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1、1804藥物分析雜志ChinJPharmAnal2009,29(11)3HPLC-UV-ELSD法同時(shí)測(cè)定痰熱清注射液中主成分含量王玨,瞿海斌,邵青33(浙江大學(xué)藥物信息學(xué)研究所,杭州310058)摘要目的:建立同時(shí)測(cè)定痰熱清注射液中綠原酸、黃芩苷、熊去氧膽酸含量和鵝去氧膽酸限量的高效液相色譜法。方法:色譜條件:AgilentZorbaxSB-C18柱;流動(dòng)相為0115%醋酸溶液-0115%醋酸乙腈,線性梯度洗脫,流速為018mLmin-1;柱溫為30;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):綠原酸326nm,黃芩苷276nm;蒸發(fā)光散射檢測(cè)器漂移管溫度為100,霧化氣流速為115Lmin。結(jié)果:綠原酸、黃芩苷、熊去氧
2、膽酸和鵝去氧膽酸分別在012214142,2013406,1918396,1719179mgL質(zhì)量-1-1濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,r均大于019995;平均加樣回收率分別為101%,9814%,9914%,102%;4種化合物含量重復(fù)性試驗(yàn)RSD小于118%。結(jié)論:該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確,重復(fù)性好,在對(duì)痰熱清注射液中主要有效成分綠原酸、黃芩苷、熊去氧膽酸進(jìn)行定量的同時(shí),實(shí)現(xiàn)對(duì)鵝去氧膽酸限量的測(cè)定。關(guān)鍵詞:痰熱清注射液;HPLC-UV-ELSD;綠原酸;黃芩苷;熊去氧膽酸;鵝去氧膽酸中圖分類號(hào):R917文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):0254-1793(2009)11-1804-04HPLC-UV-ELS
3、Dsimultcomponent3injectionQUHai-bin,SHAOQing33(PharmaceuticalInformaticsInstitute,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China)AbstractObjective:ToestablishanHPLC-UV-ELSDmethodforthesimultaneousdeterminationofchlorogen2icacid,baicalin,ursodeoxycholicacidandchenodeoxycholicacidinTanreqinginjection.Methods
4、:Thechromato2graphicseparationwasperformedonanAgilentZorbaxSB-C18column.Themobilephasewasmixturesof0115%aceticacid-waterand0115%aceticacid-acetonitrilewithlineargradientelutionattheflowrateof018mLmin.Thecolumntemperaturewasmaintainedat30.TheUVdetectionwavelengthofchlorogenicacidandba2icalinwere326nm
5、and276nm,respectively.ThedrifttubetemperatureofELSDwassetat100andthenitrogenflowrateat115Lmin.Results:Thecalibrationcurvesintherangeof01221-4142mgLacid,2013-406mgL-1-1-1-1forchlorogenic-1forbaicalin,1918-396mgL-1forursodeoxycholicacidand1719-179mgLforchenodeoxycholicacidweregoodlinear,respectively.T
6、hevaluesofcorrelationcoefficientwerehigherthan019995forallanalytes.Theaveragerecoveriesofchlorogenicacid,baicalin,ursodeoxycholicacidandchenodeoxycholicacidwere101%,9814%,9914%,102%,respectively.Repeatabilityexperimentsshowedthatrelativestandarddeviation(RSD)valuesoftheircontentswerelessthan118%.Con
7、clusion:Themethodissimple,accurateandrepeatable.Itcanbeusedtodeterminatethecontentofchlorogenicacid,baicalinandursodeoxycholicacidwhicharethemajoreffectivecomponentsinTanreqinginjection,andmonitorthelimitcontentofchenodeoxycholicacidatthesametime.Keywords:Tanreqinginjection;HPLC-UV-ELSD;chlorogenica
8、cid;baicalin;ursodeoxycholicacid;chenode2oxycholicacid痰熱清注射液屬國(guó)家新藥中藥二類,方中以黃芩為君藥,熊膽粉、山羊角為臣藥,金銀花為佐藥,連翹為使藥,具有清熱、解毒、化痰等功效。黃芩2苷、熊去氧膽酸、綠原酸是其主要成分,鵝去氧膽13國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)項(xiàng)目(2005CB523402);新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃資助(NCET-06-0515)33通訊作者Tel:(0571)88208426;E-mail:shaoqzju1edu1cn藥物分析雜志ChinJPharmAnal2009,29(11)1805差向異構(gòu)體,具有溶解膽
