HPLC法分析阿奇霉素及各類注射劑中有關(guān)物質(zhì)的含量

1、HPLC法分析阿奇霉素及各類注射劑中有關(guān)物質(zhì)的含量作者：王明娟 許明哲 胡昌勤* 王立新 王晨【摘要】目的 建立一種能用于阿奇霉素原料及制劑中有關(guān)物質(zhì)控制的HPLC方法。方法 采用XBridge Shield RP18柱(250mm4.6mm，5m)，柱溫30，流動(dòng)相為乙腈pH8.2磷酸鹽緩沖液(0.05mol/L磷酸氫二鉀溶液，用20%磷酸調(diào)節(jié)pH至8.2)(5545)，流速1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)210nm；樣品溶液的進(jìn)樣量為200g。結(jié)果 阿奇霉素與其雜質(zhì)(氮雜紅霉素A，紅霉素A肟，N去甲基阿奇霉素，阿奇霉素德糖胺以及阿奇霉素N氧化物)能達(dá)到基線分離；鹽酸、硫酸、乳糖酸、檸檬酸、馬來(lái)

2、酸等阿奇霉素注射劑中常用酸根對(duì)阿奇霉素有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定無(wú)影響；方法的線性、準(zhǔn)確性、靈敏度以及粗放性均能滿足要求。結(jié)論 本文所建方法能較好地反映國(guó)產(chǎn)各種阿奇霉素原料及制劑中的有關(guān)物質(zhì)的情況，為國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上不同阿奇霉素注射劑的評(píng)價(jià)、阿奇霉素及其口服制劑的質(zhì)量控制提供了較好的分析手段。 【關(guān)鍵詞】阿奇霉素； 有關(guān)物質(zhì)； 原料； 制劑ABSTRACT Objective To develop an HPLC method for determination the related substances of azithromycin in parenteral products. Method The s

3、eparation was performed on a column of XBridge Shield RP18 (250mm4.6mm, 5m), with acetonitrilepH8.2 phosphate buffer (0.05mol/L K2HPO4 solution, adjust pH to 8.2 with 20% phosphate acid) (5545) as the mobile phase at flow rate of 1.0ml/min. The detection wavelength was 210 nm. The injection amounts

4、of sample solutions were 200g. Result Azithromycin and its related substances, including azaerythromycin A, erythromycin A oxime, Ndemethylazithromycin, desosaminylazithromycin and azithromycin Noxide, can be well separated from each other on the developed system. The coexistence acids in azithromyc

5、in for injection e.g. HCl, H2SO4, lactobionic acid, maleic acid, citric acid, etc, did not interfere with the determination of the related substances. Linearity, accuracy, sensitivity and robustness of the method could meet the specific analytical requirements. Conclusion Thedeveloped method can be

6、successfully applied to the quality control of azithromycin drug substances and products.KEY WORDS Azithromycin; Related substances; Drug substances; Drug products 阿奇霉素為半合成堿性大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，由紅霉素A生成9肟衍生物后發(fā)生Bechman重排，再經(jīng)還原及N甲基化而成。阿奇霉素在水中幾乎不溶，在稀酸溶液中易溶；對(duì)酸較敏感，在酸溶液中可使阿奇霉素完全降解1。 中國(guó) 藥典2005年版中收載有阿奇霉素及其口服制劑，國(guó)內(nèi)新藥試行標(biāo)準(zhǔn)涵

7、蓋了各類注射用阿奇霉素原料(鹽酸阿奇霉素、硫酸阿奇霉素、乳糖酸阿奇霉素、馬來(lái)酸阿奇霉素、門冬氨酸阿奇霉素、阿奇霉素磷酸二氫鈉、阿奇霉素檸檬酸二氫鈉)及相應(yīng)的注射劑(粉針，小針劑及大輸液)。對(duì)上述原料及制劑的 科學(xué) 性評(píng)價(jià)已勢(shì)在必行。有關(guān)物質(zhì)檢查是目前藥品安全性評(píng)價(jià)的一個(gè)重要指標(biāo)。雖然利用TLC可以有效地控制阿奇霉素原料中的有關(guān)物質(zhì)1，但HPLC法是最常用的有關(guān)物質(zhì)檢查方法之一。采用HPLC法分析阿奇霉素有關(guān)物質(zhì)存在以下難點(diǎn)：與其它大環(huán)內(nèi)酯類抗生素一樣，阿奇霉素在紫外區(qū)僅具有末端吸收，限制了其檢測(cè)靈敏度；阿奇霉素屬堿性物質(zhì)，容易和色譜柱的硅醇基相互作用，導(dǎo)致色譜峰拖尾嚴(yán)重。中國(guó)藥典2005年版以

