RapiGest SF表面活性劑：用于溶液中酶蛋白消 - 我

1、RapiGest SF試劑：促進溶液中蛋白酶解的有利工具Ying Qing Yu與Martin Gilar美國馬薩諸塞州米爾福德沃特世公司簡介本應用紀要中，我們介紹了沃特世專利RapiGest SF試劑的物理化學性質及其應用領域。2002年，我們首次推出RapiGest SF，這一創(chuàng)新產品是幫助酶消解的有利工具，可促進溶液中蛋白的消解，它能夠改善樣品制備過程中蛋白的溶解度。RapiGest SF提高酶解速率與完全程度的機理詳見圖1。溫和的蛋白變性可打開蛋白結構并暴露酶切位點，以供酶切。在RapiGest SF溶液中，酶對變性的耐受性優(yōu)于普通蛋白，并能保持活性。在加入酶之前高溫加熱RapiGes

2、t SF溶液可使球蛋白更為完全變性，之后需將酶與樣品一起進行37 C的孵育。1,2超過200多家行業(yè)內雜志引用了使用RapiGest SF進行樣品溶解的案例，大部分為蛋白組學的應用。最近，許多制藥實驗室使用RapiGest SF用于蛋白藥物的確證。因為酶消化的速度的提高并在LC、MS分析前極易清除，RapiGest SF已被多個應用領域廣泛接受，其中包括高級序列研究的LC/UV/MS蛋白藥物的肽圖分析。討論什么是RapiGest SF?RapiGest SF是酸性不穩(wěn)定表面活性劑，在酸性條件下極易水解。1這種獨特的性質，在需要的時候，可用于從溶液中清除表面活性劑。RapiGest SF的結構及

3、其水解副產物見圖2。酸性不穩(wěn)定的性質可在pH2條件下，45分鐘內達到完全降解。1該表面活性劑可降解為兩個產物：dodeca-2-one和3-（2,3-二羥基丙基）丙磺酸鈉。前者與水不能互溶，可通過離心清除。后者在水溶液中溶解度很高，而在反相LC模式下不保留。酶消解后的水溶液可直接進行HPLC、LC/MS或MALDI-TOF MS進行分析。消解后的清除樣品分析前無需額外去清除表面活性劑（如透析）。在分析前，酶消解后通常經過酸（如甲酸、三氟乙酸（TFA）或鹽酸（HCl）的酸化，降解RapiGest SF。建議降解條件pH 2。胰蛋白酶消解的兼容性胰蛋白酶是最常見的蛋白水解酶，可用于肽圖分析和蛋白組

4、學的應用。我們研究了在添加RapiGest SF的情況下胰蛋白酶的活性作用，并與文獻中最常見的變性劑的作用做了對比。本檢測基于胰蛋白酶誘導N-苯甲酰-L-精氨酸乙基乙酯（BAEE）在50 mM重碳酸胺（pH 7.9）中的室溫水解。胰蛋白酶活性的變化通過UV 253 nm下測量BAEE水解率進行計算。在選擇的變性溶液中，胰蛋白酶活性與對照樣品進行對比（非變性劑）。結果見于表1。表1中的數據說明低濃度下（0.1%） RapiGest SF不抑制胰蛋白酶的活性。這與結構上類似的表面活性劑SDS不同，SDS是很強的變性劑，可會使胰蛋白酶失活。尿素、乙腈或鹽酸胍也是胰蛋白酶消化的變性劑。但是乙腈是強洗脫

5、劑會干擾消解樣品進行反相LC分析。正如我們所知，尿素可使蛋白共價修飾，鹽酸胍也和SDS一樣可以使酶失活。本實驗說明蛋白酶的活性受到蛋白溶液中所用變性劑的影響。RapiGest SF在從低到高的濃度下均不改變酶活性，因此，最佳的蛋白消解條件是無需過量酶即可達到酶解的結果?？焖俚鞍紫鈱Φ鞍酌附獯嬖诳剐缘牡鞍资褂肦apiGest SF試劑，可在數分鐘內消解完全。完全消解球蛋白、馬肌紅蛋白只需要5分鐘內即可完成。該試劑輔助的消解結果與對照見圖3。由于肌紅蛋白是球蛋白，眾所周知，若沒有表面活性劑將難以消解。在對照反應中，與胰蛋白酶孵育9小時后只有少量的蛋白可以消化。使用了RapiGest SF試劑，總

