牙周炎患者牙齦組織中ET和NO改變與局部骨吸收的研究

1、    牙周炎患者牙齦組織中ET和NO改變 與局部骨吸收的研究        摘要目的為了探討慢性牙周炎患者牙齦組織中ET和NO的改變與局部頜骨的吸收及骨質(zhì)疏松的關(guān)系。方法本研究對(duì)20例正常人及20例慢性牙周炎患者應(yīng)用組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)、頜骨X線曲面斷層片象等方法對(duì)各牙齦組織中免疫活性物質(zhì)內(nèi)皮素(ET)和一氧化氮(NO)及相應(yīng)頜骨X線曲面斷層片的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行定量的象分析。結(jié)果顯示慢性牙周炎患者牙齦組織中ET含量明顯升高，頜骨密度減低，牙槽骨水平吸收顯著。結(jié)論研究

2、結(jié)果提示，慢性牙周炎時(shí)牙齦組織中ET和NO的改變與局部頜骨的吸收及骨質(zhì)疏松有密切的關(guān)系。關(guān)鍵詞牙周炎一氧化氮內(nèi)皮素骨質(zhì)疏松 Changes of endothelin and nitric oxide in gintival tissue of periodontiticpatients and their relationshipwith local bone absorptionChen Shizhang, Song Ziyuan and Wang YueBeijing Stomatological Hospital, Capital University of Medical Scien

3、ces, Beijing 100050,China.Abstract Objective To study the changes of endothelin(ET) and nitric oxide (NO) in gingival tissue of periodontitic patients and their relationship with local bone absorption.Methods NO and ET in 20 patients with chronic periodontitis and 20 healthy subjects as controls wer

4、e assayed by immunohistochemical and histochemical staining methods, and pantomograms of jaws to observe the relationship with chronic periodontitis.Results Quantitative analysis of these results by Qumat 970 showed that NO and ET in periodontitis tissue increased significantly(P<0.01), particula

5、rly the content of ET in comparison with healthy subjects. In addition, the bone mineral density(BMD) of jaws was reduced and absorption of alveolar bone was prominenct.Conclusion The levels of NO and ET increase significanty in periodontitic tissue which is closely associated with local jaw absorpt

6、ion and osteoporosis.Key words Periodontitis Nitric oxide Endothelin Osteoporosis慢性牙周炎是以牙周支持組織進(jìn)行性損傷為特征的一種口腔疾患，它的主要臨床特點(diǎn)是牙齦組織的充血、水腫、糜爛、牙槽骨進(jìn)行性的水平吸收從而導(dǎo)致牙體松動(dòng)直至脫失。由于目前尚無(wú)理想的治療方法故給患者帶來(lái)了極大的痛苦。牙周炎的最初表現(xiàn)階段是牙齦組織反復(fù)發(fā)作的炎性改變，進(jìn)而發(fā)展為結(jié)締組織損傷及骨質(zhì)破壞。最近研究表明存在與人體中的免疫活性物質(zhì)在發(fā)揮生理功能抗御感染起著重要的作用1。大量研究證實(shí)，ET和NO介導(dǎo)許多生理作用并涉及病理改變2，我們擬通過(guò)本項(xiàng)

7、研究揭示牙周炎患者牙齦組織中ET和NO的改變與局部骨質(zhì)損傷的關(guān)系。1材料和方法1.1標(biāo)本取自20例翻瓣手術(shù)的中度慢性牙周炎患者的牙齦組織，臨床標(biāo)準(zhǔn)為：牙齦組織充血水腫，彩點(diǎn)消失。牙周袋深度35 m。牙槽骨吸收達(dá)根長(zhǎng)1/2左右。牙齒松動(dòng)左右。另用20例阻生齒拔牙術(shù)后切取的牙齦組織做為對(duì)照。切除后的組織立即置于4%多聚甲醛內(nèi)含0.2% 0.1 mol/L苦葉酸的0.1 mol/L PB(pH7.4)固定劑中固定24小時(shí)，繼之浸于30%蔗糖液中直至沉底，然后冷凍切片，(片厚50 m)進(jìn)行組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)游離切片染色。1.2組織化學(xué)染色：游離切片NADPH-d染色步驟如下：切片于0.1 mol/

8、L Tris-HCl(pH7.6)緩沖液漂洗，然后在下列孵育液中孵育12小時(shí)(37)：0.1 mol/L Tris-Hcl(pH7.6)；NBT 0.25 mg/ml; NADPH 1 mg/ml內(nèi)含0.3% TX-100。不時(shí)于顯微鏡下觀察，染色適度時(shí)切片置于0.1 mol/L PBS中終止反應(yīng)。如需要時(shí)用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。最后切片貼附于覆有鉻明礬-明膠膜載玻片上，空氣干燥中，經(jīng)逐級(jí)酒精(70%100%)脫水，二甲苯透明，封片。1.3免疫組織化學(xué)染色：應(yīng)用SABC方法。切片經(jīng)0.1 mol/L PBS(3×5分鐘)，然后在0.3% H2O2孵育30分鐘阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，繼用10