8、及國(guó)家食品藥品管理局標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)阿奇霉素原料及其制劑中“有關(guān)物質(zhì)”的檢查均采用薄層色譜法；國(guó)外藥典則采用LC末端檢測(cè)或電化學(xué)檢測(cè)法檢查阿奇霉素有關(guān)物質(zhì)(表1)；另有 文獻(xiàn) 報(bào)道2，即使采用偏堿性流動(dòng)相，阿奇霉素及其雜質(zhì)在普通C18柱或鋁基質(zhì)色譜柱(USP中的L29色譜柱)中仍拖尾嚴(yán)重。新型的雜化顆粒色譜柱XTerra RP18能將阿奇霉素與其雜質(zhì)較好的分離，該方法已被EP5.0版收載。本文 參考 國(guó)外藥典35和文獻(xiàn)2的色譜條件，以阿奇霉素及其主要雜質(zhì)氮雜紅霉素A(azaerythromycin A，EP中雜質(zhì)A)、紅霉素A肟(erythromycin A oxime)、N去甲基阿奇霉素(Ndeme

9、thylazithromycin)、阿奇霉素德糖胺(desosaminylazithromycin)、阿奇霉素N氧化物(azithromycin Noxide)，結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖1的分離情況為指標(biāo)，建立了一種易在國(guó)內(nèi)普及、專屬性較好的HPLC末端檢測(cè)法。該法不僅能滿足對(duì)阿奇霉素原料中有關(guān)物質(zhì)的控制，且能較好的排除各種注射用阿奇霉素中各種酸根及其它輔料的干擾，并能滿足對(duì)各類阿奇霉素輸液相關(guān)物質(zhì)檢測(cè)的靈敏度。采用本方法分析阿奇霉素及各類注射劑中的有關(guān)物質(zhì)含量，為阿奇霉素注射劑的評(píng)價(jià)提供了科學(xué)的 表1 國(guó)外藥典中常用阿奇霉素有關(guān)物質(zhì)檢查方法的比較 數(shù)據(jù)。1 材料與方法 1.1 儀器、試劑與樣品島津液相

10、色譜系統(tǒng)：包括LC20AT型雙泵，SIL20AC型自動(dòng)進(jìn)樣器，SPDM 20A型PDA檢測(cè)器；Waters液相色譜系統(tǒng)：包括1525型雙泵，717plus型自動(dòng)進(jìn)樣器以及2487型雙通道紫外檢測(cè)器。磷酸氫二鉀、磷酸均為分析純級(jí)(北京化學(xué)試劑廠)，乙腈為色譜純級(jí)(Fisher公司)。阿奇霉素對(duì)照品(批號(hào)060090QCS)以及氮雜紅霉素A、紅霉素A肟、N去甲基阿奇霉素、阿奇霉素德糖胺、阿奇霉素N氧化物等雜質(zhì)對(duì)照品均由Pfizer公司提供；阿奇霉素原料(包括鹽酸阿奇霉素、硫酸阿奇霉素、乳糖酸阿奇霉素、馬來(lái)酸阿奇霉素、門冬氨酸阿奇霉素、阿奇霉素磷酸二氫鈉、阿奇霉素檸檬酸二氫鈉)及相應(yīng)的注射劑(粉針，

11、小針劑及大輸液)均為從流通市場(chǎng)上抽驗(yàn)到的國(guó)內(nèi)藥廠產(chǎn)品。1.2 溶液的制備(1)對(duì)照品溶液 取阿奇霉素及其雜質(zhì)對(duì)照品，分別精密稱定，用乙腈水(6040)溶解并分別配制成約0.1mg/ml的溶液，用于有關(guān)物質(zhì)峰定位以及方法學(xué)考察。分別精密量取1ml，混勻，作為混合對(duì)照品溶液。(2)樣品溶液原料 精密稱取適量，用乙腈水(6040)溶解(必要時(shí)先用乙腈助溶)并稀釋成約10mg/ml(以阿奇霉素計(jì))的溶液；粉針劑 采用整瓶稀釋法，按標(biāo)示量用乙腈水(6040)溶解并稀釋成約10mg/ml的溶液；水針劑 取5支樣品，混勻后，精密量取適量，用乙腈水(6040)稀釋成約10mg/ml的溶液；大輸液 直接進(jìn)樣測(cè)定

