旦選定了幾種不同色譜的最優(yōu)化條件，接著便是如何將這些單元進(jìn)行組合以件，接著便是如何將這些單元進(jìn)行組合以得到最佳分離和純化工藝了。得到最佳分離和純化工藝了。 最優(yōu)化要以產(chǎn)品質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)效益為目的。最優(yōu)化要以產(chǎn)品質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)效益為目的。線性放大線性放大固定以下條件1. 相同線行流速2. 相同緩沖液3. 相同填料4. 相同柱高5. 相同樣品濃度和pH6. 相同樣品體積和柱床體積比例7. 相同梯度體積和柱床體積比例放大1

26、. 柱直徑2. 體積流速3. 上樣體積 原理：在高離子強(qiáng)度的鹽水溶液淋洗條件下，蛋白質(zhì)的疏水部分與填料表面的疏水基團(tuán)相互作用而被吸附。淋洗液的離子強(qiáng)度降低，蛋白質(zhì)依疏水性特征依次被洗脫。即高鹽濃度吸附，低鹽濃度洗脫。 對基質(zhì)沒有特殊要求，基質(zhì)表面具有較弱的疏水基團(tuán)，孔徑在25100um 避免使用了大量有機(jī)溶劑的淋洗，有效保護(hù)了被分離物質(zhì)的生物活性。 具有“一石四鳥的作用，尤其是純化大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物時具有除去變性劑鹽酸胍）、使蛋白質(zhì)折疊復(fù)性）、去除雜蛋白、便于變性劑回收。二、各種復(fù)性方法的比較二、各種復(fù)性方法的比較SECIECAFC中壓中壓或?；虺荷珘荷V譜HIC高壓高壓色譜色譜慢慢 快快負(fù)荷

27、受限、分離效果差；負(fù)荷受限、分離效果差；負(fù)荷高，分離效果好，鹽負(fù)荷高，分離效果好，鹽酸胍使用受限；酸胍使用受限；使用范圍窄，成本高，手使用范圍窄，成本高，手續(xù)繁雜，時間長續(xù)繁雜，時間長質(zhì)量和活性回收率大于質(zhì)量和活性回收率大于90%，較理想的復(fù)性純化，較理想的復(fù)性純化手段。手段。RPLC是利用溶質(zhì)分子中非極性是利用溶質(zhì)分子中非極性集團(tuán)與非極性固定相間相互作用集團(tuán)與非極性固定相間相互作用力大小與溶質(zhì)分子極性集團(tuán)與流力大小與溶質(zhì)分子極性集團(tuán)與流動相中極性分子在相反方向上相動相中極性分子在相反方向上相互作用力大小的差異進(jìn)行分離的?；プ饔昧Υ笮〉牟町愡M(jìn)行分離的。非線性色譜的相關(guān)知識非線性色譜的相關(guān)知識色

28、譜法的基本特點：色譜法的基本特點：1.分離效率高分離效率高2.應(yīng)用范圍廣應(yīng)用范圍廣3.操作參數(shù)多操作參數(shù)多4.高靈敏度在線檢測高靈敏度在線檢測5.快速分離快速分離6.連續(xù)自動化操作連續(xù)自動化操作非線性色譜的相關(guān)知識非線性色譜的相關(guān)知識色譜的發(fā)展從分析規(guī)模轉(zhuǎn)向了制備規(guī)模，色譜的發(fā)展從分析規(guī)模轉(zhuǎn)向了制備規(guī)模，致使色譜學(xué)在理論上從線性色譜發(fā)展到非致使色譜學(xué)在理論上從線性色譜發(fā)展到非線性色譜。線性色譜。非線性色譜的相關(guān)知識非線性色譜的相關(guān)知識線性色譜：流動相中樣品的濃度線性色譜：流動相中樣品的濃度Cm與固定與固定相中樣品的濃度相中樣品的濃度Cs之間呈線性關(guān)系。之間呈線性關(guān)系。非線性色譜：流動相中樣品的濃度非線性色譜：流動相中樣品的濃度Cm與固與固定相中樣品的濃度定相中樣品的濃度Cs之間不呈線性關(guān)系。之間不呈線性關(guān)系。非線性色譜的相關(guān)知識非線性色譜的相關(guān)知識一：線性色譜與非線性色譜根本區(qū)別一：線性色譜與非線性色譜根本區(qū)別1.樣品的保留值可變樣品的保留值可變保留時間保留時間5.230）：尿苷）：尿苷保留時間保留時間6.962）：鳥苷）：鳥苷保留時間保留時間8.443）：腺苷）：腺苷保留時間保留時間11.132）：肌苷）：肌苷保留時間保留時間12.848）：蟲草素）：蟲草素 蛹蟲草子實體中蟲草素、腺苷、鳥苷、尿苷、肌苷的HPLC圖譜 非線性色譜的相關(guān)知識非線性色譜的相關(guān)知識一：線性色