9、%正常羊血清處理1小時(shí)。切片直接滴加一抗孵育4872小時(shí)，一抗滴度為ET(1200)。切片再進(jìn)入生物素標(biāo)記羊抗免IgG(1200)孵育1小時(shí)及卵白素-生物素復(fù)合物(ABC 1100)孵育12小時(shí)，用0.05% DAB和0.01% H2O2進(jìn)行顯色。最后切片貼附于覆有鉻明礬-明膠膜載玻片上，甲基綠復(fù)染細(xì)胞核，空氣干燥后，經(jīng)逐級(jí)酒精(70%100%)脫水，二甲苯透明，封片。每步驟均需經(jīng)常攪動(dòng)同時(shí)各步驟之間用含有0.5% TX-100，0.01 mol/L PBS(pH7.4)漂洗。全部樣品隨機(jī)各取一片用Quantimet 970象分析并做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。1.4采用：意大利產(chǎn)rotograph-230曲

10、面斷層X(jué)線攝像機(jī)在相同條件下對(duì)正常人及受檢牙周炎患者進(jìn)行上、下頜骨曲面斷層拍攝自動(dòng)沖洗。2結(jié)果2.1正常牙齦組織：鏡下見(jiàn)小血管及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞ET呈陽(yáng)性反應(yīng)(1)NOS染色與ET染色結(jié)果相似(2)，間質(zhì)中可見(jiàn)NADPH-d陽(yáng)性反應(yīng)神經(jīng)纖維，大多呈串珠樣，有處見(jiàn)串珠樣神經(jīng)終末與毛細(xì)血管相連接。血管周圍亦可見(jiàn)纖維的NADPH-d神經(jīng)纖維，有著與血管并行或包繞血管。1血管及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞呈NADPH-d陽(yáng)性反應(yīng)(×100)2小血管內(nèi)皮細(xì)胞ET免疫組織化學(xué)染色呈陽(yáng)性反應(yīng)(×600)2.2慢性牙周炎牙齦組織：鏡下見(jiàn)牙齦表皮增生，間質(zhì)中毛細(xì)血管也明顯增生及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。血管內(nèi)皮細(xì)胞

11、ET及NADPH-d均深染。慢性牙周炎時(shí)除血管內(nèi)皮細(xì)胞ET免疫組織化學(xué)染色呈深染外，血管周圍的漿細(xì)胞也顯ET陽(yáng)性反應(yīng)(3)。間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量深染的NADPH-d串珠樣神經(jīng)纖維(4)。經(jīng)Quantimet 970象分析后和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果表明牙周炎患者NO及ET含量較正常者升高，尤以ET水平升高顯著(5)。3牙周炎時(shí)除內(nèi)皮細(xì)胞ET陽(yáng)性反應(yīng)外，血管周圍的漿細(xì)胞也呈陽(yáng)性反應(yīng)(×660)4牙周炎時(shí)在間質(zhì)組織中可見(jiàn)許多NADPH-d深染的串珠樣神經(jīng)纖維(×800)5牙周炎患者NO及ET含量*患者組ET平均吸光度為0.856788，較常人組0.138981顯著增高(P<0.01)?*

12、患者組NOS平均吸光度為0.180854，較常人組0.102266顯著增高(P<0.01)2.3頜骨X線曲面斷層片顯示：與正常人頜骨片比較慢性牙周炎時(shí)，牙槽骨嵴水平吸收明顯，骨小梁密度減低，下頜骨體部骨松質(zhì)出現(xiàn)明顯透明光區(qū)，哈氏管擴(kuò)大，經(jīng)象分析后結(jié)果證實(shí)慢性牙周炎患者頜骨骨質(zhì)疏松明顯(6)。6病變時(shí)頜骨X線曲面斷片示牙槽骨吸收骨質(zhì)疏松3討論隨著分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及放射免疫微量測(cè)定技術(shù)的發(fā)展，人體中許多免疫活性物質(zhì)不斷被發(fā)現(xiàn)并證實(shí)這些免疫活性物質(zhì)不僅具有調(diào)控微血管通透性和局部血流的功能，同時(shí)還與抗牙周炎感染也有密切的關(guān)系。一氧化氮(NO)是一個(gè)新型具有多功能的重要細(xì)胞內(nèi)信使3。血管內(nèi)皮

13、細(xì)胞和神經(jīng)元都可以產(chǎn)生NO，研究證實(shí)NO可使血管舒張并維持血管張力。神經(jīng)系統(tǒng)中的NO不僅可作為第一信使作用于自體細(xì)胞，并可作為第二信使對(duì)相鄰周圍的細(xì)胞發(fā)揮作用。研究表明牙齦及牙周組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞存有NOS4。我們的研究顯示牙齦組織中NO不僅來(lái)源于血管的內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)牙齦間質(zhì)中神經(jīng)纖維也釋放NO。慢性牙周炎時(shí)不但有小血管大量增生，間質(zhì)中的神經(jīng)纖維也較正常人豐富，顯示NO水平略高于正常人。內(nèi)皮素(ET)也是由內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一種21氨基酸多肽，通過(guò)自分泌，旁分泌機(jī)制在組織中起類似神經(jīng)介質(zhì)發(fā)揮多功能調(diào)節(jié)肽作用，是目前已知作用最強(qiáng)的血管收縮肽。尤其在調(diào)控血管張力方面更為重要，所以是一種強(qiáng)的血管收縮因子