9、固醇型酸是熊去氧膽酸73膽結(jié)石的藥理作用,但同時(shí)具有一定的毒性,必須對(duì)其進(jìn)行限量控制。痰熱清注射液中綠原酸、黃芩苷的含量測(cè)定方法已有文獻(xiàn)報(bào)道,但對(duì)痰熱清注射液中主要成分綠原酸、黃芩苷、熊去氧膽酸含量進(jìn)行測(cè)定并同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)限量成分鵝去氧膽酸進(jìn)行定量分析的方法尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用紫外/蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(UV/ELSD)聯(lián)用方法建立了1次色譜條件聯(lián)合測(cè)定痰熱清注射液中3種主要成分含量和鵝去氧膽酸限量的高效液相色譜法,為該制劑的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。1儀器和試藥Agilent1100型高效液相色譜儀(德國(guó)Agilent公司);Alltech2000型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(美國(guó)奧泰公司);KQ-250B型超聲
10、波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司);METTLERAE240電子天平(勒-托利多上海有限公司);Milli-(美國(guó)Millipore公司);Mp公司)。對(duì)照品:-200413);黃芩苷(批號(hào):110715-200815);熊去氧膽酸(批號(hào):110755-9003);鵝去氧膽酸(批號(hào):110806-200303)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。乙腈為色譜純,購(gòu)自Merck公司;冰醋酸為色譜純,購(gòu)自Tedia公司;水為Milli-Q超純水。痰熱清注射液:某藥業(yè)有限公司(批號(hào):070525,070718,070706,070708,規(guī)格10mL每支)。2色譜條件色譜柱:AgilentZorbaxSB-C
11、18(250mm×416mm,5m),漢邦C18預(yù)柱;流動(dòng)相:0115%醋酸溶液(A)-0115%醋酸乙腈(B),線性梯度洗脫010min,B相10%15%;1020min,B相15%25%;2030min,B相25%35%;3035min,B4,5混合對(duì)照品溶液。312供試品溶液精密量取痰熱清注射液012mL于5mL量瓶中,加50%甲醇稀釋至刻度,搖勻,10000rmin離心10min,取上清液作為供試品-1溶液。313陰性樣品溶液取按痰熱清注射液工藝方法制備的缺金銀花、缺黃芩和缺熊膽粉痰熱清注射液適量,分別照“312”項(xiàng)下方法操作,即得。4線性關(guān)系考察分別精密吸取混合對(duì)照品溶液0
12、105,011,012,014,016,018,110mL,置1mL量瓶中,用50%甲醇稀釋至刻度,按“2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。綠原-1酸和黃芩苷以對(duì)照品質(zhì)量濃度mgL)對(duì)峰面積Y-1)對(duì)峰面積的Y,得綠原酸、黃芩苷、熊去、:Y=3017X-1110r=019999Y=4019X+1912r=11000lgY=1156lgX+010197r=019996lgY=1166lgX+010250r=019997線性范圍分別為012214142,2013406,1918-1396,1719179mgL。5專屬性試驗(yàn)精密吸取“3”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10L,按“2”項(xiàng)下色譜
13、條件進(jìn)樣分析,結(jié)果見(jiàn)圖1。陰性樣品溶液在綠原酸、黃芩苷、熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸相對(duì)應(yīng)的位置上未見(jiàn)色譜峰,表明痰熱清注射液中其他成分對(duì)綠原酸、黃芩苷、熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸的測(cè)定無(wú)干擾。6精密度試驗(yàn)611儀器精密度取混合對(duì)照品溶液,在“2”項(xiàng)色譜條件下,連續(xù)進(jìn)樣6次,分別測(cè)定綠原酸、黃芩苷、熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸的峰面積,其RSD分別為0186%,0106%,111%,117%,表明儀器精密度良好。612日間精密度取批號(hào)為070718的痰熱清注射液,按“312”項(xiàng)下方法連續(xù)3d制備供試品溶液,按“2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析并計(jì)算4種成分含量,計(jì)算日間精密度(n=3)。綠原酸、黃芩苷、熊去氧膽酸和鵝
14、去氧膽酸平均含量分別為3011,5270,-15940,740mgL;RSD分別為112%,110%,0177%,113%。相35%90%;3545min,B相90%,流速:018-1mLmin;柱溫:30;進(jìn)樣量:10L;檢測(cè)波長(zhǎng):0min,326,18min,276nm,ELSD漂移管溫度:100;霧化氣流速:115Lmin。3溶液制備311混合對(duì)照品溶液分別精密稱取綠原酸、黃芩苷、熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸對(duì)照品適量于量瓶中,用甲醇溶解并定容,制成對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量于量瓶中,用50%甲醇稀釋至刻度,制成綠原酸、黃芩苷、熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸-1的質(zhì)量濃度分別為4142,
15、406,396,179mgL的-11806藥物分析雜志ChinJPharmAnal2009,29(11)113%,212%,表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。9加樣回收率試驗(yàn)精密吸取已知含量的痰熱清注射液(070718)9份,每份011mL,分別加入相當(dāng)于原含量80%,100%,120%量的綠原酸、黃芩苷、熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸對(duì)照品溶液,按“312”項(xiàng)下方法制備所需溶液。按“2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,測(cè)定含量,計(jì)算4種成分的加樣回收率。結(jié)果綠原酸、黃芩苷、熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸的平均加樣回收率分別為101%,9814%,9914%,102%;RSD分別為214%,116%,219%,213%。1