12、。1.3 色譜條件色譜柱：XBridge Shield RP18柱(Waters公司)，250mm4.6mm，5m；CAPCELL PAK C18UG120(資生堂)，150mm4.6mm，5m；Apollo C18(Grace公司)，250mm4.6mm，5m和XTerra MS C18，50mm4.6mm，2.5m；柱溫30；乙腈pH8.2磷酸鹽緩沖液(0.05mol/L磷酸氫二鉀溶液，用20%磷酸調(diào)節(jié)pH至8.2)(5545)；流速1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)210nm；進(jìn)樣量為20l(大輸液中由于阿奇霉素濃度很低，最高為2mg/ml，故通過(guò)加大進(jìn)樣體積使總的進(jìn)樣量為200g)。2 結(jié)果

13、 2.1 HPLC方法的確定以阿奇霉素和5種阿奇霉素雜質(zhì)的分離情況為指標(biāo)，調(diào)整流動(dòng)相使得阿奇霉素與諸雜質(zhì)能達(dá)到較好的分離，且保持較好的峰形(圖2)。本色譜系統(tǒng)對(duì)色譜柱有一定的選擇性。阿奇霉素及其雜質(zhì)在雜化顆粒的C18柱(XBridgeTM Shield RP18和XTerra MS C18)和聚合物包被的C18柱(CAPCELL PAK C18 UG120)中峰形較好， 但在普通耐堿色譜柱阿奇霉素及其雜質(zhì)混合圖譜(Apollo C18)中峰形不理想，且內(nèi)嵌極性基團(tuán)的XBridge Shield RP18柱的選擇性與其它C18柱不同，內(nèi)嵌極性基團(tuán)的存在有利于難分離物質(zhì)對(duì)N去甲基阿奇霉素與阿奇霉素

14、德糖胺的分離，建議采用硅膠表面經(jīng)雜化處理的十八烷基鍵合硅膠色譜柱，如XBridge Shield RP18(250mm4.6mm，5m)或與之相當(dāng)?shù)纳V柱，系統(tǒng)適用性指標(biāo)采用：調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例，使阿奇霉素峰的保留時(shí)間約為11min，此時(shí)阿奇霉素N氧化物、N去甲基阿奇霉素、阿奇霉素德糖胺、氮雜紅霉素A和紅霉素A肟相對(duì)于阿奇霉素的保留時(shí)間分別為0.35、0.48、0.52、0.58和0.62，上述雜質(zhì)相對(duì)于阿奇霉素的校正因子分別為0.62、0.70、1.66、0.77和2.94；阿奇霉素峰的拖尾因子不得大于2.5；阿奇霉素對(duì)照品溶液在100加熱30min后，阿奇霉素與其相鄰降解雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合規(guī)

15、定(圖3B)。2.2 方法學(xué)考察按 中國(guó) 藥典2005版附錄XIXA6的相關(guān)規(guī)定，對(duì)所建方法的線性、定量限、檢出限、精密性、粗放性和溶液的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。上述方法檢測(cè)阿奇霉素及其雜質(zhì)的最低檢出限、最低定量限、加樣回收率及線性范圍見(jiàn)表2。取混合對(duì)照品溶液200l，連續(xù)進(jìn)樣5針，各物質(zhì)峰面積的RSD均小于0.4%；取不同時(shí)間配制的阿奇霉素對(duì)照品溶液進(jìn)樣，其響應(yīng)值的RSD小于0.5%(n=3)；說(shuō)明方法的精密性良好。采用島津或者Waters液相色譜系統(tǒng)分析阿奇霉素原料及其制劑中的有關(guān)物質(zhì)，方法的靈敏度、專屬性均能滿足要求。 *：采用有關(guān)物質(zhì)已知的注射用阿奇霉素，利用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加入法(各雜質(zhì)濃度分別約為

16、0.08、0.10和0.12mg/ml，n=3)，考察方法的回收率；*：以進(jìn)樣量200g 計(jì)算 。冬氨酸、磷酸二氫鈉、檸檬酸二氫鈉等酸根對(duì)阿奇霉素有關(guān)物質(zhì)分析的影響，結(jié)果表明上述酸根均在接近死體積的位置(RRT約為0.27)出峰，均不干擾有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定。阿奇霉素溶液對(duì)酸和熱不穩(wěn)定，在0.1mol/L鹽酸中放置24h后主峰完全消失(圖3A)，所形成的雜質(zhì)經(jīng)雜質(zhì)對(duì)照品比對(duì)及LCMS確認(rèn)(流動(dòng)相同本法，但將乙腈磷酸鹽緩沖液改為乙酸鹽緩沖液)為其酸降解產(chǎn)物阿奇霉素德糖胺(EP中雜質(zhì)J)；在100加熱30min，雜質(zhì)也有明顯增加(圖3B)，但降解雜質(zhì)均不干擾對(duì)相關(guān)物質(zhì)的測(cè)定。2.3 對(duì)阿奇霉素原料及制劑