6、體的消解的效率顯著提升。在蛋白藥物肽圖中的序列覆蓋范圍更大RapiGest SF在蛋白組學的樣品前處理中廣泛使用，是有效的蛋白溶解變性劑。最近越來越多的生物制藥實驗室在肽圖分析中采用了RapiGest SF。一些發(fā)表的論文記錄了使用RapiGest SF進行蛋白藥物消解的優(yōu)勢。4,5經報導的RapiGest SF濃度范圍為0.05 -1%，取決于蛋白疏水性與濃度。我們發(fā)現(xiàn)濃度范圍為0.05 -1%的RapiGest SF足以使各種大小的蛋白變性，高濃度RapiGest SF適合全細胞蛋白提取的實驗。單抗（mAbs）肽圖分析一直以來都因為難以消解這些大疏水蛋白而難以實現(xiàn)。肽圖分析的目的是確認蛋白

7、序列并發(fā)現(xiàn)所有存在后翻譯修飾（PTMs）的蛋白。圖4舉例說明了RapiGest SF輔助的人單抗消解的實例。樣品制備與分析的參數以UPLC和四級桿Tof質譜分析的參數已列表作為指導。圖4顯示實驗中總序列覆蓋率為98%。數據分析通過BiopharmaLynx v.1.2軟件得到。高序列覆蓋率（98%）說明單抗完全消解。LC/MS分析中沒有發(fā)現(xiàn)錯誤酶切的多肽或完整未被酶切的蛋白。剩下的2%未確認的序列為少數二個氨基酸的肽或單個氨基酸（R或K），而無法在反相柱上保留。樣品制備人單抗樣品（10 L, 21 mg/mL）在含有0.1% （w/v） RapiGest SF 的50 L 50 mM重碳酸銨中

8、溶解。將2 L 0.1 M的二流蘇糖醇（DTT）加入樣品，樣品在50 C加熱30分鐘，加入4 L 0.1 M的碘代乙酰胺，在樣品冷卻至室溫后樣品在黑暗中靜至40分鐘。人化單抗IgG多肽圖譜蛋白序列覆蓋率= 98%樣品中加入8 g胰蛋白酶（胰蛋白酶濃度= 1 g/L），樣品在37 C孵育過夜。消解樣品與1%甲酸與10%乙腈混合（1：1，v：v）。用Milli-Q水（Millipore）稀釋至5 pmol/L后進行LC/MS分析。LC 條件LC 系統(tǒng)：沃特世 ACQUITY UPLC系統(tǒng)色譜柱：ACQUITY UPLC BEH 300 C18 肽分離專用柱, 2.1 x 100mm （P/N =

9、186003686）柱溫：40 C樣品進樣：2 L （10 pmol）溶液A：0.1% 甲酸水溶液溶液B：0.1% 甲酸乙腈溶液流速：200 L/min梯度：0-2分鐘:2%B2 92分鐘：2 -35% B92 -102分鐘：35 - 50% B102.1 -105 分鐘：90% B105.1-110分鐘：2% BMS條件MS系統(tǒng)：沃特世SYNAPT MS （V型）毛細管電壓：3.2 kV源溫度.：120 C去溶劑溫度.：350 C去溶劑氣：700 L/hrMS 掃描速率：1 秒/次鎖定質量通道：100 fmol/L Glu-Fib多肽（m/z 785.8426, z = 2），流速20 L/

10、min與其他的蛋白酶合用我們測試了RapiGest SF與多種蛋白酶的適配性，如Asp-N, Lys-C與Glu-C。在酶解前使用RapiGest SF變性蛋白獲得了有效的消解結果。蛋白去糖基化的用途RapiGest SF也用于測試其它酶，如PNGase F，該酶用于酶切糖蛋白N-連接的糖基。2圖6說明了去糖基化雞蛋卵清蛋白。在RapiGest SF介質中PNGase F消解2小時后觀察到了完全的去糖基化反應。結論nRapiGest SF促進了蛋白酶解的速度與完全程度，能夠得到蛋白藥物序列覆蓋率很高的肽圖分析。nRapiGest SF是適用于蛋白組學、糖蛋白與生物制藥應用的領域n幾乎無需消解后

11、樣品處理，簡單樣品酸化，足以從溶液中去除RapiGest SF。多種情況下LC/MS分析前只需簡單稀釋。n RapiGest SF簡化了樣品制備方法，可提高分析通量；使用該方法提高實驗室工作效率并提高數據質量。參考文獻1. Yu YQ, Gilar M, Lee PJ, Bouvier ES, Gebler JC. Enzyme-friendly, mass spectrom- etry-compatible surfactant for in-solution enzymatic digestion of proteins. Anal.Chem. 2003; 75: 6023-6028.2.

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