14、5。本研究發(fā)現(xiàn)慢性牙周炎牙齦組織中ET的表達(dá)明顯高于正常人，有關(guān)ET及NO的合成生物學(xué)效應(yīng)間相互作用關(guān)系的研究提示NO對(duì)ET雖有抑制作用，但這種抑制作用一旦破壞，ET釋放量會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出生理水平，所以NO和ET兩者之間的平衡狀態(tài)是血液動(dòng)力學(xué)變化的重要因素。牙周炎過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn)NO含量雖高于正常人，但ET含量顯著高于NO。我們觀察到牙周炎時(shí)組織中NO含量相應(yīng)增高可能與炎癥時(shí)血管動(dòng)力學(xué)改變及血管損傷有關(guān)，是一種機(jī)體保護(hù)性反應(yīng)，但由于炎癥持續(xù)反復(fù)，NO水平遠(yuǎn)低于ET水平，從而破壞了原有正常的NO與ET間的生理平衡狀態(tài)，顯示為ET損害的病理形態(tài)學(xué)改變。牙周支持組織主要包括牙齦，牙周膜和牙槽骨。牙齦有保護(hù)牙

15、齒，牙周膜和牙槽骨的作用。牙周膜是介于牙體和牙槽骨之間的致密結(jié)締組織。牙槽骨是頜骨的突起部分，是支持牙齒的主要結(jié)構(gòu)，使牙齒能固定于頜骨上承擔(dān)咀嚼功能。牙槽骨在圍繞牙根周圍為薄層密度骨板，有許多小孔血管和神經(jīng)與牙周結(jié)締組織相通。頜骨則由骨松質(zhì)組成，有骨小梁，骨髓腔組成，牙周組織的血運(yùn)主要來(lái)自牙槽動(dòng)脈分支到牙槽骨，牙齦和牙周膜6。局部血管功能的正常是保證組織間物質(zhì)交換的基本條件和組織發(fā)揮正常生理功能的前提。已有研究表明，牙周組織中基膜及彈力系統(tǒng)纖維的病理改變?cè)斐闪司植垦軗p傷而使局部牙齦組織的防御屏障破壞結(jié)締組織受損，是導(dǎo)致慢性牙周炎發(fā)生的原因之一7。本研究的結(jié)果也證實(shí)由于牙齦組織中免疫活性物質(zhì)的

16、改變而導(dǎo)致血管調(diào)節(jié)功能失控，使局部血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變，我們認(rèn)為由于長(zhǎng)期的血流病理學(xué)改變，造成局部牙槽骨組織的相對(duì)血流量下降，阻礙了正常的組織間物質(zhì)交換和營(yíng)養(yǎng)供給，造成局部骨代謝失調(diào)，加之長(zhǎng)期來(lái)自相鄰牙齦組織的炎性刺激使牙槽骨水平吸收，頜骨的骨小梁減少，骨質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松明顯。本研究通過(guò)組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)染色觀察的結(jié)果表明在正常牙齦組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)纖維內(nèi)含有NO，ET免疫活性物質(zhì)。NO和ET的釋放均較正常人增加，尤以ET釋放遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常人，導(dǎo)致局部血管強(qiáng)烈收縮，從而使得血液供給不足，影響了牙周組織活力，促使組織受損而成為一種內(nèi)源性致病因素，刺激了局部的骨組織而發(fā)生骨吸收及骨疏松的病理改變，

17、提示NO和ET可能不僅與牙周炎密切相關(guān)而且在慢性牙周炎時(shí)對(duì)阻礙正常的骨代謝起著重要作用。作者簡(jiǎn)介：陳世璋，1957年6月出生，現(xiàn)任首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院副主任醫(yī)師，副教授。1990年起從事慢性牙周炎病因?qū)W及局部頜骨損傷機(jī)理的系統(tǒng)性研究。在國(guó)家一級(jí)雜志發(fā)表論文十余篇，其中兩項(xiàng)研究：慢性牙周炎患者牙周組織中基膜及彈性系統(tǒng)纖維的病理改變及正常人與慢性牙周炎患者牙齦在組織中免疫活性物質(zhì)的觀察分別于1994年及1998年兩次獲北京市科學(xué)技術(shù)成果獎(jiǎng)。作者單位：100050北京首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院(陳世璋、宋子元)；北京中日友好醫(yī)院病理科(王躍)參考文獻(xiàn)1Kerezoudis NP, Olga

18、rt L, Edwall L. Evans blue extravasation in ret dental pulp and oral tissues induces by electrical stimulation of the inferior alveolar nerve. Arch Oral Biol, 1993a,38:893-901.2Salvador Moricada, Annine Higgs. The L-Arginine Nitric oxide pathway. New E J Med, 1993,2002-2012.3Dawson TM, Dawson VL, Snyd