17、中有關(guān)物質(zhì)的分析在對(duì)國(guó)產(chǎn)阿奇霉素原料及諸制劑中的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)阿奇霉素葡萄糖或氯化鈉輸液中的雜質(zhì)含量最高；在所檢測(cè)的90批樣品中約96%的阿奇霉素輸液中的雜質(zhì)總量已超過(guò)5.0%，個(gè)別樣品雜質(zhì)總量高達(dá)46%；約30%的阿奇霉素葡萄糖輸液和10%的阿奇霉素氯化鈉輸液的含量低于其標(biāo)示量的90%；圖4為阿奇霉素葡萄糖輸液的典型圖譜，該制劑中的最大雜質(zhì)為阿奇霉素的酸性降解產(chǎn)物阿奇霉素德糖胺。各類注射用阿奇霉素原料(鹽酸阿奇霉素、硫酸阿奇霉素、乳糖酸阿奇霉素、馬來(lái)酸阿奇霉素、阿奇霉素磷酸二氫鈉、阿奇霉素檸檬酸二氫鈉)及其注射劑(包括粉針劑、水針劑)中，雜質(zhì)總量一般在0.9%4.0%，但是僅注射用阿

18、奇霉素/阿奇霉素注射液(助溶劑為檸檬酸鈉)和注射用乳糖酸阿奇霉素的部分樣品中的雜質(zhì)總量能滿足USP30版(2007年增補(bǔ)版)的要求(2.0%)。上述樣品中有關(guān)物質(zhì)的含量與其成鹽或作為助溶劑的酸的性質(zhì)密切相關(guān)：鹽酸阿奇霉素、硫酸阿奇霉素及用磷酸為助溶劑的阿奇霉素注射劑中的總雜質(zhì)含量均超過(guò)3.0%，部分樣品甚至高達(dá)10%20%；采用檸檬酸等弱酸作為助溶劑的注射用阿奇霉素的雜質(zhì)總量一般小于2.0%。通過(guò)比較阿奇霉素在不同酸中的穩(wěn)定性：放置24h后，阿奇霉素在0.05mol/L硫酸中主峰消失，在0.1mol/L馬來(lái)酸中主峰殘留約20%，但在0.1mol/L檸檬酸或0.1mol/L乳糖酸中僅約20%的阿

19、奇霉素發(fā)生了降解，提示阿奇霉素注射劑中的雜質(zhì)主要來(lái)源于成鹽/助溶階段。國(guó)產(chǎn)阿奇霉素原料中常見(jiàn)的最大雜質(zhì)為氮雜紅霉素A、N去甲基阿奇霉素或EP中的雜質(zhì)B(RRT為1.261.29)(圖5)；在所考察的14批原料中僅有14%的樣品雜質(zhì)總量未超過(guò)2.0%，提示國(guó)產(chǎn)阿奇霉素原料的質(zhì)量有待進(jìn)一步提高。3 討論 本文建立的易在國(guó)內(nèi)普及、專屬性較好的阿奇霉素有關(guān)物質(zhì)HPLC分析方法，較好地解決了阿奇霉素有關(guān)物質(zhì)分析的難題，為阿奇霉素及其口服制劑的質(zhì)量控制，為 科學(xué) 評(píng)價(jià)不同酸成鹽/作為助溶劑的各類阿奇霉素注射劑的產(chǎn)品質(zhì)量均提供了良好的分析手段。對(duì)各種阿奇霉素注射劑的分析表明，阿奇霉素葡萄糖/氯化鈉輸液中的雜

20、質(zhì)含量最高，這與阿奇霉素對(duì)酸敏感、對(duì)熱不穩(wěn)定的特性有關(guān)，因此，阿奇霉素輸液劑型本身是否合理值得思考。注射用阿奇霉素及其水針劑的質(zhì)量整體好于阿奇霉素輸液，其雜質(zhì)總量一般在0.9%4.0%，但其雜質(zhì)的含量與其成鹽或作為助溶劑的酸的性質(zhì)密切相關(guān)，鹽酸阿奇霉素、硫酸阿奇霉素以及采用磷酸為助溶劑的阿奇霉素注射劑的雜質(zhì)含量明顯偏高，部分樣品中的雜質(zhì)總量高達(dá)10%20%，提示科學(xué)評(píng)價(jià)國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上含不同酸根的阿奇霉素注射劑劑型的合理性勢(shì)在必行?！?參考文獻(xiàn) 】 1 Khedv A, Sheha M. Quantitative ThinLayer Chromatographic method of analysis of azith