16、0定量限和檢測(cè)限按信噪比為101,、黃芩苷、熊去氧1111,1131,198,1,116%,213%,631測(cè)得上述組分的檢01332,01522,9819,6215ng。11樣品含量測(cè)定取各批次痰熱清注射液,按“312”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,按外標(biāo)法計(jì)算痰熱清注射液中綠原酸、黃芩苷、熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸的含量,結(jié)果見(jiàn)表1。表1痰熱清注射液中4種成分含量測(cè)定(mgL-1,n=3)Tab1ResultsoffourcomponentsdeterminationinTanreqinginjection圖1HPLC-UV-ELSD色譜圖Fig1HPLC-UV-ELS
17、DchromatogramsA1,A2.對(duì)照品(chemicalreferencesubstances)B1,B2.痰熱清注射C2.缺熊膽粉陰性樣品C3.缺黃芩陰性樣品3.熊去氧膽酸070525070718070706綠原酸(chlorogenicacid)黃芩苷(baicalin)熊去氧膽酸acid)鵝去氧膽酸acid)(ursodeoxycholic(chenodeoxycholic批號(hào)(LotNo.)液樣品(Tanreqinginjectionsamples)C1.缺金銀花陰性樣品(nega2含量(content)/mgL-12413301036112313RSD/%含量(content
18、)/mgL-1RSD/%含量(content)/mgL-1RSD/%含量(content)/mgL-1RSD/%tivesamplewithoutFlosLoniceraeJaponicae)(negativesamplewithoutbearbilepowder)(negativesamplewithoutRadixScutellariae)1.綠原酸(chlorogenicacid)2.黃芩苷(baicalin)(ursodeoxycholicacid)11205142×10301875176×10321308185×10211501695119×1
19、0301495180×1031197127×102019201265107×10301885170×10301878149×102019601705111×10301515179×10301728194×10201694.鵝去氧膽酸(chenodeoxycholicacid)7重復(fù)性試驗(yàn)070708按“312”項(xiàng)下供試品溶液制備方法,平行制備6份同一批號(hào)(070718)樣品的供試品溶液,按“2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,按外標(biāo)法計(jì)算4種成分含量。結(jié)果綠原酸、黃芩苷、熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸平均-1含量分別為3011,52
20、20,5740,717mgL;RSD分別為0177%,0178%,118%,117%。8溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液(070718),分別在0,2,4,8,12,24h進(jìn)樣分析,綠原酸、黃芩苷、熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸峰面積的RSD分別為111%,213%,12討論供試品溶液制備方法選擇已有文獻(xiàn)報(bào)5道痰熱清注射液中綠原酸、黃芩苷含量測(cè)定時(shí),供試品溶液制備選擇50%甲醇溶液為稀釋用溶劑,考慮到熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸在純甲醇中具良好溶解性能,首先選擇甲醇為供試品溶液制備用溶劑。但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)以甲醇為溶劑時(shí),由于溶劑效應(yīng),綠原酸色譜峰出現(xiàn)前沿峰現(xiàn)象,當(dāng)按文獻(xiàn)報(bào)道選擇50%甲醇為稀釋用溶劑時(shí),綠原酸色譜
21、峰峰形對(duì)稱,且黃1211藥物分析雜志ChinJPharmAnal2009,29(11)1807芩苷、熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸均溶于該稀釋溶劑,最終選擇50%甲醇為供試品溶液制備用溶劑。1212檢測(cè)波長(zhǎng)選擇將綠原酸、黃芩苷的對(duì)照品溶液于200400nm波長(zhǎng)處進(jìn)行掃描,結(jié)果顯示,綠原酸在326nm波長(zhǎng)處有最大吸收,黃芩苷在276nm波長(zhǎng)處有最大吸收,而熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸3文獻(xiàn)報(bào)道僅在紫外末端有微弱吸收,為了保證各成分都有最佳的檢測(cè)靈敏度,綠原酸、黃芩苷檢測(cè)采用紫外變波長(zhǎng)方式,選擇其最大吸收波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng),而熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸選擇串聯(lián)蒸發(fā)光散射檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。1213色譜條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)考察了甲醇
22、-水溶液、乙腈-水溶液、乙腈-醋酸水溶液3種流動(dòng)相系統(tǒng)梯度洗脫的分離效果,結(jié)果表明以乙腈-醋酸水溶液為流動(dòng)相,進(jìn)行梯度洗脫,可得到峰形對(duì)稱、分離度好、分析時(shí)間適宜的各組分色譜圖??疾炝?0,40柱溫對(duì)分離的影響,30時(shí)1214ELSD95,100,105漂-1移管溫度及1,115,2Lmin霧化氣流速,漂移管-1溫度為100,霧化氣流速為115Lmin時(shí),ELSD響應(yīng)較好,且基線噪音相對(duì)較小,信噪比最高。所以選擇漂移管溫度為100,霧化氣流速為-1115Lmin。參考文獻(xiàn)1GAOYi-min(高益民),WANGZhong-shan(王忠山).Thepre2liminaryevaluationofTanreqinginjectioninclinicalpharmacy(對(duì)痰熱清注射液臨床藥學(xué)初步評(píng)價(jià)).CapMed(首都醫(yī)藥),2004,12:442WANGChun-quan(王春全).TheprescriptionandeffectivenessofTanreqinginjection(痰熱清注射液的方解及功效).ModMedHealth(現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生),2006,2
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